Summary
Hier beschrijven we een geoptimaliseerd, Langendorff gebaseerde procedure voor de isolatie van eencellige atriale cardiomyocytes van een rat model van metabole syndroom-gerelateerde hartfalen met bewaarde ejectie Fractie. Een handmatige regulering van de intraluminale druk van cardiale Holten is geïmplementeerd om de opbrengst van functioneel intact myocytes geschikt voor excitatie-contractie-koppeling studies.
Abstract
In dit artikel beschrijven we een geoptimaliseerd, Langendorff gebaseerde procedure voor de isolatie van eencellige atriale cardiomyocytes (ACMs) van een rat model van metabool syndroom (MetS)-gerelateerde hartfalen met bewaarde ejectie fractie (HFpEF). De prevalentie van MetS-gerelateerde HFpEF stijgt en atriale hartziekten atriale remodelleren en boezemfibrilleren is gekoppeld zijn klinisch relevant als atriale remodelleren een onafhankelijke voorspeller voor mortaliteit is. Studies met geïsoleerde eencellige cardiomyocytes worden vaak gebruikt als aanvulling op de in vivo bevindingen te bevestigen. Bloedsomloop vaartuig rarefication en interstitiële weefsel fibrose vormen een potentieel beperkende factor voor de succesvolle eencellige isolatie van ACMs uit dierlijke modellen van deze ziekte.
Wij hebben deze kwestie behandeld door gebruik te maken van een apparaat staat handmatig het reguleren van de intraluminale druk van cardiale Holten tijdens de procedure van de isolatie, de opbrengst van morfologisch en functioneel intact ACMs aanzienlijk te verhogen. De verworven cellen kunnen worden gebruikt in een verscheidenheid van verschillende experimenten, zoals de celcultuur en functionele beeldvorming van de Calcium (d.w.z., excitatie-contractie-koppeling).
Wij bieden de onderzoeker met een stapsgewijze protocol, een lijst van geoptimaliseerde oplossingen, grondige instructies ter voorbereiding van de nodige apparatuur en een uitgebreide gids voor probleemoplossing. Terwijl de eerste uitvoering van de procedure zou nogal moeilijk zijn, kan een succesvolle aanpassing de lezer voor het uitvoeren van state-of-the-art ACM isolatie in een rat model van MetS-gerelateerde HFpEF voor een breed spectrum van experimenten.
Introduction
MetS b eschrijving van een cluster van risicofactoren voor diabetes mellitus type 2 en hart-en vaatziekten en een verhoogde arteriële bloeddruk, dyslipidemia (triglyceriden verhoogd en verlaagd van high-density lipoprotein cholesterol), verhoogd vasten glucose en centrale obesitas1. De wereldwijde prevalentie van MetS wordt geschat op 25-30% en de voortdurend stijgende2. HFpEF is een heterogene klinisch syndroom vaak geassocieerd met MetS. De cardiale remodelleren tijdens HFpEF en de voorafgaande fasen (d.w.z., Hypertensieve hartziekte) gaat ook gepaard met een verbouwing van de atria3. Verminderde contractiele functie en structurele veranderingen in de linkerboezem zijn geassocieerd met verhoogde mortaliteit, boezemfibrilleren en nieuwe-onset hartfalen4. Atriale remodelleren wordt gekenmerkt door veranderingen in het ion kanaal functie, Ca2 + homeostase, atriale structuur, fibroblast activering en weefsel fibrose5. Links atriale remodelleren in MetS-gerelateerde HFpEF en de bijbehorende onderliggende pathologische mechanismen zijn nog slecht begrepen en een meer diepgaand onderzoek vereist is. Dierlijke modellen hebben bewezen een waardevol instrument zijn en leiden tot vele ontwikkelingen op het gebied van atriale hartziekten6,,7,,8,9.
