Summary
여기, 우리가 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서 단일 셀 심 방 cardiomyocytes의 격리에 대 한 최적화, Langendorff 기반 절차를 설명합니다. 심장 구멍의 intraluminal 압력의 수동 조절 기능 그대로 myocytes 흥분-수축-결합 연구에 대 한 적합 한를 구현 됩니다.
Abstract
이 문서에서는, 우리는 변화 증후군 (메츠)의 쥐 모델에서 단일 셀 심 방 cardiomyocytes (Acm)의 분리에 대 한 최적화, Langendorff 기반 절차 설명-관련 보존된 방출 분수 (HFpEF)와 함께 심장 마비. 메츠 관련 HFpEF의 보급은 상승 하 고, 그리고 심 cardiomyopathies 개장 하는 심 방 및 심 방 세 동와 관련 된 관련성이 높은 임상으로 심 방 개장 사망률의 독립적인 예측 인자. 격리 된 단일 셀 cardiomyocytes와 연구 자주 확증 vivo에서 조사 결과 보완 하는 데 사용 됩니다. 순환 선박 rarefication 및 조직 간 질 성 섬유 증이이 질환의 동물 모델에서 Acm의 성공적인 단일 셀 격리에 대 한 잠재적으로 제한 요소를 포즈.
우리가 실질적으로 형태학 상으로 그리고 기능적으로 그대로 Acm의 수확량을 증가 수동으로 격리 절차 동안 심장 구멍의 intraluminal 압력을 조절 하는 장치를 사용 하 여이 문제를 해결 했습니다. 인수 세포 세포 배양 및 기능성 칼슘 이미징 (즉, 흥분-수축-커플링) 등 다양 한 실험의 다양 한에서 사용할 수 있습니다.
우리 연구원 단계별 프로토콜, 최적화 된 솔루션, 필요한 장비 및 포괄적인 문제 해결 가이드를 준비 하는 철저 한 지침의 목록 제공 한다. 절차의 초기 구현을 오히려 어려울 수도 있습니다, 그러나 성공적인 적응 메츠 관련 광범위 한 실험에 대 한 HFpEF의 쥐 모델에서 최신의 ACM 격리를 수행 하는 독자 수 있게 됩니다.
Introduction
메츠 당뇨병 mellitus 타입-2와 심혈 관 질환 위험 요인의 클러스터를 설명 하 고 포함 하는 증가 동맥 혈압, dyslipidemia (트리 글리세라이드를 제기 하 고 고밀도 지 단백 콜레스테롤을 낮 췄 다), 금식 증가 포도 당, 그리고 중앙 비만1. 메츠의 전세계 보급 되며 지속적으로 상승2, 25-30%로 추정 된다. HFpEF은 메츠와 자주 관련 된 이기종 임상 증후군. HFpEF 및 그것의 이전 단계 (즉, 고혈압 성 심장 질환) 중 심장 개장은 또한 동반 atria3을 개장 하는. 감소 된 수축 성 기능 및 구조적인 변화는 왼쪽된 아 트리 움의 사망률 증가, 심 방 세 동, 및 새로운 발병 심장 마비4와 연결 되었습니다. 개장 하는 심 방 이온 채널 기능, 캘리포니아2 + 항상성, 심 방 구조, 섬유 아 세포 활성화 및 조직 섬유 증5에 변화에 의해 특징입니다. 왼쪽에 메츠 관련 HFpEF의 기본 병 적인 메커니즘 아직도 제대로 이해 하 고 더 깊이 있는 조사를 필요로 개장 하는 심 방. 동물 모델은 유용한 도구가 될 고 심 방 cardiomyopathies6,7,,89의 분야에서 많은 발전을 입증 했다.
격리 된 단일 셀 cardiomyocytes와 연구 자주 확증 vivo에서 조사 결과 보완 하는 데 사용 됩니다. 절연 및 잠재적인 후속 세포 배양, 신호 경로, 이온 채널 전류, 및 흥분-수축-커플링의 조사에 대 한 수 있습니다. 생리 적인 조건 하에서 cardiomyocytes 증식 하지 않습니다. Atrial natriuretic 요소의 transcriptional 규제 시퀀스와는 유인원 바이러스 40 큰 T 항 원 유전자 변형 쥐에서 사이의 융합 AT-110라는 첫 번째 불멸 하 게 Acm의 창조로 이끌어 냈다. AT-1 셀의 추가 개발 HL-1 셀만 순차적으로 passaged 수 없습니다 하지만 또한 저절로11계약에 상승을 했다. 그러나 그들은,, 구조와 기능 차이 덜 조직 된 열 대권 외의, hyperpolarization-활성화 안쪽으로 현재12myofibrils11, 개발의 높은 발생 등 갓 고립 된 세포에 비해 표시. 쥐와 쥐 모델의 다양 한에서 심 실 cardiomyocytes (VCM)의 절연은 잘 설립된13,14,15,16,,1718 , 19. 일반적으로, 삭제는 Langendorff 장치에 탑재 마음과 retrogradely 끼얹는다는 캘리포니아2 +-collagenases 및 프로 테아 제와 같은 소화 효소를 포함 하는 무료 버퍼. 칼슘은 다음 생리 적 조건에 단계적 방식으로 재. 그러나, Acm의 고립에 전용 프로토콜 사용할 수 있는20,21, 증가 증과 차이 압력 관련 있더라도 개장 하는 심 질환 모델에서 그들의 유용성은 제한 됩니다.
이 문서에서는, 우리는 심 방 개장 (즉, 특히 메츠 관련 HFpEF의 ZFS1 쥐 모델에 대 한)22를 나타내는 동물에서 심 방 단일 셀 cardiomyocytes의 격리에 대 한 프로토콜을 실행 했다. 기존 격리 프로토콜 최적화 하 고 제어 하 고 형태학 상으로 그리고 기능적으로 그대로 cardiomyocytes의 높은 수율으로 이어지는 심장 충 치의 intraluminal 압력 수정 간단 하 고, 주문 품 장치에 의해 보완 했다. 다음 프로토콜 단계별 가이드와 함께 연구원, 주문 품 장비, 솔루션의 목록 뿐만 아니라 포괄적인 문제 해결 가이드에 대 한 자세한 설명을 제공합니다.
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Protocol
모든 실험 (TVA T0060/15 및 T0003 15) 지역 윤리 위원회에 의해 승인 하 고 관리 및 실험 동물 사용 (건강의 국가 학회, 미국)에 대 한 지침과 일치 하 여 수행 했다.
참고: 절차의 단순화 된 순서도 그림 1에 표시 됩니다.
1입니다. prearrangements
- 표 1에 따라 버퍼를 준비 합니다.
| 솔루션 | PB | CB | DB | SB | S1 | S2 | S3 | NT | |
| 시 약 (mM) | |||||||||
| NaCl | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | |
| KCl | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4 | |
| KH2포4 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | ||
| 나2HPO4 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | ||
| MgSO4 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | ||
| MgCl | 1 | ||||||||
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
| 황소자리 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | ||
| 포도 당 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| BDM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| CaCl2 | 1 | 0.01 | 0.125 | 0.25 | 0.5 | 1 | |||
| BSA | 150 | 70 | 70 | 70 | |||||
| 정제 효소 혼합 (중간 Thermolysin) | 0.195 Wünsch 단위/mL | ||||||||
| pH 조정 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | |
| pH 조정 | 37 ° C | 4 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | |
| pH 조정 | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH |
표 1: 버퍼 목록. PB: 관류 버퍼, 4 ° C (300 mL 동물 당)에서 3 일 동안 저장할 수 있습니다. CB: cannulation 버퍼, 4 ° C (200 mL 동물 당)에서 3 일 동안 저장할 수 있습니다. DB: 소화 버퍼, 하루 (40 mL 동물 당) 내에서 사용할 수 있다. SB: 중지 버퍼, 어느 하루 (동물 당 2 mL) 내에서 사용할 수 있다. S1: 1 단계 버퍼, 하루 (동물 당 2 mL) 내에서 사용할 수 있다. S2: 2 단계 버퍼, 하루 (동물 당 2 mL) 내에서 사용할 수 있다. S3: 3 단계 버퍼, 하루 (동물 당 2 mL) 내에서 사용할 수 있다. NT: 정상 Tyrode, 하루 (동물 당 50ml) 내에서 사용할 수 있다.
-
Langendorff 장치 (그림 2A)을 준비 합니다.
- 70% 에탄올, 증류수 100 mL 물 2 플러시 다음의 100 mL와 함께 시스템을 플러시. 관류 버퍼 (PB)의 200 mL로 시스템을 채우십시오.
- 3 mL/min를 연동 펌프의 유량을 설정 합니다.
- 39 ° c Langendorff 기구를 떠나 PB의 온도 보정
- Langendorff 장치 위에 [16 G 25 m m 긴, 날카로운 팁 제거 (그림 3A)] 주문 품 정 놓고 흐름을 시작 합니다. 켜고 난방 모듈은 정 맥의 끝에 PB의 원하는 온도 도달 하는 난방 모듈의 값을 조정 합니다. 온도 교정 완료 되 면 주문 품 정 cannulation (그림 2B)에 사용 하는 주사기에 이동 합니다.
- Langendorff 시스템 옆 압력 제어 장치 (그림 3C)을 준비 합니다. 삼각대 클램프에 나비 바늘을 탑재 하 고 3 차단 노트 준비.
참고: 콜라 효소 활동 온도 따라 다릅니다. 절차의 뒷부분에 나오는 동적 조정, 왼쪽된 아 트리 움의 온도 모니터링 필요 합니다.
- 기관 절단 및 그림 2B에 따르면 cannulation 장비를 설정 합니다. 비 커, 주사기, 및 차가운 cannulation 버퍼 (CB)와 페 트리 접시를 cannulation 노트 준비.
-
Heparinize 쥐 쥐의 몸 무게의 100 g 당 덤플링의 500 I.U.와 같습니다.
- 설치류에 적합 한 마 취 유도 실에서 100 %isoflurane 2 개 mL를 넣어. 유도 약 실에 감 금에서 21 주 된 ZFS-1 비만 쥐를 전송. 쥐를 깊은 마 취, 초기 주파수의 절반 호흡의 감속에 의해 표시 된 입력을 허용 합니다.
- 유도 실에서 쥐를 제거 합니다. 헤 파 린 주사기를 사용 하 여 복 막에의 헤 파 린 쥐의 몸 무게의 100 g 당 500 I.U.를 삽입할.
- 그것의 감 금으로 쥐를 반환 하 고 일어나 그것 허용 합니다.
참고: 아니에요 1.4 단계 불 임을 유지 하는 데 필요한. 다음 단계로 진행 하기 전에 20 분 기다립니다. 불완전 한 anticoagulation 혈액 응고, 마이크로-경색, 품질 및 수율 격리 cardiomyocytes의 실질적으로 영향을 수 있는 선도 발생할 수 있습니다.
2. 마음 준비
- 설치류에 적합 한 마 취 유도 실에서 100 %isoflurane 2 개 mL를 넣어. 유도 약 실에 감 금에서 21 주 된 ZFS-1 비만 쥐를 전송. 쥐를 깊은 마 취, 초기 주파수의 절반 호흡의 감속에 의해 표시 된 입력을 허용 합니다.
- 잘린 설치류에 대 한 적합 한 단두대를 사용 하 여 동물을 안락사. 폴리스 티 렌 거품 표면에 쥐의 사지 흥분 리프트와 수술가 위 칼 과정을 취재 하는 피부를 제거. 양쪽에 갈비뼈 연습장 아래 복 막 열고 막 노출 합니다.
- 좋은 위를 사용 하 여 앞쪽 호 따라 절 개 하 여 횡 경 막을 엽니다. Clavicular 뼈, mediastinum 현장노출 수술가 위를 사용 하 여 교육 mediaclavicularis 를 따라 양쪽에 갈비뼈를 통해를 잘라.
- 좋은 위는 hila의 원심 끝에 폐를 제거 합니다. 대동맥 아치 노출 thymus 그만.
- 집게를 사용 하 여 심장의 기지를 공략 하 고 동물의 꼬리 쪽으로 부드럽게 풀 다운. 마음에 풀을 유지 하면서 대동맥을 가로질러, 대동맥의 5mm 긴 세그먼트를 떠나 마음에 첨부 됩니다. 신속 하 게 50 ml 비 커 (그림 2B)에 50 mL의 얼음 처럼 차가운 CB에 마음 전송.
참고: 단계 2.5-3.3, 마음은 효과적으로 허 혈 성 상태에서. Cardiomyocytes는 손상 하기 위하여이 단계에 대 일 분의 총을 초과 하지 마십시오.
3입니다. cannulation
- 진정 하 고 탈취 수축 심장에 대 한 대기 약 10 s. 신선한, 50 mL를 포함 하는 배양 접시에 마음 전송 차가운 CB. 조심 스럽게 집게와가 위를 사용 하 여 대동맥을 둘러싼 지방 조직의 제거.
- 주문 품 정 (동일 단계 1.2.3에서에서 사용), 얼음 처럼 차가운 CB, 대동맥으로 3mm 가득 10 mL 주사기에 붙어 있는 삽입 합니다. 들여쓰기는 정 맥의 끝에 인접에 두 cannulation 매듭 (그림 3B) 중 매 서는 정에 대동맥을 흥분.
주: 수는 정으로 침투 하 여 대동맥 밸브를 손상 하지 않도록 주의 하십시오. - 부드럽게 아니 더 많은 혈액 관상 동맥에 표시 될 때까지 정 맥에 연결 된 주사기를 사용 하 여 차가운 CB의 5 mL와 대동맥 플러시. 부드럽게 왼쪽된 아 트리 움 집게를 사용 하 여 마사지와 어떤 과잉 혈액 배양 접시에 구멍에서 제거 될 수 있도록 CB의 나머지 5 mL 주입.
- 두 번째 cannulation 매듭 (봉합: USP 3/0, 실크)에 정 맥의 원심 끝에 들여쓰기. 주사기에서 연결 된 마음으로 정을 마운트 해제 합니다. 적절 한 어댑터를 사용 하 여 Langendorff에 연결 된 마음으로 정을 탑재 합니다.
참고:이 프로토콜 Langendorff 기구에서 관류 동안 심 실 구멍에 높은 압력을 사용합니다. 추가 cannulation 매듭 대동맥을 통해 모든 참가자 버퍼 누설을 방지 하 여이 압력을 유지 하기 위해 필요 합니다.
4. 압력 조작 및 소화
- PB와 심장 조직 관류를 시작 하는 Langendorff 기구의 연동 펌프를 시작 합니다. 이중 overhand 매듭 (봉합: USP 3/0, 실크) 심장의 기지 주변 대동맥 제외. 오른쪽과 왼쪽 안마당의 물가까지이 단계를 반복으로 관상 공동 것으로 나타났습니다.
- 아 트리 움의 압력 제어 장치 (그림 3D) 나비 바늘으로 찔린 고 폐에 안마당. 아 트리 움의 intraluminal 압력 나비 호스의 고도 조정 하 여 조작 합니다. 계속 약간 절차;의 나머지 부분에 걸쳐 비정상적으로 아 트리 움 모니터링 하 고 그에 따라 조정 합니다.
참고:이 단계는 수행할 수 신속 하 게, 왼쪽된 아 트리 움의 장기 인플레이션 cardiomyocyte 죽음 귀 착될 것 이다 필요 합니다. - 왼쪽된 심 방 및 좌 심 실 사이 온도 프로브를 배치 하 여 왼쪽된 아 트리 움의 대략적인 온도 측정 합니다. 모듈을 따라 난방, 왼쪽된 아 트리 움의 37 ° C의 대략 온도 대상으로 Langendorff의 온도 조정 합니다.
- 3 분의 총에 대 한 PB와 하트 perfuse
- 약 14-18 분 소화 버퍼 (DB)에 관류를 전환 합니다.
참고: 소화 완료 되 면 왼쪽된 심 방 구조 축소와 조직 밀키 질감을 얻습니다. - 아 트리 움 집게를 사용 하 여 공략 하 고 약간의 풀을 제정. 좋은 위를 사용 하 여 좌 심 제거 하 고 중지 버퍼 (SB), 조직을 완전히 물속의 2 개 mL를 포함 하는 큰 무게 보트에 안마당을 전송.
- 폐기는 절차는 수행 하는 실험실의 지침에 따라 나머지 심장 조직.
5. 세포 처리 및 칼슘 재 적응
- 약 2 m m x 2 m m의 미세가 위를 사용 하 여 작은 조각으로 심 방 조직을 말하다.
- 부드러운 흡입 및 전송 피 펫을 사용 하 여 조직 덩어리의 방출에 의해 조직 분산. 조직의 거시적인 분리 관찰 될 수 있다 때까지 약 5 분 동안이 절차를 계속 합니다.
참고: 모든 방지 공기 세포를 노출,이 단계 동안 기포 cardiomyocyte 죽음 귀 착될 것 이다. - 15 mL 원뿔 튜브에 세포를 전송. 30 미 전송에 대 한 또 다른 15 mL 원뿔 튜브에 상쾌한 정착 조직 덩어리를 허용 합니다. 15 분에 대 한 해결 하기 위해 셀 수 있습니다.
- 제거 하 고 삭제는 상쾌한. 1 단계 버퍼의 2 개 mL를 추가 (하십시오 표 1참조). 10 분 동안 정착 cardiomyocytes 허용.
참고: 폐기 상쾌한 또한 포함 한다 섬유 아 세포와 내 피 세포. 실험14,23에 대 한 이러한 세포를 사용 하 여 원하는 경우 다른 프로토콜을 참조 하십시오. 펠 릿은 주로 심 방 cardiomyocytes는 가벼운 현미경 검사 법에 의해 확인 될 수 있다 포함 됩니다. 심 방 cardiomyocytes의 현미경 특성은 단계 6.1에서에서 설명 되어 있습니다. - 제거 하 고 삭제는 상쾌한. 2 단계 버퍼의 2 개 mL를 추가 합니다. 10 분 동안 정착 cardiomyocytes 허용.
- 제거 하 고 삭제는 상쾌한. 3 단계 버퍼의 2 개 mL를 추가 합니다. 10 분 동안 정착 cardiomyocytes 허용.
- 제거 하 고 삭제는 상쾌한. 추가 250 µ L의 정상적인 Tyrode (NT) 1 m m Ca2 +를 포함 합니다.
- (그리고 미리 건조 수) 25 %laminin 코팅 된 유리 하단 접시에 심 방 cardiomyocytes 포함 하 일반적인 Tyrode의 50 µ L를 전송 합니다. 10 분 동안 정착 cardiomyocytes 허용.
- 1mm CaCl2를 포함 하는 NT의 500 µ L로 유리 하단 접시를 채우십시오.
6. 기능 평가의 흥분 수축 연결
- 셀 형태학과 가벼운 현미경 20 배 확대 (그림 4A 및 4B)를 사용 하 여 생존 능력을 평가 합니다. 임의로 약 100 셀을 선택 하 고 셀 격리 절차의 가능성을 견적 하기 위하여 가능한 또는 unviable로 그들을 분류.
참고: 실행 가능한 세포 대칭 sarcomere 구조, 막 blebs의 부재와 막대 모양에 의해 특징. -
캘리포니아2 +셀 로드-완료의 20 분 이내 민감한 형광 염료 단계 5.9.
- 10 µ M 추가 Fluo4-오전 NT. 제거는 상쾌한의 500 µ L (단계 5.9)에서 유리 하단 접시. Fluo4 오전 유리 하단 접시 포함 된 NT를 추가 합니다. 실 온에서 20 분을 위한 혼합물을 품 어. 제거 하 고 삭제는 상쾌한. NT의 500 µ L를 사용 하 여 x 2 샘플을 씻으십시오.
-
시각화 캘리포니아2 +-다음과 같이 confocal 현미경으로 흥분.
- Confocal 현미경 유리 하단 접시를 전송 하 고 시각화 캘리포니아2 +-여기 confocal 현미경 (레이저 강도 5.8%, 488에서 여기에서 nm, 515에서 방출 nm) 40 X 확대를 사용 하 여.
- 적절 한 superfusion 장치를 사용 하 여 37 ° C에가 열 하는 nt 셀을 perfuse. 또는 셀 현미경 실장 열 인큐베이터를 사용 하 여 따뜻한 유지.
- 1 Hz의 주파수와 전류 허용 캘리포니아2 + 처리의 정상 상태에 도달 하는 세포를 1 분 동안 24 A. 대기의 상용, 현미경 실장 자극 전극과 전기장에 cardiomyocytes 자극.
- 거시적 셀 계약 횡단 축 도중 무작위로 선택 된의 가장자리와 핵 사이 병렬 스캔 라인을 놓습니다. 반복 검사 하 여 라인 스캔 이미지를 취득 합니다.
- 자유롭게 사용할 수 있는 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 전체 셀에 걸쳐 전기 자극 (F0) 직전 신호 강도 추정. 1 자극 주기 (F)의 과정을 통해 전체 셀에서 신호 강도 플롯 합니다. 각각 Ca2 + 과도 (F0) (F)를 나눕니다.
그림 1: 격리 절차의 단순화 된 순서도. 절차는 매우 민감한은 myocytes의 효소 소화 완료 될 때까지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 장비는 격리 이전 준비. (A)이이 패널 표시 성가 Langendorff 장치: (1) PB; 외피 반응 용기 (CB; 외피 반응 용기 2) (3) 3 방향 자 지; (4) 주사기; (5)는 연동 펌프; (6) 열 집중; (7) 외피 거품 함정; (8) 정 및 심장. (B)이이 패널 표시 최적화 된 작업 흐름에 대 한 cannulation 및 기관 절단에 대 한 설정: (1) 얼음 처럼 차가운 CB;의 50 mL를 100 mL 비 커 (2) 얼음 처럼 차가운 CB;와 10 mL 주사기 (3) 얼음 처럼 차가운 CB;와 페 트리 접시 (4)는 광원; (는 cannulation와 주문 품 정 5) 매듭 (참고 그림 3A와 3B); (6) 괜 찮 아 요, 곡선 겸 자; (7) 조직 집게; (8) 미세 집게, 각도 45 °; (9) 복 부 수술가 위; (10) 미세 수술가 위; (11) 30 G 바늘; x 4 (12) 15 G 바늘. (C)이이 패널 표시 confocal 이미징 위한 현미경 장착 장비: (1) 전기 자극 전극; (2) superfusion 펜; (3) 유리 하단 접시 Acm; 그리고 (4) 포장 되어 플래티넘 전기 자극 전극. (D)이이 패널 표시 confocal 영상에 대 한 현미경 설정: (1) confocal 현미경; (2) superfusion 펜; (3) superfusion 버퍼 저수지; (4) superfusion 밸브; (5) superfusion 난방 모듈; (6) 컴퓨터 워크 스테이션; (7) 전기 자극. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 주문 품 장비. (A)이이 패널 Luer 잠금 표시 조작된 15 G 정. 화살표는 cannulation 노트에 대 한 두 개의 들여쓰기를 나타냅니다. (B) 이들은 cannulation 매듭, 두 더블 overhand 매듭 급속 한 강화를 위한 다른 상단에 배치. 화살표 순서 매듭 강화 될 필요가 어디와 있는 나타냅니다. (C)이이 패널 조립된 압력 제어 장치를 보여줍니다. 21 G 나비 바늘 삼각대 클램프로 연결 됩니다. 호스는 바늘으로 동일한 높이로 유지 됩니다. 나사 상단 열립니다. 나비 호스 상승 왼쪽된 아 트리 움의 intraluminal 압력을 변경 하려면 화살표에 표시 된 대로 변경할 수 있습니다. (D) 왼쪽 아 트리 움은 압력 제어 장치 구멍 이다. 이 사진은 비정상적된으로 좌 심을 보여줍니다. 타원은 overhand 매듭의 위치를 표시합니다. (E) 왼쪽 아 트리 움은 압력 제어 장치 구멍 이다. 이 사진은 가능한 Acm의 낮은 수확량 귀 착될 것 이다 over-inflated 좌 심을 보여줍니다. 타원은 overhand 매듭의 위치를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Representative Results
나이의 21 주에 가능한 Acm (6.1 단계에 설명 된 대로 추정), 칼슘 다시 적응 (단계 5.4-5.7), 후의 60-90% (그림 4A)이 메서드에서 ZSF-1 비만 쥐에서 분리 수 있습니다. 쥐, Acm 다르고 VCMs24,25에 비해 더 많은 이기종 표현 형 특징입니다. 그림 4B 와 보존된 막 sarcomere 구조를 기능적으로 통합 셀의 두 강한 지표는 개별 ACM 보여줍니다.
인수 Acm는 다양 한 방법으로 처리할 수 있습니다. 그림5에서 exemplified, 세포 형태 및 기능을 연구 하는 데 사용 하는 형광 염료와 로드 수 있습니다. 예를 들어, 디-8-ANEPPS 심 방 쥐 셀 (그림 5A) 관 시스템의 윤곽을 그리 다 사용 되었다. 실험의 또 다른 세트, 미토 콘 드리 아 얼룩까지 빨간색 형광 염료 (예를 들어, mitotracker-레드-FM) 심 방 개장 cytosolic 미토 콘 드리 아 (그림 5B) 감지 하 채택 된다. 그림 5C같이 절연이 프로토콜을 Acm 라이브 셀 캘리포니아2 + 영상에 적합 있으며 표시 그대로 흥분 수축에 결합해 1 Hz 필드 자극. 모든 이미지는 다양 한 연구원6,7 (그림 5D)에 사용할 수 있는 알고리즘을 사용 하 여 추가 분석을 위해 사용할 수 있습니다.
그림 4: 가능한, 단일 셀 이에요의 각각 수익률 (A)이이 패널 표시 1mm Ca에 Acm의 재 적응 후 격리의 수익률2 + NT. (B)이이 패널 절연, 단일 셀 심 방 cardiomyocyte 보여줍니다. Sarcomere 구조, 세포 막, 그리고 핵 명확 하 게 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 형광 염료와 쥐 Acm의 얼룩. (A)이이 패널 표시는 세포 막 및 형광 염료 Di8ANNEPS와 관 네트워크의 얼룩. (B)이이 패널 표시는 캘리포니아2 +의 횡단 라인 스캔을 보여줍니다이 패널 형광 염료 mitotracker-레드-변조가 (C)와 미토 콘 드리 아의 얼룩-단일 셀에 형광 염료 Fluo4 오전와 여기. 화살표에서 1 Hz. (D)이이 패널 표시 longitudenal Ca2 + 과도 패널 C에서 파생 된 전기 자극을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 우리는 먼저 메츠 관련 HFpEF 보여 주는 심 방 개장22표시의 쥐 모델에서 단일 셀 Acm의 격리에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 절차는 수술 준비로 점점 어려운 대동맥의 cannulation 과도 한 지방 조직을 만들 수 있는 유일 하 게 도전. 표 2 주소 격리 절차의 가장 일반적인 문제 문제 해결 가이드 제공.
| 문제 | 가능한 원인 | 솔루션 |
| 나비 호스를 통해 아무 흐름 | Cannulation 노트와 대동맥의 부적당 한 폐쇄 | 강화 하기 전에 지방 조직 제거 |
| 각 들여쓰기 3 cannulation 매듭을 추가 | ||
| 증가 힘에 대 한 손으로 매듭을 당겨 | ||
| 차단 된 바늘 | 루멘으로 위치 재조정 | |
| 주사기와 부드러운 풀에 의해 차단 | ||
| 오른쪽 아 트리 움 / 관상 공동 하지 비정상적 | 심장 자료의 부적당 한 폐쇄 | 추가 노트와 블록 흐름 |
| 준비 하는 동안 손상 된 오른쪽 아 트리 움 | 클립/매듭을 가진 가까운 누설 | |
| 불 쌍 한 소화 / 아 트리 움 부드럽게 하지 않습니다 | 잘못 된 온도 통해 감소 된 효소 활동 | 37 ° C에 온도를 조정합니다 |
| 비활성/타락 효소 | 바꾸기 | |
| 오래 된/지나치게 거리 아 트리 움 | 소화 시간을 증가 (+ 50의 단계에서 %) | |
| 대동맥 밸브 손상 | Cannulation 동안 얕은 침투 | |
| 불 쌍 한 셀 수율 | 아 트리 움-소화 | 소화 시간을 단축 (+ 25의 단계에서 %) |
| 나비 호스를 낮추어 intraluminal 압력 감소 | ||
| 아 트리 움 소화 | 증가 소화 시간 (25%의 단계) | |
| 나비 호스를 올려서 intraluminal 압력 증가 | ||
| 너무 적극적인 셀 분산 | 더 부드러운 |
표 2: 문제 해결 가이드. 이 테이블은 격리 절차 및 해당 솔루션의 일반적인 문제를 표시합니다.
최근 연구에서 우리는 ZFS-1 비만 쥐 모델 증가 심 방 크기22로 광범위 한 심 방 개장 전시 나타났습니다. 왼쪽된 심 방 크기 증가 확장기 부전26 에 대 한 중요 한 전조 표식으로 인정을 받고 있다 고 하면 조직의 상대적인 microvascular 혈관의 rarefication. 이것은 특히 도전 하는이 모델에서 단일 셀 격리 렌더링 격리 절차 동안 대동맥의 역행 관류를 통해 소화 버퍼의 감소 분포. 개장 하는 심 방, 심 방 섬유 증, 및 증가 된 섬유 증의 다른 품질 증명 특징에서 쥐를 위해 표시 되었습니다-대사 당뇨병과는 ZFS1의 부모 스트레인에 대 한 쥐 모델27쥐. 콜라겐 예금 하려면 cardiomyocytes는 기질에서 해방, 따라서, 더 세포 격리 절차28의 소화 효소의 효능을 저하.
압력 장치를 용이 하 게 개장 하는 심 방의이 모델에서 향상 된 절연 결과 메커니즘 왼쪽된 아 트리 움의 관상 동맥 혈액 흐름의 지역화 된 감쇠와 관련 된 가장 가능성이 높습니다. 관상 동맥 혈액 흐름의 한 주요 구성 요소는 관상 동맥 관류 압력, 관상 동맥 압력 및 각 구멍29의 끝 확장기 혈압 사이 기온 변화도로 정의 됩니다. 설명된 절차 동안 심장 기지의 막힌 관상 동맥 압력 및 심장에 걸쳐 intraluminal 압력에 세계적인 증가 이끌어 낸다. 왼쪽된 아 트리 움의 후속 펑크 왼쪽된 심 방 구멍에서 intraluminal 압력의 지역, 선택적 드롭을 수 있습니다. 따라서, 큰 관상 동맥 관류 압력 기울기 설정 뿐만 아니라 관류 볼륨도 남기도록된 소화 솔루션 혼잡 한 좌 심 실에서 좌 심을 증가.
또한, 소화 효소의 선택은 ACM 격리에 대 한 중요 한: I 및 II 보였다 collagenases30처럼 적은 타겟이 명확 하 고 덜 순수한 효소를 우수 하 콜라의 효소 혼합을 정화. 이 효소는 형태학 상으로 그리고 기능적으로 그대로 cardiomyocytes의 높은 수익률만 허용 하지 않습니다 하지만 또한 어떤 그들의 격리31후 단일 세포의 응집을 최소화 한다. 정제 효소 추가 높은 dispase와 collagenases의 혼합 또는 중간 thermolysin 콘텐츠 쥐 cardiomyocyte 격리 가장 일반적으로 사용 됩니다. 심 방 myocytes의 최상의 결과 인수 했다 VCMs는 높은 농도에서 가장 고립 된, 0.195의 농도와 Wünsch 단위/mL이를 사용 하 여32프로토콜.
메츠 관련 HFpEF의 보급은 상승 하 고 있다2 및 심 방 cardiomyopathies 심 방 리 모델링을 선도 하 고 심 방 세 동 관련성이 높은 임상,이 분야에서 연구의 중추적인 관심은 있습니다. HFpEF에 대 한 많은 새로운 동물 모델33,34 떠오르고 있다 그리고 심 방 심 리듬 장애의 발생률이 증가 따라 개장 하는 질병의 특징 기능. 설명된 방법 매우 높은 수확량을 가진 추가 연구에 대 한 심 방 개장을 가진 쥐 모델에서 가능한 단일 cardiomyocytes 분리 연구자 있으며 기계 및 전기 기능을 보존.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 (심장 혈관 연구, db 위한 독일 센터), DZHK에 의해 지원 되었다 EKFS (Else Kröner Fresenius 재단, F.H.), 고 (독일 교육 및 연구), BMBF BIH Charité 임상 과학자 프로그램 투자에 의해 의해 Charité-Universitätsmedizin 베를린, 베를린 건강 연구소 (F.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
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