Summary
在这里, 我们描述了一个优化的, Langendorff 的程序, 从一个大鼠模型的代谢综合征心力衰竭与保存的弹射分数分离的单细胞心房心肌细胞。对心脏腔腔内压进行人工调节, 以产生功能完整的心肌细胞, 适合于励磁收缩耦合研究。
Abstract
在本文中, 我们描述了一个优化的, Langendorff 的程序, 以隔离的大鼠代谢综合征 (飞机状态) 的模型, 与保存的射血分数 (HFpEF) 的一个人心肌细胞。随着心房重塑是死亡率的独立预测因子, 与心房重塑和心房颤动相关的心房心肌与 HFpEF 的发病率呈上升趋势。孤立单细胞心肌细胞的研究经常被用来证实和补充体内的发现。循环血管 rarefication 和间质组织纤维化是一个潜在的限制因素, 成功的单细胞分离飞机状态从动物模型的这种疾病。
我们通过使用一种能够在隔离过程中手动调节心脏腔腔内压力的装置来解决这个问题, 大大提高形态学和功能完整的飞机状态的产量。所获得的细胞可用于各种不同的实验, 如细胞培养和功能性钙成像 (即励磁收缩耦合)。
我们为研究员提供一步一步的协议, 一个优化的解决方案列表, 详细的说明准备必要的设备, 和全面的故障排除指南。虽然最初的实施程序可能是相当困难的, 一个成功的适应将使读者能够执行最先进的隔离在大鼠模型中与 HFpEF 有关的广泛的实验。
Introduction
大都会描述了糖尿病 type-2 和心血管疾病的一系列危险因素, 包括增加的动脉血压, 血脂异常 (升高甘油三酯和降低高密度脂蛋白胆固醇), 增加禁食葡萄糖和中央肥胖症1。据估计, 世界大都会的流行率为 25–30%, 持续上升2。HFpEF 是一种异质临床综合征, 常与大都会相关。HFpEF 和前阶段 (即高血压性心脏病) 的心脏重塑也伴随着心房3的重塑。左心房的收缩功能和结构改变与死亡率增加、心房颤动和新发心力衰竭4有关。心房重塑的特点是离子通道功能的变化, 钙2 +稳态, 心房结构, 成纤维细胞活化, 组织纤维化5。与 HFpEF 相关的左心房重塑及其潜在的病理机制尚不清楚, 需要进一步深入调查。动物模型已被证明是一个宝贵的工具, 并导致在心房心肌6,7,8,9领域的许多进展。
孤立单细胞心肌细胞的研究经常被用来证实和补充体内的发现。一个孤立和潜在的后续细胞培养, 允许调查信号通路, 离子通道电流, 和励磁收缩耦合。在生理条件下, 心肌细胞不会增殖。在转基因小鼠中, 心房钠素转录调控序列与猿猴病毒40大 T 抗原的融合导致了第一个永生化的飞机状态, 命名为 AT-110。AT-1 细胞的进一步发育引起了 HL-1 细胞的形成, 它不仅可以连续传代, 而且能自发收缩11。然而, 与新近分离的细胞相比, 它们表现出结构和功能上的差异, 如组织超微结构、发育肌原纤维11的高发生率和极化活化的内电流12。大鼠和小鼠心室心肌细胞 (VCM) 的分离是建立在13、14、15、16、17、18,19. 一般情况下, 切除心脏被安装到一个 Langendorff 设备和 retrogradely 灌注与一个 Ca2 +自由缓冲含有消化酶, 如胶原酶和蛋白酶。然后以逐步的方式将钙重新引入到生理条件中。然而, 即使专门用于隔离飞机状态的协议20、21, 由于纤维化和压力相关的差异, 它们在心房重塑的疾病模型中的效用是有限的。
在这篇文章中, 我们已经实施了一个协议, 以隔离的动物, 显示心房重塑 (特别是为 ZFS1大鼠模型 HFpEF)22的心房单细胞心肌细胞。现有的隔离协议得到了优化, 并辅以一个简单的, 定制的装置来控制和修改心脏腔腔内压力, 导致更高的形态和功能完整的心肌细胞的产量。下面的协议为研究员提供了一步一步的指南, 详细描述了定制的设备, 一个解决方案列表, 以及一个全面的故障排除指南。
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Protocol
所有实验均经当地伦理委员会 (TVA T0060/15 和 T0003-15) 批准, 并与《关于护理和使用实验动物指南》 (美国国立卫生研究院) 达成一致。
注意: 过程的简化流程图如图 1所示。
1. Prearrangements
- 根据表1准备缓冲区。
| 解决 方案 | 铅 | Cb | Db | 某人 | S1 | S2 | S3 | Nt | |
| 试剂 (mM) | |||||||||
| Nacl | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | |
| 氯化钾 | 4。7 | 4。7 | 4。7 | 4。7 | 4。7 | 4。7 | 4。7 | 4 | |
| 2PO4 | 0。6 | 0。6 | 0。6 | 0。6 | 0。6 | 0。6 | 0。6 | ||
| Na2HPO4 | 0。6 | 0。6 | 0。6 | 0。6 | 0。6 | 0。6 | 0。6 | ||
| MgSO4 | 1。2 | 1。2 | 1。2 | 1。2 | 1。2 | 1。2 | 1。2 | ||
| 氯化镁 | 1 | ||||||||
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
| 牛磺酸 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | ||
| 葡萄糖 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| BDM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| CaCl2 | 1 | 0.01 | 0.125 | 0.25 | 0。5 | 1 | |||
| Bsa | 150 | 70 | 70 | 70 | |||||
| 纯化酶共混 (中 Thermolysin) | 0.195 Wünsch 单位/毫升 | ||||||||
| pH 值调整为 | 7。4 | 7。4 | 7。4 | 7。4 | 7。4 | 7。4 | 7。4 | 7。4 | |
| pH 值调整 at | 37°c | 4°c | 37°c | 37°c | 37°c | 37°c | 37°c | 37°c | |
| pH 值调整与 | 氢氧化钠 | 氢氧化钠 | 氢氧化钠 | 氢氧化钠 | 氢氧化钠 | 氢氧化钠 | 氢氧化钠 | 氢氧化钠 |
表 1: 缓冲区列表.PB: 灌注缓冲, 可储存3天在4°c (每动物300毫升)。CB: 插管缓冲器, 可以储存3天在4°c (每动物200毫升)。DB: 消化缓冲, 必须在白天使用 (每动物40毫升)。某人: 停止缓冲, 必须在白天使用 (每只动物2毫升)。S1: 步1缓冲, 必须在天之内使用 (每动物2毫升)。S2: 步2缓冲, 必须在天之内使用 (每动物2毫升)。S3: 步3缓冲, 必须在天之内使用 (每动物2毫升)。NT: 正常的 Tyrode, 必须在白天使用 (每只动物50毫升)。
-
准备 Langendorff 设备 (图 2A)。
- 冲洗系统与100毫升70% 乙醇, 其次是2冲洗100毫升蒸馏水。用200毫升的灌注缓冲 (PB) 填充系统。
- 将蠕动泵的流量设置为3毫升/分钟。
- 将 Langendorff 装置的铅温度校准到39摄氏度。
- 将特制套管 [16 克, 长25毫米, 尖尖移除 (图 3A)] 放在 Langendorff 装置的顶部, 开始流动。打开加热模块, 调整加热模块的值, 以达到套管尖端的 PB 所需的温度。温度校准完成后, 将特制套管移至用于插管的注射器 (图 2B)。
- 准备 Langendorff 系统旁边的压力控制装置 (图 3C)。将蝴蝶针安装在三脚架钳上, 准备3个阻塞节。
注: 胶原酶活性随温度变化。对左心房进行温度监测, 并对其进行动态调整, 在以后的过程中需要。
- 根据图 2B设置器官切除和插管设备。用冰冷的插管缓冲器 (CB) 填满烧杯、注射器和培养皿, 准备插管结。
-
Heparinize 鼠的500国际单位肝素每100克的老鼠的体重如下。
- 将2毫升100% 异氟醚放在适合啮齿动物的麻醉诱导室中。将21周大的 ZFS-1 肥胖鼠从笼子转移到感应室。允许大鼠进入深层麻醉, 由呼吸减速到其初始频率的一半表示。
- 从感应腔中取出老鼠。用肝素注射器将500国际单位的肝素每100克注射到腹膜中。
- 把老鼠送到笼子里, 让它醒过来。
注意: 在步骤1.4 中不需要保持不育。请稍候20分钟, 然后继续下一步。不完全抗凝可引起血液凝固, 导致微梗死, 对孤立心肌细胞的质量和产量有显著影响。
2. 心脏准备
- 将2毫升100% 异氟醚放在适合啮齿动物的麻醉诱导室中。将21周大的 ZFS-1 肥胖鼠从笼子转移到感应室。允许大鼠进入深层麻醉, 由呼吸减速到其初始频率的一半表示。
- 弄死动物通过斩首使用一个适合啮齿动物的断头台。把老鼠的四肢缠在聚苯乙烯泡沫表面上。用手术剪刀抬起并取出覆盖剑突过程的皮肤。在两侧的肋骨笼下面打开腹膜, 露出隔膜。
- 用细剪刀沿前弧形切口切开隔膜。将两侧肋骨沿linea mediaclavicularis切开至锁骨骨, 使用手术剪刀, 在原位暴露纵隔。
- 用细剪刀去除门区远端的肺部。切除胸腺以暴露主动脉弓。
- 用镊子捏住心脏的底座, 轻轻地向下拉向动物的尾部。切过主动脉, 同时保持心脏的拉力, 留下5毫米长段的主动脉附着在心脏上。迅速转移心脏到50毫升冰冷 CB 在50毫升烧杯 (图 2B)。
注意: 在2.5–3.3 步骤中, 心脏在缺血性疾病中有效。避免超过3分钟以上的步骤, 以免损害心肌细胞。
3. 插管
- 等待大约十年代心脏冷却下来并且占领收缩。将心脏转移到含有50毫升新鲜的冰冷 CB 的培养皿中。用镊子和剪刀小心地去除围绕主动脉的脂肪组织。
- 插入自定义套管 (与步骤1.2.3 中使用的相同), 它连接到10毫升注射器, 充满冰冷的 CB, 3 毫米进入主动脉。将主动脉锁定在套管上, 将两个插管结 (图 3B) 中的一个放在套管尖端的压痕上。
注意: 小心不要通过导管穿透来损伤主动脉瓣。 - 用5毫升冰冷的 CB 轻轻冲洗主动脉, 用注射器附着在导管上, 直到冠状动脉内没有更多的血液可见。用镊子轻轻按摩左心房, 注入剩余的5毫升 CB, 允许从腔内取出多余的血液进入培养皿。
- 栓第二个插管结 (缝合: USP 3/0, 丝绸) 在凹痕远端到套管尖端。从注射器中卸下与心脏相连的套管。使用适当的适配器将连接心脏的套管装入 Langendorff。
注: 本协议在 Langendorff 器械灌注过程中使用心室腔内的高压。额外的插管结是需要通过避免任何顺缓冲泄漏通过主动脉, 以保持这种压力。
4. 压力操纵和消化
- 启动 Langendorff 装置的蠕动泵, 用 PB 启动心脏组织的灌注。在心脏的底部, 不包括主动脉, 系上双头结 (缝合: USP 3/0, 丝)。重复这个步骤, 直到左心房和冠状动脉窦的通货膨胀被注意到。
- 使用压力控制装置的蝶形针刺穿中庭 (图 3D), 并允许中庭收缩。通过调整蝶形软管的标高来操纵中庭的腔内压力。在整个程序的其余部分保持心房微微充气;监控并相应调整。
注意: 这一步需要迅速执行, 因为左心房的长期膨胀会导致心肌细胞死亡。 - 通过定位左心房和左心室之间的温度探针来测量左心房的近似温度。相应地调整 Langendorff 加热模块的温度, 对准左心房37摄氏度的近似温度。
- 灌注的心脏与 PB 共3分钟。
- 将灌注转换为约14–18分钟的消化缓冲 (DB)。
注: 当左心房结构坍塌, 组织获得乳白色纹理时, 消化完成。 - 用镊子捏住心房, 并进行轻微的拉力。用细剪刀取下左心房, 将中庭转移到含有2毫升停车缓冲 (SB) 的大称量船上, 充分淹没组织。
- 按照实验室执行程序的指导方针, 处理余下的心脏组织。
5. 细胞加工和钙的重新适应
- 用细剪刀将心房组织切成大约2毫米 x 2 毫米的小块。
- 用转移吸管对组织块进行温和的吸入和弹射, 分散组织。继续这个过程大约5分钟, 直到组织的宏观离解能被观察。
注意: 在这个步骤中避免任何气泡, 因为将细胞暴露在空气中会导致心肌死亡。 - 将细胞转移到15毫升锥形管上。允许组织块在三十年代解决. 将上清液转移到另一15毫升锥形管中。允许单元格结算15分钟。
- 除去并丢弃上清。添加2毫升的步骤1缓冲区 (见表 1)。让心肌细胞安定10分钟。
注: 被丢弃的上清液还包括成纤维细胞和内皮干细胞。如果需要使用这些单元格进行实验14、23, 请参阅其他协议。该颗粒将主要包含心房心肌细胞, 可以通过光镜证实。步骤6.1 对心房心肌细胞的显微特征进行了讨论。 - 除去并丢弃上清。添加2毫升的步骤2缓冲区。让心肌细胞安定10分钟。
- 除去并丢弃上清。添加2毫升的步骤3缓冲区。让心肌细胞安定10分钟。
- 除去并丢弃上清。添加250µL 的正常 Tyrode (NT), 其中包含1毫米 Ca2 +。
- 将含有心房心肌细胞的正常 Tyrode 的50µL 转移到一个玻璃底盘上, 涂上25% 层层粘连蛋白 (并允许事先晾干)。让心肌细胞安定10分钟。
- 填充一个玻璃底菜与500µL 的 NT 包含1毫米 CaCl2。
6. 励磁收缩耦合功能评价
- 使用20X 放大倍数 (图 4A和4B) 评估光镜下的细胞形态和活力。随机选择大约100个细胞, 并将它们归类为可行或难以为继, 以估计细胞隔离过程的可行性。
注意: 可行细胞的特点是对称小节结构, 缺乏膜泡, 和一个棒形。 -
在完成步骤5.9 的20分钟内, 用 Ca2 +敏感荧光染料加载单元格。
- 将10µM Fluo4-AM 添加到 NT 的500µL 中. 从玻璃底菜上取出上清液 (从步骤 5.9)。将包含 Fluo4-AM 的 NT 添加到玻璃底菜中。在室温下孵育混合物20分钟。除去并丢弃上清。使用 NT 500 µL 清洗样品2x。
-
用共焦显微镜可视化 Ca2 +励磁, 如下所示。
- 将玻璃底部的盘子转移到共焦显微镜上, 用40X 放大倍数的显微镜 (激光强度为 5.8%, 激发 488 nm, 发射 515 nm) 可视化 Ca2 +励磁。
- 使用适当的 superfusion 设备将 NT 加热到37摄氏度的单元格灌注。或者, 用显微镜安装的热孵化器保持细胞的温暖。
- 刺激在一个电场的心肌细胞与商用, 显微镜安装刺激电极频率为1赫兹和电流 24 a. 等待1分钟, 允许细胞达到 Ca2 +处理的稳态状态。
- 将扫描线平行于横向轴, 在原子核与随机选取的宏观收缩细胞的边缘之间进行半方向。通过重复扫描获取线扫描图像。
- 使用自由可用的成像软件估计信号强度后立即电刺激 (F0) 整个细胞。在1刺激周期 (F) 的过程中, 在整个细胞中绘制信号强度。除以 (f) (f0) 获得各自的 Ca2 +瞬态。
图 1: 隔离过程的简化流程图.该程序是高度敏感的时间, 直到酶消化的肌细胞完成。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 在隔离之前准备设备.(A) 本小组展示自制的 Langendorff 装置: (1) 带铅的套式反应容器;(2) 带 CB 的套壳反应容器;(3) 3 路旋塞阀;(4) 注射器;(5) 蠕动泵;(6) 加热浸泡;(7) 夹套气泡陷阱;和 (8) 套管和心脏。(B) 本小组展示了为优化工作流程设置插管和器官切除的方法: (1) 100 毫升烧杯, 50 毫升冰冷 CB;(2) 10 毫升带有冰冷 CB 的注射器;(3) 带有冰冷 CB 的培养皿;(4) 光源;(5) 特制套管带插管结 (参见图 3A和3B);(6) 细、弯钳;(7) 组织钳;(8) 细钳, 角度 45°;(9) 腹部手术剪刀;(10) 精细手术剪刀;(11) 4 x 30 克针;(12) 15 克针。(C) 本小组展示了用于共焦成像的显微镜安装设备: (1) 电刺激电极;(2) superfusion 笔;(3) 飞机状态的玻璃底菜;(4) 浸入式铂电刺激电极。(D) 本小组展示了共焦成像的显微镜设置: (1) 共焦显微镜;(2) superfusion 笔;(3) superfusion 缓冲油藏;(4) superfusion 流量调节器;(5) superfusion 加热模块;(6) 计算机工作站;(7) 电刺激器。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 定制设备.(A) 此面板显示操纵的15克套管与鲁尔锁。箭头表示插管节的两个凹痕。(B) 这些都是插管节, 两个双肩结互相放置在一起, 以快速收紧。箭头指示需要收紧结点的位置和顺序。(C) 此面板显示装配式压力控制装置。21克蝶形针被钩成三脚架钳。软管与针的高度保持一致。螺丝顶部打开。蝶形软管的标高可以根据箭头的指示改变, 以改变左心房的腔内压力。(D) 左心房被压控装置刺穿。这张照片显示了一个理想的充气左心房。椭圆标记了上手结的位置。(E) 左心房被压控装置刺穿。这张图片显示一个过度膨胀的左心房, 这将导致低产量的可行的飞机状态。椭圆标记了上手结的位置。请单击此处查看此图的较大版本.
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Representative Results
在21周的年龄, 60–90% 的可行飞机状态 (估计如步骤6.1 所述), 在钙重新适应 (步骤 5.4–5.7), 可以从 ZSF-1 肥胖大鼠的这种方法 (图 4A)。在大鼠, 飞机状态的特点是一个不同的和更异质表型相比, VCMs24,25。图 4B显示了一个人与保存的膜和小节结构, 两个功能完整的细胞的强指标。
获得的飞机状态可以用多种方式进行处理。如图 5所示, 这些细胞可能会被用来研究形态学和/或功能的荧光染料所载。例如, di-8-ANEPPS 被用来描绘心房鼠细胞中的管状系统 (图 5A)。在另一组实验中, 采用线粒体染色的远红色荧光染料 (例如, mitotracker 红 FM) 检测心房重塑中的胞浆线粒体 (图 5B)。如图 5C所示, 与此协议隔离的飞机状态也适用于活细胞 Ca2 +成像, 并显示完整的励磁收缩耦合, 1 赫兹场刺激。所有的图像可用于进一步分析使用的各种算法, 可供研究员6,7 (图 5D)。
图 4: 可行的单细胞 AM 的各自产量.(A) 本小组显示在 NT 重新适应飞机状态1毫米 Ca2 +后, 隔离的收益率. (B) 这个小组显示一个孤立的单细胞心房心肌细胞。小节结构、细胞膜和细胞核明显可见。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 荧光染料对大鼠飞机状态的染色.(A) 本小组展示了用荧光染料 Di8ANNEPS 染色的细胞膜和管状网络。(B) 本小组显示荧光染料 mitotracker-红 FM 染色线粒体. (C) 此面板显示了一个 Ca2 +-励磁的横向线扫描与荧光染料 Fluo4-AM 在一个单一的细胞。箭头指示电刺激, 进行1赫兹. (D) 此面板显示了从面板C获得的 longitudenal Ca2 +瞬变。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在这里, 我们首先描述了一个协议, 从大鼠模型中分离出的单细胞飞机状态, 显示显着心房重塑22。这一过程具有独特的挑战性, 因为过量的脂肪组织可以使手术准备, 以及主动脉插管, 越来越困难。表 2中提供的故障排除指南解决了隔离过程中最常见的问题。
| 问题 | 可能的原因 | 解决 方案 |
| 无流过蝶形软管 | 主动脉插管结不正确闭合 | 收紧前取出脂肪组织 |
| 添加第三插管结与各自的压痕 | ||
| 手拉结, 增加力 | ||
| 堵塞针 | 调整位置到流明 | |
| 用注射器轻轻拉解除阻止 | ||
| 右心房/冠状动脉窦未充气 | 心脏基底不正确闭合 | 带附加节点的块流 |
| 右心房在准备过程中损坏 | 闭合与夹子或结的泄漏 | |
| 差消化/心房不软化 | 通过错误的温度降低酶活性 | 调整温度为37°c |
| 非活性/降解酶 | 取代 | |
| 老/过度纤维化心房 | 增加消化时间 (步骤为 50%) | |
| 损伤的主动脉瓣 | 插管时浅穿透 | |
| 细胞产量差 | 心房过度消化 | 减少消化时间 (在步骤 25%) |
| 通过降低蝶形软管降低腔内压力 | ||
| 心房未消化 | 增加消化时间 (步骤 25%) | |
| 提高蝶形软管的腔内压力 | ||
| 细胞弥散过于激进 | 更温柔 |
表 2: 疑难解答指南.此表显示隔离过程及其各自解决方案的常见问题。
在最近的一项研究中, 我们已经表明, ZFS-1 肥胖大鼠模型显示广泛的心房重塑与增加心房大小22。左心房大小的增加已被确认为舒张功能障碍26的重要预后标志, 并导致微血管血管 rarefication 相对于组织。这导致在隔离过程中通过主动脉逆行灌注来减少消化缓冲的分布, 从而使单细胞隔离在这个模型中特别具有挑战性。其他标志性的特点, 心房重塑, 心房纤维化, 并增加纤维化已显示 ZDF 大鼠-一个大鼠模型的代谢性糖尿病和一个 ZFS1 大鼠的父母菌株27。胶原沉积损害消化酶的功效, 从细胞外基质中解放心肌细胞, 因此需要进一步调整细胞隔离程序28。
压力装置促进隔离效果的机制, 在心房重塑模型中的作用很可能与左心房冠状动脉血流的局部衰减有关。冠状动脉血流的一个主要成分是冠状动脉灌注压力, 它被定义为冠状动脉压与各腔29的终舒张压力之间的梯度。在被描述的过程中, 心脏基地的堵塞导致冠状动脉压力和心脏腔内压力的全球增加。随后穿刺左心房促进局部, 选择性下降的腔内压力在左心房腔。因此, 不仅建立了大的冠状动脉灌注压力梯度, 而且从充血的左心室到左心房的分流消化液也增加了灌注量。
此外, 消化酶的选择对其分离至关重要: 胶原酶 I 和 II 的纯化酶共混物已被证明优于低靶和不纯酶, 如胶原酶30。这种酶不仅允许更高的产量的形态学和功能完整的心肌细胞, 但也最大限度地减少任何聚集的单细胞后, 他们的隔离31。胶原酶的纯化酶与其他高酶或中 thermolysin 含量的混合, 最常用于大鼠心肌隔离。虽然 VCMs 是最好的隔离在更高的浓度, 最好的结果, 心房肌细胞获得 0.195 Wünsch 单位/毫升的浓度, 使用该协议32。
随着大中枢相关 HFpEF 的患病率上升2 , 心房心肌导致心房重塑和心房颤动的临床意义十分密切, 这一领域的研究具有重要的意义。许多新的动物模型为 HFpEF 正在出现33,34和心房重构符合增加的发病率的心房节律紊乱是疾病的标志性特征。该方法允许研究人员从大鼠模型中分离出可行的单心肌细胞, 并进行心房重塑, 以获得极高的产量和保存的机械和电功能。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了 DZHK (德国心血管研究中心)、EKFS (Kröner 费森尤斯基金会、卡尔亨利) 和 BMBF (德国教育部和研究部) 的支持, 以及波黑-Charité临床科学家项目资助由 Charité-Universitätsmedizin 柏林和柏林健康学院 (卡尔亨利)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
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