Studies met geïsoleerde eencellige cardiomyocytes worden vaak gebruikt als aanvulling op de in vivo bevindingen te bevestigen. Een isolatie, en de mogelijke latere celcultuur, zorgen voor het onderzoek van signalering van trajecten, Ionische kanaal stromingen en excitatie-contractie-koppeling. Cardiomyocytes onder fysiologische omstandigheden, niet verspreiden. De fusie tussen de transcriptionele regulerende sequenties atrial natriuretic factor en een simian 40 grote T virusantigeen in transgene muizen leidde tot de oprichting van de eerste vereeuwigd ACMs, AT-110genoemd. De verdere ontwikkeling van de cellen van de AT-1 gaf aanleiding tot HL-1 cellen, die niet kunnen alleen serieel worden gepasseerd maar ook contract spontaan11. Ze vertonen echter structurele en functionele verschillen in vergelijking met vers geïsoleerde cellen, zoals een minder georganiseerde ultrastructuur, een hoge voorkomen van de ontwikkeling van myofibrils11, en een hyperpolarisatie-geactiveerde innerlijke huidige12. Het isolement van ventriculaire cardiomyocytes (VCM) bij ratten en muizen uit een verscheidenheid van modellen is goed ingeburgerd13,14,15,16,17,18 , 19. in het algemeen de verwijderde hart is gemonteerd op een Langendorff apparatuur en retrogradely met een Ca2 +geperfundeerd-gratis buffer met spijsverteringsenzymen, zoals collagenases en proteasen. Calcium is vervolgens opnieuw op een stapsgewijze manier aan de fysiologische omstandigheden. Hoewel de protocollen die zijn gewijd aan het isolement van ACMs zijn beschikbaar van20,21, als gevolg van de toegenomen fibrose en druk-gerelateerde verschillen, is hun nut in ziekte modellen met atriale remodelleren echter beperkt.
In dit artikel, hebben we een protocol voor de isolatie van atriale eencellige cardiomyocytes van dieren die atriale remodelleert (dat wil zeggen, in het bijzonder voor de ZFS1 rat model voor MetS-gerelateerde HFpEF)22 vertonenuitgevoerd. Bestaande protocollen van de isolatie waren geoptimaliseerd en aangevuld met een eenvoudige, op maat gemaakte apparaat om te controleren en wijzigen van de intraluminale druk van de cardiale Holten, wat leidt tot hogere opbrengsten van morfologisch en functioneel intact cardiomyocytes. Het volgende protocol biedt de onderzoeker met een stapsgewijze gids, een gedetailleerde beschrijving van de op maat gemaakte apparatuur, een lijst van oplossingen, evenals een uitgebreide gids voor probleemoplossing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden goedgekeurd door de lokale ethische Commissie (TVA T0060/15 en T0003-15) en uitgevoerd in overeenstemming met de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren (National Institute of Health, U.S.A.).
Opmerking: Een vereenvoudigd stroomdiagram van de procedure is afgebeeld in Figuur 1.
1. hierbij
- Bereiden de buffers volgens tabel 1.
| Oplossing | PB | CB | DB | SB | S1 | S2 | S3 | NT | |
| Reagens (mM) | |||||||||
| NaCl | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | |
| KCl | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4 | |
| KH2PO4 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | ||
| NB2HPO4 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | ||
| MgSO4 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | ||
| MgCl | 1 | ||||||||
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
| Taurine | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | ||
| Glucose | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| DTB | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| CaCl2 | 1 | 0,01 | 0,125 | 0,25 | 0,5 | 1 | |||
| BSA | 150 | 70 | 70 | 70 | |||||
| Gezuiverde enzyme blend (middellange Thermolysin) | 0,195 Wünsch eenheden/mL | ||||||||
| pH aangepast aan | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | |
| pH aangepast op | 37 ° C | 4 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | |
| pH aangepast met | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH |
Tabel 1: lijst van Buffers. PB: perfusie buffer, die kan worden opgeslagen voor 3 dagen bij 4 ° C (300 mL per dier). CB: cannulation buffer, die kan worden opgeslagen voor 3 dagen bij 4 ° C (200 mL per dier). DB: spijsvertering buffer, die moet worden gebruikt binnen de dag (40 mL per dier). SB: stoppen buffer, die moet worden gebruikt binnen de dag (2 mL per dier). S1: Stap 1 buffer, die moet worden gebruikt binnen de dag (2 mL per dier). S2: Stap 2 buffer, die moet worden gebruikt binnen de dag (2 mL per dier). S3: Stap 3 buffer, die moet worden gebruikt binnen de dag (2 mL per dier). NT: normale Tyrode, die moet worden gebruikt binnen de dag (50 mL per dier).
-
Bereiden de Langendorff apparatuur (figuur 2A).
- Spoelen van het systeem met 100 mL 70% ethanol, gevolgd door 2 flushes van 100 mL gedestilleerd water. Vul het systeem met 200 mL perfusie buffer (PB).
- Het debiet van de peristaltische pomp ingesteld op 3 mL/min.
- Kalibreren van de temperatuur van de PB verlaten het apparaat Langendorff tot 39 ° C.
- Plaats de op maat gemaakte canule [16 G, 25 mm lange, scherpe tip verwijderd (figuur 3A)] bovenop de Langendorff-apparaat en start van de stroom. Zet de verwarming-module en de waarde van de module verwarming te bereiken van de gewenste temperatuur van de PB op het puntje van de canule aanpassen. Zodra de temperatuur kalibratie is voltooid, verplaatst u de op maat gemaakte canule naar de spuit gebruikt voor de cannulation (figuur 2B).
- Het bedieningsorgaan van druk (Figuur 3 c) naast de Langendorff systeem voor te bereiden. De naald van de vlinder op de klem statief monteren en bereiden 3 blokkerende knopen.
Opmerking: Collagenase enzymactiviteit varieert met de temperatuur. Later in de procedure is een temperatuurbewaking van de linkerboezem, evenals een dynamische aanpassing daarvan, vereist.
- De apparatuur voor de excisie van het orgel en de cannulation volgens figuur 2Binstellen. Vul het bekerglas, de spuit en de petrischaal met een ijskoude cannulation buffer (CB) en de knopen van de cannulation voor te bereiden.
-
Heparinize de rat met 500 I.E. van heparine per 100 g lichaamsgewicht van de rat als volgt.
- Zet 2 mL 100% Isofluraan in een verdoving inductie kamer geschikt voor knaagdieren. Overdracht van de 21 weken oude ZFS-1 zwaarlijvige rat uit de kooi aan de inductie-kamer. Laat de rat diep anesthesie, aangegeven door een vertraging van de ademhaling tot de helft van zijn oorspronkelijke frequentie invoeren.
- Verwijder de rat uit de zaal inductie. Injecteren 500 I.E. van heparine per 100 g lichaamsgewicht van de rat in het buikvlies met behulp van een injectiespuit heparine.
- De rat terug in zijn kooi en zorgen voor het om wakker te worden.
Opmerking: Het is niet nodig om de steriliteit tijdens stap 1.4. Wacht 20 min voordat u verdergaat met de volgende stap. Een onvolledige antistolling kan leiden tot bloed stremmen, wat leidt tot micro-infarcten, die aanzienlijk de kwaliteit en opbrengst van geïsoleerde cardiomyocytes beïnvloeden kunnen.
2. hart-voorbereiding
- Zet 2 mL 100% Isofluraan in een verdoving inductie kamer geschikt voor knaagdieren. Overdracht van de 21 weken oude ZFS-1 zwaarlijvige rat uit de kooi aan de inductie-kamer. Laat de rat diep anesthesie, aangegeven door een vertraging van de ademhaling tot de helft van zijn oorspronkelijke frequentie invoeren.
- Het dier euthanaseren door onthoofding met behulp van een guillotine geschikt voor knaagdieren. De ledematen van de rat op een polystyreen ondergrond fixeren. Opheffen en verwijderen van de huid die betrekking hebben op het proces van de xiphoid met chirurgische scharen. Het buikvlies onder de rib kooien aan beide kanten open en bloot van het middenrif.
- Open het middenrif door het maken van een sneetje langs de voorste boog met fijne schaar. Doorsnijden de ribben aan beide zijden langs de linea mediaclavicularis tot het clavicular bot, met behulp van chirurgische schaar, het mediastinum in situbloot te stellen.
- Verwijder de longen aan de distale uiteinden van de hila met fijne schaar. Knip de zwezerik de aortaboog bloot te stellen.
- Knijp de basis van het hart met behulp van Tang en trek voorzichtig naar beneden naar de staart van het dier. Dwars door de aorta met behoud van een trek op het hart, waardoor een 5 mm lange deel van de aorta gekoppeld aan het hart. Breng snel het hart in de ijskoude CB van 50 mL in het bekerglas van 50 ml (figuur 2B).
Opmerking: Tijdens stappen 2.5 – 3.3, het hart is effectief in ischemische voorwaarden. Vermijd meer dan een totaal van 3 min voor onderstaande stappen in volgorde niet te beschadigen de cardiomyocytes.
3. cannulation
- Wacht ongeveer 10 s voor het hart te koelen en grijpen contracties. Breng het hart in een petrischaal met 50 mL vers, ijskoude CB. Verwijder voorzichtig het vetweefsel rond de aorta met behulp van Tang en schaar.
- Plaats de op maat gemaakte canule (dezelfde als gebruikt in stap 1.2.3), die is gekoppeld aan de 10 mL spuit gevuld met ijskoude CB, 3 mm in de aorta. Het fixeren van de aorta naar de canule door koppelverkoop van een van de twee cannulation knopen (figuur 3B) in de inspringing proximale naar het uiteinde van de canule.
Opmerking: Wees voorzichtig niet te beschadigen de aortaklep door een penetratie met de canule. - Voorzichtig spoelen de aorta met 5 mL ijskoud CB met behulp van de spuit aangesloten op de canule totdat er geen meer bloed is zichtbaar in de kransslagaders. Zachtjes massage van de linkerboezem met pincet en spuit de resterende 5 mL van CB, rekening houdend met eventuele overtollige bloed worden verwijderd uit de holte in de petrischaal.
- Leg de tweede cannulation knoopje (hechtdraad: USP 3/0, zijde) in de inspringing distale naar het uiteinde van de canule. Ontkoppel de canule met het bijgevoegde hart uit de spuit. Monteer de canule met het bijgevoegde hart aan de Langendorff met behulp van een geschikte adapter.
Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van verhoogde druk in de ventriculaire holte tijdens de perfusie bij het Langendorff apparaat. De extra cannulation-knoop is vereist om deze druk door het vermijden van lekkages buffer anterograde via de aorta.
4. Druk manipulatie en spijsvertering
- Start de peristaltische pomp van het destillatietoestel Langendorff tot de perfusie van het cardiale weefsel met PB. Leg een knoopje bovenhands dubbele (hechtdraad: USP 3/0, zijde) rond de basis van het hart, met uitzondering van de aorta. Herhaal deze stap tot een inflatie van de rechter en linker atrium, evenals de coronaire sinus, is opgemerkt.
- Aanprikken van het atrium met de naald van de vlinder van het bedieningsorgaan van de druk (figuur 3D) en laat het atrium te laten leeglopen. Het manipuleren van de intraluminale druk van het atrium door het aanpassen van de hoogte van de slang van de vlinder. Houden van het atrium iets opgeblazen in de rest van de procedure; controleren en dienovereenkomstig aan te passen.
Opmerking: Deze stap moet snel worden uitgevoerd, zoals een langdurige inflatie van de linkerboezem in de dood van de cardiomyocyte resulteren zal. - Meet de geschatte temperatuur van de linkerboezem door plaatsing van een temperatuursonde tussen de linkerboezem en het linkerventrikel. De temperatuur van de Langendorff module dienovereenkomstig Verwarming, gericht op een geschatte temperatuur van 37 ° C van de linkerboezem aanpassen.
- Perfuse het hart met PB voor een totaal van 3 min.
- De perfusie overschakelen naar een buffer van de spijsvertering (DB) voor ongeveer 14 – 18 min.
Opmerking: De vertering is voltooid wanneer de linker atriale structuur wordt samengevouwen en wordt het weefsel een melkachtig textuur verwerft. - Knijp het atrium met pincet en een lichte trek te vaardigen. Verwijderen van de linkerboezem met fijne schaar en breng het atrium in een grote wegen boot met 2 mL buffer (SB), volledig ondergedompeld het weefsel te stoppen.
- Beschikken over het resterende cardiale weefsel volgens de richtlijnen van het laboratorium waar de procedure wordt uitgevoerd.
5. cel verwerking en Calcium re-aanpassing
- Mince de atriale weefsel in kleine stukjes van ongeveer 2 x 2 mm met behulp van fijn schaar.
- Het weefsel verspreiden door een zachte zuigkracht en uitwerpen van het weefsel stukjes met behulp van een precisiepipet overdracht. Herhaal deze procedure voor ongeveer 5 minuten totdat een macroscopische dissociatie van het weefsel kan worden waargenomen.
Opmerking: Voorkomen luchtbelletjes tijdens deze stap als het blootstellen van de cellen in de lucht zal resulteren in de dood van de cardiomyocyte. - De cellen overbrengen in een conische tube van 15 mL. Laat de stukjes weefsel te vestigen voor 30 s. overdracht de bovendrijvende substantie in een ander conische tube van 15 mL. De cellen gedurende 15 minuten bezinken toestaan.
- Verwijderen en verwijder het supernatant. Voeg toe 2 mL stap 1 buffer (Zie tabel 1). Laat de cardiomyocytes gedurende 10 minuten bezinken.
Opmerking: De verwijderde supernatans omvat ook fibroblasten en endotheliale cellen. Raadpleeg andere protocollen indien het gewenst is om deze cellen gebruiken voor de experimenten14,23. De pellet bevat meestal atriale cardiomyocytes, die kan worden bevestigd door de lichte microscopie. De microscopische kenmerken van atriale cardiomyocytes worden in stap 6.1 besproken. - Verwijderen en verwijder het supernatant. Voeg toe 2 mL buffer van stap 2. Laat de cardiomyocytes gedurende 10 minuten bezinken.
- Verwijderen en verwijder het supernatant. Voeg toe 2 mL buffer van stap 3. Laat de cardiomyocytes gedurende 10 minuten bezinken.
- Verwijderen en verwijder het supernatant. Voeg 250 µL van normale Tyrode (NT) met 1 mM Ca2 +.
- Breng 50 µL van de normale Tyrode met atriale cardiomyocytes op een schotel van glazen-bodem, die is bedekt met 25% laminin (en toegestaan om te drogen vooraf). Laat de cardiomyocytes gedurende 10 minuten bezinken.
- Vul een glazen-bodem-schotel met 500 µL van NT met 1 mM CaCl2.
6. functionele evaluatie van excitatie-contractie-koppeling
- Evaluatie van de morfologie van de cel en de levensvatbaarheid onder een lichte Microscoop met behulp van een 20 X vergroting (figuur 4A en 4B). Willekeurig ongeveer 100 cellen selecteren en classificeren van hen als levensvatbare of niet haalbaar zijn om te kunnen inschatten van de levensvatbaarheid van de cel isolatie procedure.
Opmerking: Levensvatbare cellen worden gekenmerkt door symmetrische Sarcomeer structuur, het ontbreken van membraan-blebs, en de vorm van een staaf. -
Laden van de cellen met de Ca2 +-gevoelige fluorescente kleurstof binnen 20 min van de voltooiing van stap 5,9.
- Toevoegen van 10 µM Fluo4-AM tot 500 µL van NT. Verwijder de bovendrijvende substantie van de glazen-bodem schotel (uit stap 5,9). Voeg de NT met Fluo4-AM op de dish glazen-bodem. Laat het mengsel gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur inwerken. Verwijderen en verwijder het supernatant. Het wassen van het monster 2 x met behulp van 500 µL van NT.
-
Visualiseer de Ca2 +-excitatie met een confocal microscoop als volgt.
- De glazen-bodem schotel overbrengen in een confocal microscoop en visualiseer de Ca2 +-excitatie met een confocal microscoop (laser intensiteit op 5,8%, excitatie op 488 nm, emissie op 515 nm) met behulp van een 40 X vergroting.
- Perfuse de cellen met NT verwarmd tot 37 ° C met behulp van een geschikte superfusion inrichting. Als alternatief, houd de cellen warm met behulp van een Microscoop gemonteerde warmte incubator.
- Stimuleren de cardiomyocytes in een elektrisch veld met verkrijgbare, Microscoop gemonteerde stimulator elektroden op een frequentie van 1 Hz en een elektrische stroom van 24 A. wachten voor 1 min om de cellen te bereiken van een stationaire toestand van Ca2 + behandeling.
- Plaats de scanlijn evenwijdig aan de transversale as, halverwege tussen de kern en de rand van een willekeurig geselecteerde, macroscopisch verdragsluitende cel. Verwerven lijn scan beelden door repetitieve scannen.
- Gebruik vrij verkrijgbare imagingsoftware de signaalsterkte onmiddellijk voordat een elektrische stimulatie (F0) schatting maken van de gehele cel. In de loop van 1 stimulatie cyclus (F) de signaalsterkte worden uitgezet over de gehele cel. Verdelen (F) door (F0) te verkrijgen de respectieve Ca2 + voorbijgaande.
Figuur 1: vereenvoudigde stroomdiagram van de isolatie procedure. De procedure is zeer tijd-gevoelige totdat de enzymatische vertering van de myocytes is voltooid. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: opstelling van de apparatuur voordat het isolement. (A) dit paneel toont een self-made Langendorff apparaat: (1) een dubbelwandige reactievat met PB; (2) een dubbelwandige reactievat met CB; (3) een 3-weg-afsluiter; (4) een spuit; (5) een peristaltische pomp; (6) een verwarming onderdompeling; (7) een dubbelwandige waterventiel; en (8) de canule en het hart. (B) dit paneel toont de set-up voor de cannulation en orgel excisie voor een geoptimaliseerde workflow: (1) een bekerglas van 100 mL met 50 mL ijskoud CB; (2) een 10 mL spuit met ijskoude CB; (3) een petrischaal met ijskoude CB; (4) een lichtbron; (5) de op maat gemaakte canule met een cannulation knoop (Zie ook figuur 3A en 3B); (6) fijne, gekromde pincet; (7) weefsel pincet; (8) fijne pincet, schuin 45°; (9) abdominale chirurgische schaar; (10) fijne chirurgische schaar; (11) 4 x 30 G naalden; en (12) een 15 G naald. (C) dit paneel toont de Microscoop gemonteerde apparatuur voor de confocal beeldvorming: (1) elektrische Spierstimulator elektroden; (2) een superfusion pen; (3) een glazen-bodem schotel met de ACMs; en (4) ondergedompeld platina elektrische Spierstimulator elektroden. (D) dit paneel toont de Microscoop set-up voor de confocal beeldvorming: (1) de confocal microscoop; (2) een superfusion pen; (3) een superfusion buffer reservoir; (4) een superfusion stroom regulator; (5) een superfusion verwarming module; (6) een computer werkstation; en (7) een elektrische stimulator. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: op maat gemaakte uitrusting. (A) dit paneel toont de gemanipuleerde 15 G canule met een Luer-lock. De pijlen geven aan twee inkepingen voor de knopen van de cannulation. (B) Dit zijn de cannulation knopen, twee dubbele bovenhands knopen voor snelle aanscherping bovenop elkaar geplaatst. De pijlen geven aan waar en in welke volgorde de knoop moet worden aangescherpt. (C) dit paneel toont het bedieningsorgaan geassembleerde druk. Een naald 21 G vlinder is aangesloten op een statief klem. De slang wordt gehouden op dezelfde hoogte als de naald. De top van de schroef wordt geopend. De hoogte van de vlinder slang kan worden gewijzigd zoals aangegeven door de pijlen om te veranderen van de intraluminale druk van de linkerboezem. (D) het linker atrium is doorboord met het bedieningsorgaan van de druk. Deze foto toont een ideaal opgeblazen linkerboezem. De ellips markeert de plaatsing van de bovenhands knoop. (E) het linker atrium is doorboord met het bedieningsorgaan van de druk. Deze foto toont een overdreven opgeblazen linkerboezem, die in een lagere opbrengst van levensvatbare ACMs resulteren zal. De ellips markeert de plaatsing van de bovenhands knoop. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Op 21 weken leeftijd, kunnen 60-90% van levensvatbare ACMs (geschat zoals beschreven in stap 6.1), na de kalk opnieuw aanpassing (stap 5.4 – 5.7), worden geïsoleerd uit ZSF-1 zwaarlijvige ratten door deze methode (figuur 4A). Bij ratten, worden ACMs gekenmerkt door een andere en meer heterogene fenotype t.o.v. VCMs24,25. Figuur 4B toont een individuele ACM met bewaarde membranen en structuur van de Sarcomeer, beide sterke indicatoren van een functioneel integraal cel.
De verworven ACMs kunnen worden verwerkt in een verscheidenheid van manieren. Zoals wordt geïllustreerd in Figuur 5, kunnen de cellen worden geladen met fluorescente kleurstoffen gebruikt bij het bestuderen van de morfologie en/of functie. Bijvoorbeeld, werd di-8-ANEPPS gebruikt om af te bakenen de tubulaire systeem in een atriale rat cel (figuur 5A). In een andere reeks experimenten, is veel rood-fluorescentie mitochondriën-kleuring wordt kleurstof (bijvoorbeeld, mitotracker-rood-FM) aangewend om te detecteren cytosolische mitochondriën (figuur 5B) in atriale remodelleren. Zoals blijkt uit figuur 5C, ACMs, geïsoleerd met dit protocol zijn ook geschikt voor live-cel Ca2 + imaging en intact excitatie-contractie koppeling met een 1 Hz Toon veld-stimulatie. Alle afbeeldingen kunnen worden gebruikt voor verdere analyse met behulp van een verscheidenheid van algoritmen voor de onderzoeker6,7 (figuur 5D) beschikbaar.
Figuur 4: respectieve opbrengst van levensvatbare, eencellige AM. (A) dit paneel toont het rendement van een isolatie na de hernieuwde aanpassing van ACMs tot 1 mM Ca2 + in NT. (B) dit paneel toont een geïsoleerde, eencellige atriale cardiomyocyte. De structuur van de Sarcomeer, celmembraan en kern zijn duidelijk zichtbaar. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: kleuring van rat ACMs met fluorescente kleurstoffen. (A) dit paneel toont de kleuring van een celmembraan en tubulaire netwerk met de fluorescente kleurstof Di8ANNEPS. (B) dit paneel toont de kleuring van mitochondriën met de fluorescente kleurstof mitotracker-rood-FM. (C) dit paneel toont de transversale lijn-scan van een Ca2 +-excitatie met de fluorescente kleurstof Fluo4-AM over een enkele cel. De pijlen geven de elektrische stimulatie, uitgevoerd op 1 Hz. (D) dit paneel de longitudenal Ca2 + transiënten afgeleid van deelvenster C toont. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier, we voor het eerst beschreven een protocol voor de isolatie van eencellige ACMs van een rat model van MetS-gerelateerde HFpEF die toont atriale remodelleert22gemarkeerd. De procedure is een unieke uitdaging als overmatig vetweefsel de chirurgische voorbereiding, evenals de cannulation van de aorta, steeds moeilijker maken kan. De gids voor probleemoplossing gegeven in tabel 2 adressen de meest voorkomende problemen van de isolatie-procedure.
| Probleem | Mogelijke oorzaak | Oplossing |
| Geen stroom door vlinder slang | Ongepaste sluiting van de aorta met de cannulation knopen | Verwijderen vetweefsel voordat aanscherping |
| 3e cannulation knoop met respectieve inspringing toevoegen | ||
| Trek de knoop met de hand voor meer kracht | ||
| Geblokkeerde naald | Passen, positie in het lumen | |
| Deblokkeren door zachte pull met spuit | ||
| Juiste atrium / coronaire sinus niet opgeblazen | Ongepaste sluiting van de hart-base | Blok stroom met extra knopen |
| Juiste atrium beschadigd tijdens de voorbereiding | Sluit lekkage met clips/knopen | |
| Slechte spijsvertering / atrium doet niet verzachten | Verminderde enzymactiviteit door verkeerde temperatuur | Aanpassen van temperatuur tot 37 ° C |
| Enzym inactief/afgebroken | Vervangen | |
| Oude/overdreven fibrotische atrium | Spijsvertering tijd verhogen (in stappen van 50%) | |
| Beschadigde aortaklep | Ondiepe penetratie tijdens cannulation | |
| Arme cel opbrengst | Atrium overdreven verteerd | Spijsvertering tijd verlagen (in stappen van 25%) |
| Verminderen van de intraluminale druk door het verlagen van de vlinder-slang | ||
| Atrium onder-verteerd | Verhoog spijsvertering tijd (in stappen van 25%) | |
| Verhoging van de intraluminale druk door het verhogen van de vlinder-slang | ||
| Cel dispersie te agressief | Meer zacht |
Tabel 2: Troubleshooting guide. Deze tabel toont de problemen van de isolatie-procedure en hun respectieve oplossingen.
In een recente studie, hebben wij aangetoond dat het model van de zwaarlijvige rat ZFS-1 vertoont uitgebreide atriale remodelleren met een toegenomen atriale omvang22. Een toename van de linker atriale grootte is erkend als een belangrijke voorspellende marker voor diastolische dysfunctie26 en veroorzaakt een rarefication van de microvasculaire vaartuigen ten opzichte van het weefsel. Dit leidt tot een verminderde verdeling van de spijsvertering buffer via de retrograde perfusie van de aorta tijdens de isolatie-procedure, waardoor het isolement van de eencellige in dit model bijzonder uitdagend. Andere functies van de hallmark atriale remodelleren, atriale fibrose en toegenomen fibrose gebleken voor ZDF ratten — een rat-model voor metabole diabetes en een stam van de ZFS1 ratten27. Collageen deposito's afbreuk doen aan de doeltreffendheid van de spijsverteringsenzymen te bevrijden van de cardiomyocytes uit de extracellulaire matrix, daarom vereisen verdere aanpassingen van de cel isolatie procedure28.
Het mechanisme waarmee het apparaat druk de verbeterde isolatie resultaten in dit model aan het remodelleren van atriale vergemakkelijkt is waarschijnlijk gerelateerd aan een gelokaliseerde demping van de coronaire bloedstroom van de linkerboezem. Een belangrijke component van de coronaire doorbloeding is coronaire perfusie druk, die is gedefinieerd als het verloop tussen de coronaire druk en de einde-diastolische druk van de respectieve holte29. Tijdens de beschreven procedure leidt een blokkade van de basis van het hart tot een wereldwijde verhoging van coronaire druk en intraluminale druk in het hart. De daarop volgende punctie van de linkerboezem vergemakkelijkt een lokale, selectieve daling van de intraluminale druk in de linker atriale holte. Dus niet alleen een grote coronaire perfusie drukverschil is gevestigd, maar het volume van de perfusie wordt ook verhoogd met de oplossing van de omgeleide spijsvertering van het overbelaste linkerventrikel naar de linkerboezem.
Bovendien, de keuze van de spijsvertering enzymen is van cruciaal belang voor de isolatie van de ACM: gezuiverd enzym mengsels van collagenase I en II is gebleken te zijn superieur aan minder gerichte en minder zuivere enzymen als collagenases30. Dit enzym doet niet alleen voor een hoger rendement van morfologisch en functioneel intact cardiomyocytes maar ook minimaliseert alle samendoen van afzonderlijke cellen na hun isolement31. Gezuiverde enzym combineert van collagenases met een extra hoge dispase of middellange thermolysin inhoud worden meestal gebruikt voor rat cardiomyocyte isolatie. Terwijl VCMs best geïsoleerd bij hogere concentraties zijn, de beste resultaten van atriale myocytes werden verkregen met een concentratie van 0.195 Wünsch eenheden/mL met behulp van dit protocol32.
De prevalentie van MetS-gerelateerde HFpEF stijgt2 en atriale hartziekten toonaangevende aan atriale remodelleren en atriale fibrillatie zijn klinisch relevant, onderzoek op dit gebied is van cruciaal belang. Veel nieuwe dierlijke modellen voor HFpEF zijn33,34 in opkomst en atriale remodelleren in overeenstemming met een verhoogde incidentie van atriale ritme stoornissen zijn waarmerk kenmerken van de ziekte. De beschreven methode kan onderzoekers te isoleren van levensvatbare interne cardiomyocytes van rat modellen met atriale remodelleren voor een verdere studie met een uitzonderlijk hoge opbrengst en mechanische en elektrische functie behouden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door de DZHK (Duitse centrum voor cardiovasculair onderzoek, DB), de EKFS (Else-Kröner-Fresenius Stiftung, F.H.), en door de goedgekeurd (Duitse ministerie van onderwijs en onderzoek), evenals de BIH-Charité klinische wetenschapper programma gefinancierd door de Charité - Universitätsmedizin Berlijn en de Berlijnse Institute of Health (F.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
- Alberti, K. G., et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).
- International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention. IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome. , Available from: https://www.idf.org/e-library/consensus-statements/60-idfconsensus-worldwide-definitionof-the-metabolic-syndrome.html (2006).
- Melenovsky, V., et al. Left atrial remodeling and function in advanced heart failure with preserved or reduced ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 8 (2), 295-303 (2015).
- Goette, A., et al. EHRA/HRS/APHRS/SOLAECE expert consensus on atrial cardiomyopathies: definition, characterization, and clinical implication. EP Europace. 18 (10), 1455-1490 (2016).
- Schotten, U., Verheule, S., Kirchhof, P., Goette, A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiological Reviews. 91 (1), 265-325 (2011).
- Hohendanner, F., DeSantiago, J., Heinzel, F. R., Blatter, L. A. Dyssynchronous calcium removal in heart failure-induced atrial remodeling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (6), H1352-H1359 (2016).
- Hohendanner, F., et al. Inositol-1,4,5-trisphosphate induced Ca2+ release and excitation-contraction coupling in atrial myocytes from normal and failing hearts. The Journal of Physiology. 593 (6), 1459-1477 (2015).
- Tada, Y., et al. Role of mineralocorticoid receptor on experimental cerebral aneurysms in rats. Hypertension. 54 (3), 552-557 (2009).
- Iwasaki, Y. K., et al. Atrial fibrillation promotion with long-term repetitive obstructive sleep apnea in a rat model. Journal of the American College of Cardiology. 64 (19), 2013-2023 (2014).
- Field, L. J. Atrial natriuretic factor-SV40 T antigen transgenes produce tumors and cardiac arrhythmias in mice. Science. 239 (4843), 1029-1033 (1988).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Sartiani, L., Bochet, P., Cerbai, E., Mugelli, A., Fischmeister, R. Functional expression of the hyperpolarization-activated, non-selective cation current I(f) in immortalized HL-1 cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 545 (Pt 1), 81-92 (2002).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Gunduz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50289 (2013).
- Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (91), e51109 (2014).
- Thum, T., Borlak, J. