Summary
Her beskriver vi en optimalisert, Langendorff-baserte prosedyre for isolering av encellede atrial cardiomyocytes fra en rotte modell av Metabolsk syndrom-relaterte hjertesvikt med bevarte utstøting brøkdel. En manuell regulering av intraluminal presset av cardiac hulrom er gjennomført for å gi funksjonelt intakt myocytter egnet for eksitasjon-sammentrekning-kopling studier.
Abstract
I denne artikkelen beskriver vi en optimalisert, Langendorff-baserte prosedyre for isolering av encellede atrial cardiomyocytes (ACMs) fra en rotte modell av Metabolsk syndrom (MetS)-relaterte hjertesvikt med bevarte utstøting brøkdel (HFpEF). Utbredelsen av MetS-relaterte HFpEF stiger, og atrial cardiomyopathies forbundet med atrial remodeling og atrieflimmer er klinisk svært relevante atrial remodeling er en uavhengig prediktor for dødelighet. Studier med isolert encellede cardiomyocytes brukes ofte til å bekrefte og utfyller i vivo funn. Sirkulasjons fartøy rarefication og interstitielle vevet fibrose utgjør en potensielt begrensende faktor for vellykket encellede isolering av ACMs fra dyr modeller av denne sykdommen.
Vi har adressert dette problemet ved å bruke en enhet i stand til å manuelt regulere intraluminal trykket av cardiac hulrom under isolasjon prosedyren, vesentlig øke avkastningen av morphologically og funksjonelt intakt ACMs. Ervervet cellene kan brukes i en rekke forskjellige eksperimenter, som cellekultur og funksjonell kalsium imaging (dvs., eksitasjon-sammentrekning-kobling).
Vi gir en trinnvis protokoll, en liste over Optimaliserte løsninger, nøyaktige instruksjoner å forberede nødvendig utstyr og en omfattende feilsøkingsguiden forskeren. Mens den første implementeringen av prosedyren kan være ganske vanskelig, la en vellykket tilpasning leseren til å utføre state-of-the-art ACM isolasjoner i en rotte modell av MetS-relaterte HFpEF for et bredt spekter av eksperimenter.
Introduction
MetS beskriver en klynge av risikofaktorer for diabetes mellitus type 2 og hjerte-og karsykdommer og inkluderer en økt arterial blodtrykket, dyslipidemi (hevet triglyserider og senket high-density lipoprotein kolesterol), økte faste glukose og sentral fedme1. Verdensomspennende utbredelsen av MetS er anslått til 25-30% og stadig stigende2. HFpEF er et heterogene klinisk syndrom ofte assosiert med MetS. Cardiac remodeling under HFpEF og foregående faser (dvs., Hypertensiv hjertesykdom) er også ledsaget av en ombygging av atria3. Redusert kontraktile funksjon og strukturelle endringer av venstre atrium har vært assosiert med økt dødelighet og atrieflimmer nye hjertesvikt4. Atrial remodeling er preget av endringer i kanalen Ionefunksjonen, Ca2 + homeostase, atrial strukturen, fibroblast aktivisering og vev fibrose5. Venstre atrial remodeling i MetS-relaterte HFpEF og dens underliggende patologisk mekanismer er fremdeles dårlig forstått og krever en mer dyptgående undersøkelse. Dyremodeller har vist seg å være et verdifullt verktøy og føre til mange fremskritt innen atrial cardiomyopathies6,7,8,9.
Studier med isolert encellede cardiomyocytes brukes ofte til å bekrefte og utfyller i vivo funn. En og den potensielle påfølgende cellekultur, tillater etterforskningen signalnettverk trasé ioniske kanal strømninger og eksitasjon-sammentrekning-kobling. Under fysiologiske forhold, cardiomyocytes ikke sprer. Fusjonen mellom transcriptional regulatoriske sekvenser av en atrial natriuretic faktor og en simian virus 40 store T antigen hos transgene mus førte til etableringen av de første udødeliggjort ACMs, navnet på-1-10. Videre utvikling av AT-1 celler ga opphav til HL-1 celler, som ikke bare være serielt passaged men også kontrakt spontant11. De gjøre, men viser strukturelle og funksjonelle forskjeller sammenlignet med fersk isolert celler, for eksempel en mindre organisert ultrastructure, en høy forekomst av utvikle myofibrils11og en hyperpolarization-aktivert innover gjeldende12. Isolasjon av ventrikkel cardiomyocytes (VCM) i rotter og mus fra en rekke modeller er godt etablert13,,14,,15,,16,,17,,18 , 19. vanligvis forbrukeravgift hjertet er montert til en Langendorff apparater og retrogradely parfyme med en Ca2 +-gratis bufferen som inneholder fordøyelsesenzymer, som collagenases og proteaser. Kalsium er deretter gjeninnføres på en gradvis måte fysiologiske forhold. Men selv om protokollene dedikert til isolering av ACMs er tilgjengelig20,21, økt fibrose og trykk forskjeller, er nytten i sykdom modeller med atrial remodeling begrenset.
I denne artikkelen har vi implementert en protokoll for isolering av atrial encellede cardiomyocytes fra dyr som viser atrial remodeling (dvs., særlig for ZFS1 rotte modell for MetS-relaterte HFpEF)22. Eksisterende isolasjon protokoller var optimalisert og supplert med en enkel, skreddersydde enhet å kontrollere og endre intraluminal trykket av cardiac hulrom, fører til høyere avkastning av morphologically og funksjonelt intakt cardiomyocytes. Følgende protokollen gir forsker med trinnvise instruksjoner, en detaljert beskrivelse av skreddersydde utstyret, en liste over løsninger, samt en omfattende feilsøkingsguiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentene ble godkjent av den lokale etikk (TVA T0060/15 og T0003-15) og utført med retningslinjene og bruk av forsøksdyr (National Institute of Health, U.S.A.).
Merk: Et forenklet flytskjema på prosedyren er vist i figur 1.
1. ikke har forhåndsinnstillingene fra
- Forberede bufferne etter tabell 1.
| Løsning | PB | CB | DB | SB | S1 | S2 | S3 | NT | |
| Reagens (mM) | |||||||||
| NaCl | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | |
| KCl | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4 | |
| KH2PO4 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | ||
| Na2HPO4 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | ||
| MgSO4 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | ||
| MgCl | 1 | ||||||||
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
| Taurin | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | ||
| Glukose | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| BDM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| CaCl2 | 1 | 0,01 | 0.125 | 0,25 | 0,5 | 1 | |||
| BSA | 150 | 70 | 70 | 70 | |||||
| Renset enzym blanding (middels Thermolysin) | 0,195 Wünsch enheter/mL | ||||||||
| pH tilpasset | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | |
| pH justeres ved | 37 ° C | 4 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | |
| pH justert med | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH |
Tabell 1: liste over buffere. PB: perfusjon buffer, som kan lagres i 3 dager på 4 ° C (300 mL per dyr). CB: cannulation buffer, som kan lagres i 3 dager på 4 ° C (200 mL per dyr). DB: fordøyelse buffer, som må brukes innen dagen (40 mL per dyr). SB: stoppe buffer, som må brukes innen dagen (2 mL per dyr). S1: Trinn 1 buffer, som må brukes innen dagen (2 mL per dyr). S2: Trinn 2 buffer, som må brukes innen dagen (2 mL per dyr). S3: Trinn 3 buffer, som må brukes innen dagen (2 mL per dyr). NT: normal Tyrode, som brukes i dag (50 mL per dyr).
-
Forberede Langendorff apparatet (figur 2A).
- Tømme systemet med 100 mL av 70% etanol, etterfulgt av 2 flush 100 mL destillert vann. Fylle systemet med 200 mL perfusjon buffer (PB).
- Angi inntakets peristaltiske pumpen til 3 mL/min.
- Kalibrere temperaturen på PB forlater Langendorff apparatet til 39 ° C.
- Plasser den skreddersydd kanyle [16 G, 25 mm lang, skarp tips fjernet (figur 3A)] på Langendorff apparatet og starte strømmen. Slå på modulen oppvarming og justere verdien for oppvarming å nå ønsket temperatur på PB på spissen av kanyle. Når temperaturen kalibreringen er fullført, flytte den skreddersydd kanyle til sprøyten brukes til cannulation (figur 2B).
- Klargjør trykk kontroll enheten (Figur 3 c) ved Langendorff systemet. Montere sommerfugl nålen på stativ klemmen og forberede 3 blokkerer knop.
Merk: Collagenase enzym aktivitet varierer med temperatur. En temperatur overvåking av venstre atrium, i tillegg til en dynamisk justering, kreves senere i prosedyren.
- Sette opp utstyret for orgel excision og cannulation i henhold til figur 2B. Fyll opp kanne, sprøyten og Petriskål med en iskald cannulation buffer (CB) og forberede cannulation knuter.
-
Heparinize rotte med 500 IE heparin per 100 g rottas kroppsvekt som følger.
- Sett 2 mL 100% isoflurane i en bedøvelse induksjon kammer egnet for gnagere. Overføre 21 uke gamle ZFS-1 overvektige rotta fra buret til induksjon kammeret. Tillate rotta å angi dype anestesi, angitt av en avtagende pust halvparten av sin opprinnelige frekvens.
- Fjern rotta fra induksjon kammeret. Injisere 500 IE heparin per 100 g rottas kroppsvekt i peritoneum bruker en heparin sprøyte.
- Tilbake rotta i buret sitt og at å våkne.
Merk: Det er ikke nødvendig for å opprettholde sterilitet under trinn 1.4. Vente 20 minutter før du fortsetter til neste trinn. En ufullstendig anticoagulation kan forårsake blodpropp, fører til mikro-infarkt, som kan betydelig påvirke kvalitet og dekkevne på isolerte cardiomyocytes.
2. hjertet forberedelse
- Sett 2 mL 100% isoflurane i en bedøvelse induksjon kammer egnet for gnagere. Overføre 21 uke gamle ZFS-1 overvektige rotta fra buret til induksjon kammeret. Tillate rotta å angi dype anestesi, angitt av en avtagende pust halvparten av sin opprinnelige frekvens.
- Euthanize dyret ved halshogging bruker en guillotine egnet for gnagere. Fixate lemmer av rotta på polystyren skum underlag. Løft og fjern huden dekke xiphoid prosessen med kirurgisk saks. Åpne peritoneum under rib bur på begge sider og utsette mellomgulvet.
- Åpne membranen ved et snitt langs den fremre bue med fine saks. Skjære gjennom ribbeina på begge sider langs linea mediaclavicularis til kravebenet benet, med kirurgisk saks, for å avsløre brysthulen i situ.
- Fjerne lungene på distale ender flyttet med fine saks. Kuttet ut thymus å avsløre aortabuen.
- Knip bunnen av hjertet ved hjelp av pinsett og trekk forsiktig mot halen av dyret. Kuttet over aorta samtidig opprettholde et trekk på hjertet, forlate en 5 mm lang del av aorta knyttet til hjertet. Raskt overføre hjertet til 50 mL iskald CB i 50 ml begeret (figur 2B).
Merk: I trinnene 2.5-3.3, er hjertet effektivt i iskemiske tilstander. Unngå å overskride totalt 3 min hvis disse trinnene ikke å skade cardiomyocytes.
3. cannulation
- Vent ca 10 s for hjertet å kjøle ned og gripe sammentrekninger. Overføre hjertet i en Petriskål inneholder 50 mL av friske, iskalde CB. Fjern forsiktig i fatty vevet rundt aorta ved hjelp av tang og saks.
- Sett inn den spesiallagde kanyle (samme som brukes i trinnet 1.2.3), som er festet til 10 mL sprøyte fylt med iskald CB, 3 mm aorta. Fixate aorta på kanyle ved å binde en av to cannulation knuter (figur 3B) i innrykket proksimale til spissen av kanyle.
Merk: Vær forsiktig med å skade aortic ventilen ved en penetrasjon med kanyle. - Forsiktig flush aorta med 5 mL iskald CB bruker sprøyten festet til kanyle til ingen mer blod er synlig i koronar arteriene. Forsiktig massasje venstre atrium ved hjelp av pinsett og injisere de resterende 5 mL av CB, slik at eventuelle overskytende blod fjernes fra hulrommet i Petriskål.
- Knytte andre cannulation knute (Sutur: USP 3/0, silke) i innrykket distale til spissen av kanyle. Demontere kanyle med vedlagte hjertet fra sprøyten. Montere kanyle med vedlagte hjertet å Langendorff bruke en lempelig adapter.
Merk: Denne protokollen bruker forhøyet trykk i ventrikkel hulrom under steder Langendorff apparatet. Ytterligere cannulation knuten er nødvendig for å opprettholde dette presset ved å unngå eventuell anterograd buffer lekkasje gjennom aorta.
4. Trykk manipulasjon og fordøyelse
- Starte peristaltiske pumpen av Langendorff apparater å starte perfusjon av hjerte vev med PB. Tre doble halvstikk (Sutur: USP 3/0, silke) rundt foten av hjertet, unntatt aorta. Gjenta dette trinnet til inflasjonen av høyre og venstre atrium, samt koronar sinus, er merket.
- Punktering atriet med sommerfugl nålen presset kontroll enheten (figur 3D) og la atrium for tømming. Manipulere intraluminal trykket av atrium ved å justere høyden av sommerfugl slangen. Holde atrium litt oppblåst gjennom resten av prosedyren; overvåke og justere deretter.
Merk: Dette trinnet må utføres raskt, som en langvarig inflasjon av venstre atrium vil resultere i cardiomyocyte død. - Måle omtrentlig temperaturen på venstre atrium ved å plassere en temperatur probe mellom venstre ventrikkel og venstre atrium. Justere temperaturen på Langendorff oppvarming modul tilsvarende, målretting en omtrentlig temperatur på 37 ° C over venstre atrium.
- Perfuse hjertet med PB totalt 3 min.
- Bytte av perfusjon en fordøyelsen buffer (DB) i ca 14 – 18 min.
Merk: Fordøyelsen er fullført når venstre atrial strukturen kollapser og vevet kjøper en melkeaktig tekstur. - Knip atriet ved hjelp av pinsett og vedta en liten trekk. Fjerne venstre atrium med fine saks og overføre atriet i en stor veiing båt som inneholder 2 mL stoppe buffer (SB), fullt submerging vevet.
- Kast den gjenværende hjerte vev følge retningslinjene i laboratoriet hvor prosedyren utføres.
5. celle behandling og kalsium re tilpasning
- Hakke atrial vevet i små biter av omtrent 2 x 2 mm med fine saks.
- Spre vev av en skånsom og utstøting av vev biter med en overføring pipette. Fortsett med denne fremgangsmåten i ca 5 min til en makroskopisk dissosiasjon av vev kan observeres.
Merk: Unngå noen luftbobler under dette trinnet som utsette cellene til luft vil resultere i cardiomyocyte død. - Overføre cellene til en 15 mL konisk rør. Kan vev biter betale for 30 s. overføring nedbryting inn en annen 15 mL konisk røret. At cellene å bosette seg i 15 min.
- Fjerne og slette nedbryting. Legge til 2 mL trinn 1 buffer (se tabell 1). Tillat cardiomyocytes betale for 10 min.
Merk: Kasserte nedbryting inkluderer også fibroblaster og endotelceller. Se andre protokoller hvis det er ønskelig å bruke disse cellene for eksperimenter14,23. Pellet inneholder hovedsakelig atrial cardiomyocytes, som kan bekreftes av * lys. Mikroskopiske kjennetegner atrial cardiomyocytes diskuteres i trinn 6.1. - Fjerne og slette nedbryting. Legg 2 mL trinn 2 buffer. Tillat cardiomyocytes betale for 10 min.
- Fjerne og slette nedbryting. Legg 2 mL trinn 3 buffer. Tillat cardiomyocytes betale for 10 min.
- Fjerne og slette nedbryting. Legge til 250 µL av normalt Tyrode (NT), som inneholder 1 mM Ca2 +.
- Overføre 50 µL av den normale Tyrode med atrial cardiomyocytes på et glass-bottom rett, som har vært belagt med 25% laminin (og lov til å tørke på forhånd). Tillat cardiomyocytes betale for 10 min.
- Fyll et glass-bottom rett med 500 µL av NT som inneholder 1 mM CaCl2.
6. funksjonell evaluering av eksitasjon-sammentrekning-kobling
- Vurdere celle morfologi og levedyktighet under lys mikroskop med en 20 X forstørrelse (figur 4A og 4B). Tilfeldig velge ca 100 celler og klassifisere dem som levedyktig eller unviable for å anslå levedyktigheten til celle isolasjon prosedyren.
Merk: Levedyktige cellers er preget av symmetrisk sarcomere struktur, fravær av membran blebs og en stang figur. -
Veieceller med Ca2 +-sensitive fluorescerende fargestoff innen 20 min til å fullføre trinn 5.9.
- Legge til 10 µM Fluo4-AM til 500 µL av NT. Fjern nedbryting fra glass-bottom rett (fra trinn 5.9). Legge til NT inneholder Fluo4-AM til glass bunn parabolen. Inkuber blandingen for 20 min ved romtemperatur. Fjerne og slette nedbryting. Vask prøven 2 x bruker 500 µL av NT.
-
Visualisere Ca2 +-eksitasjon med AC confocal mikroskop som følger.
- Overføre glass-bottom rett til AC confocal mikroskop og visualisere Ca2 +-eksitasjon med AC confocal mikroskop (laser intensitet på 5,8%, eksitasjon på 488 nm, utslipp på 515 nm) bruker en 40 X forstørrelse.
- Perfuse cellene med NT oppvarmet til 37 ° C ved hjelp av en passende superfusion enhet. Også holde cellene varme ved hjelp av et mikroskop-montert varme inkubator.
- Stimulere cardiomyocytes i et elektrisk felt med kommersielt tilgjengelige, mikroskop-montert stimulator elektroder på en frekvens på 1 Hz og en elektrisk strøm av 24 A. vente 1 min til at cellene å nå en stabil av Ca2 + håndtering.
- Plass skanning linjen parallelle tverrgående aksen, halvveis mellom kjernen og kanten på en tilfeldig valgt, macroscopically kontraktørselskaper cellen. Erverve linje skanne bilder av repeterende skanning.
- Bruk fritt tilgjengelig programvare for å anslå signal intensiteten umiddelbart før en elektrisk stimulering (F0) over hele cellen. Tegne signal intensiteten over hele cellen i løpet av 1 stimulert syklus (F). Dele (F) (F0) for å få den respektive Ca2 + forbigående.
Figur 1: forenklet flytskjema for isolasjon prosedyren. Fremgangsmåten er svært tid-sensitive til enzymatisk fordøyelsen av myocytter er fullført. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: klargjøring av utstyr før isolasjon. (A) dette panelet viser en Self-Made Langendorff apparater: (1) et jacketed reaksjon fartøy PB; (2) en jacketed reaksjon fartøyet med CB; (3) en 3-veis stopcock; (4) en sprøyte; (5) en peristaltiske pumpen; (6) oppvarming nedsenking; (7) en jacketed boble felle; og (8) kanyle og hjerte. (B) dette panelet viser opplegget for cannulation og orgel excision for en optimalisert arbeidsflyt: (1) en 100 mL kanne med 50 mL av iskalde CB; (2) en 10 mL sprøyte med iskald CB; (3) en Petriskål med iskald CB; (4) en lyskilde; (5) skreddersydd kanyle med en cannulation knop (se også figur 3A og 3B); (6) fine, buede tang; (7) tissue tang; (8) fine tang, vinklet 45°; (9) abdominal kirurgisk saks; (10) fine kirurgisk saks; (11) 4 x 30 G nåler; og (12) en 15 G nål. (C) dette panelet viser mikroskop-montert utstyr for AC confocal avbilding: (1) elektrisk stimulator elektroder; (2) superfusion penn; (3) en glass-bottom rett med ACMs; og (4) midt platina elektrisk stimulator elektroder. (D) dette panelet viser mikroskop opplegget for AC confocal avbilding: (1) AC confocal mikroskopet; (2) superfusion penn; (3) en superfusion buffer reservoaret; (4) en superfusion flyt regulator; (5) en superfusion oppvarming modul; (6) datamaskinen arbeidsstasjon; og (7) en elektrisk stimulator. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: skreddersydd utstyr. (A) dette panelet viser manipulert 15 G kanyle med Luer-lock. Pilene angir to innrykk for cannulation knuter. (B) Dette er cannulation knuter, to doble halvstikk knop plassert oppå hverandre for rask innstramming. Pilene angir hvor og der rekkefølgen knuten må strammes. (C) dette panelet viser samlet press kontrollen enheten. En 21 G sommerfugl nål er koblet til en tripod klemme. Slangen holdes på samme høyde som nålen. Skrukork åpnes. Høyden av sommerfugl slangen kan endres som angis av pilene for å endre intraluminal trykket av venstre atrium. (D) venstre atrium er punktert med press kontrollen enheten. Dette bildet viser et ideelt oppblåst venstre atrium. Ellipsen markerer plasseringen av halvstikk knuten. (E) venstre atrium er punktert med press kontrollen enheten. Dette bildet viser en over oppblåst venstre atrium, som vil resultere i en lavere avkastning av levedyktig ACMs. Ellipsen markerer plasseringen av halvstikk knuten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For 21 ukens av alderen, kan 60-90% av levedyktig ACMs (estimert som beskrevet i trinn 6.1), etter kalsium re tilpasning (trinn 5.4-5.7), være isolert fra ZSF-1 overvektige rotter ved denne metoden (figur 4A). I rotter, er ACMs preget av en annen og mer heterogene fenotypen forhold til VCMs24,25. Figur 4B viser en personlige ACM med bevarte membraner og sarcomere struktur, både sterke indikatorer på en funksjonelt integrert celle.
De ervervet ACMs kan behandles på en rekke måter. Som illustrert i figur 5, kan cellene lastes med fluorescerende fargestoffer brukes til å studere morfologi og/eller funksjon. For eksempel, ble di-8-ANEPPS brukt til å avgrense rørformede systemet i en atrial rotte celle (figur 5A). I et annet sett av eksperimenter, er mitokondrier flekker langt rødt-fluorescens fargestoff (f.eks, mitotracker-rød-FM) ansatt å oppdage cytosolic mitokondrier (figur 5B) i atrial remodeling. Som vist i figur 5C, ACMs isolert med denne protokollen er også egnet for live-celle Ca2 + bildebehandling og vise intakt eksitasjon-sammentrekning kopling med en 1 Hz feltet-stimulering. Alle bilder kan brukes for videre analyse ved hjelp av en rekke algoritmer tilgjengelig til forsker6,7 (figur 5 d).
Figur 4: respektive avkastning av levedyktig, encellede AM. (A) dette panelet viser avkastningen av en isolert etter re tilpasningen av ACMs til 1 mM Ca2 + i NT. (B) dette panelet viser en isolert, én celle atrial cardiomyocyte. Sarcomere strukturen, celle membran og kjernen er klart synlig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: flekker av rotte ACMs med fluorescerende fargestoffer. (A) dette panelet viser den flekker cellemembranen og rørformede nettverk med fluorescerende fargestoff Di8ANNEPS. (B) dette panelet viser den flekker av mitokondrier med den fluorescerende farge mitotracker-rød-FM. (C) dette panelet viser tverrgående linje skanningen av en Ca2 +-eksitasjon med fluorescerende fargestoff Fluo4-AM over en enkeltcelle. Pilene angir elektrisk stimulering, gjennomført ved 1 Hz. (D) dette panelet viser longitudenal Ca2 + transienter avledet fra C-panelet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrevet vi først en protokoll for isolering av encellede ACMs fra en rotte modell av MetS-relaterte HFpEF som viser merket atrial remodeling22. Prosedyren er unikt utfordrende som overdreven fettvev kan gjøre kirurgisk utarbeidelse, i tillegg til cannulation av aorta, stadig vanskeligere. Feilsøkingsinformasjonen gitt i tabell 2 adresser de vanligste problemene av isolasjon prosedyren.
| Problem | Mulig årsak | Løsning |
| Ingen strømme gjennom butterfly slange | Upassende nedleggelse av aorta med cannulation knop | Fjerne fettvev før stramme |
| Legge 3 cannulation knuten med respektive innrykk | ||
| Trekk knuten med hånden for økt styrke | ||
| Blokkerte p | Justere posisjon i lumen | |
| Fjerne blokkeringen av mild trekk med sprøyte | ||
| Høyre atrium / koronar sinus ikke oppblåst | Upassende nedleggelse av hjertet base | Blokkere flyt med ekstra knop |
| Høyre atrium skadet under utarbeidelse | Lukk lekkasje med klipp/knop | |
| Dårlig fordøyelse / atrium ikke mykne | Redusert enzym aktivitet gjennom feil temperatur | Justere temperaturen til 37 ° C |
| Inaktiv/degradert enzym | Erstatt | |
| Gamle/altfor fibrotiske atrium | Øke fordøyelse (i trinn på 50%) | |
| Skadet Aortaklaff | Grunne penetrasjon under cannulation | |
| Dårlig celle avkastning | Atrium over fordøyd | Redusere fordøyelsen tid (i trinn på + 25%) |
| Redusere intraluminal trykk ved å senke sommerfugl slangen | ||
| Atrium under-fordøyd | Øke fordøyelse (i trinn på 25%) | |
| Øke intraluminal press ved å heve sommerfugl slangen | ||
| Celle spredning for aggressiv | Være mer skånsom |
Tabell 2: feilsøkingsveiledning. Denne tabellen viser vanlige problemer på isolasjon prosedyren og deres respektive løsninger.
I en fersk studie, har vi vist at ZFS-1 overvektige rotte modell viser omfattende atrial remodeling med en økt atrial størrelse22. En økning i venstre atrial størrelsen har blitt anerkjent som en viktig prognostiske markør for diastolisk dysfunksjon26 og forårsaker en rarefication av mikrovaskulær fartøyene forhold til vevet. Dette fører til en redusert fordeling av fordøyelseskanal bufferen gjennom retrograd perfusjon av aorta under isolasjon prosedyren, rendering encellede isolasjon i denne modellen spesielt utfordrende. Andre kjennetegn funksjoner atrial remodeling, atrial fibrose og økt fibrose har vist for ZDF rotter-en rotte modell for metabolske diabetes og en forelder stamme av ZFS1 rotter27. Kollagen innskudd svekket effekten av fordøyelsesenzymer å frigjøre cardiomyocytes fra den ekstracellulære matrisen, og derfor krever ytterligere justeringer av cellen isolasjon prosedyren28.
Mekanismen som trykket enheten muliggjør forbedret isolasjon resultatene i denne modellen av atrial remodeling er mest sannsynlig knyttet til en lokalisert demping av koronar blodstrøm av venstre atrium. En stor del av koronar blodstrøm er koronar perfusjon press, som er definert som forløpningen mellom koronar trykket og ende-diastolisk blodtrykk av de respektive hulrom29. Under beskrives prosedyren fører blokkering av hjertet base til en global økning i koronar press og intraluminal presset gjennom hjertet. Den påfølgende punktering av venstre atrium muliggjør en lokal, selektiv dråpe intraluminal press i venstre atrial hulrom. Dermed ikke bare en stor koronar perfusjon trykkgradient er etablert, men perfusjon volumet er også økt med viderekoblet fordøyelsen løsningen fra trafikk venstre ventrikkel venstre atrium.
I tillegg valg av fordøyelsen enzymer er avgjørende for ACM isolasjon: renset enzym blanding av collagenase I og II har vist seg å være overlegen mindre målrettet og mindre ren enzymer som collagenases30. Dette enzymet tillater ikke bare for en høyere avkastning av morphologically og funksjonelt intakt cardiomyocytes men også reduserer noen klumper av enkeltceller etter deres isolasjon31. Renset enzym blander av collagenases med en ekstra høy dispase eller middels thermolysin innhold brukes vanligvis til rotte cardiomyocyte isolasjoner. Mens VCMs er best isolert på høyere konsentrasjoner, beste resultatene av atrial myocytter ble kjøpt med en konsentrasjon av 0.195 Wünsch enheter/mL benytter denne protokollen32.
Utbredelsen av MetS-relaterte HFpEF stiger2 og atrial cardiomyopathies ledende til atrial remodeling og atrial fibrillation er klinisk svært relevant, forskning i dette feltet er av avgjørende interesse. Mange nye dyr modeller for HFpEF dukker33,34 atrial remodeling linje med økt forekomst av atrial rytme lidelser er kjennemerket trekk ved sykdommen. Metoden beskrevet tillater forskere isolere levedyktig enkelt cardiomyocytes fra rotte modeller med atrial remodeling for en videre studier med en usedvanlig høy avkastning og bevart mekaniske og elektriske funksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av DZHK (tysk Centre for hjerte forskning, DB), EKFS (Else-Kröner-Fresenius-Stiftung, F.H.) og BMBF (tysk departementet for utdanning og forskning), samt BIH-Charité klinisk forsker programmet finansiert ved Charité - Universitätsmedizin Berlin og Berlin Institute of Health (F.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
- Alberti, K. G., et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).
- International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention. IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome. , Available from: https://www.idf.org/e-library/consensus-statements/60-idfconsensus-worldwide-definitionof-the-metabolic-syndrome.html (2006).
- Melenovsky, V., et al. Left atrial remodeling and function in advanced heart failure with preserved or reduced ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 8 (2), 295-303 (2015).
- Goette, A., et al. EHRA/HRS/APHRS/SOLAECE expert consensus on atrial cardiomyopathies: definition, characterization, and clinical implication. EP Europace. 18 (10), 1455-1490 (2016).
- Schotten, U., Verheule, S., Kirchhof, P., Goette, A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiological Reviews. 91 (1), 265-325 (2011).
- Hohendanner, F., DeSantiago, J., Heinzel, F. R., Blatter, L. A. Dyssynchronous calcium removal in heart failure-induced atrial remodeling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (6), H1352-H1359 (2016).
- Hohendanner, F., et al. Inositol-1,4,5-trisphosphate induced Ca2+ release and excitation-contraction coupling in atrial myocytes from normal and failing hearts. The Journal of Physiology. 593 (6), 1459-1477 (2015).
- Tada, Y., et al. Role of mineralocorticoid receptor on experimental cerebral aneurysms in rats. Hypertension. 54 (3), 552-557 (2009).
- Iwasaki, Y. K., et al. Atrial fibrillation promotion with long-term repetitive obstructive sleep apnea in a rat model. Journal of the American College of Cardiology. 64 (19), 2013-2023 (2014).
- Field, L. J. Atrial natriuretic factor-SV40 T antigen transgenes produce tumors and cardiac arrhythmias in mice. Science. 239 (4843), 1029-1033 (1988).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Sartiani, L., Bochet, P., Cerbai, E., Mugelli, A., Fischmeister, R. Functional expression of the hyperpolarization-activated, non-selective cation current I(f) in immortalized HL-1 cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 545 (Pt 1), 81-92 (2002).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Gunduz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50289 (2013).
- Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (91), e51109 (2014).
- Thum, T., Borlak, J. Isolation and cultivation of Ca2+ tolerant cardiomyocytes from the adult rat: improvements and applications. Xenobiotica. 30 (11), 1063-1077 (2000).
- Egorova, M. V., Afanas'ev, S. A., Popov, S. V. A simple method for isolation of cardiomyocytes from adult rat heart. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 140 (3), 370-373 (2005).
- Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments. (92), e51823 (2014).
- Hohendanner, F., et al. Cellular mechanisms of metabolic syndrome-related atrial decompensation in a rat model of HFpEF. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 115, 10-19 (2017).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), e2033 (2010).
- Bootman, M. D., Higazi, D. R., Coombes, S., Roderick, H. L. Calcium signalling during excitation-contraction coupling in mammalian atrial myocytes. Journal of Cell Science. 119 (Pt 19), 3915-3925 (2006).
- Smyrnias, I., et al. Comparison of the T-tubule system in adult rat ventricular and atrial myocytes, and its role in excitation-contraction coupling and inotropic stimulation. Cell Calcium. 47 (3), 210-223 (2010).
- Pritchett, A. M., et al. Diastolic dysfunction and left atrial volume: a population-based study. Journal of the American College of Cardiology. 45 (1), 87-92 (2005).
- Linz, D., et al. Cathepsin A mediates susceptibility to atrial tachyarrhythmia and impairment of atrial emptying function in Zucker diabetic fatty rats. Cardiovascular Research. 110 (3), 371-380 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Deel, E. D., et al. In vitro model to study the effects of matrix stiffening on Ca(2+) handling and myofilament function in isolated adult rat cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 595 (14), 4597-4610 (2017).
- Wuensch, E., Heidrich, H. G. [On the Quantitative Determination of Collagenase]. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für physiologische Chemie. 333, 149-151 (1963).
- Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
- Horgan, S., Watson, C., Glezeva, N., Baugh, J. Murine models of diastolic dysfunction and heart failure with preserved ejection fraction. Journal of Cardiac Failure. 20 (12), 984-995 (2014).
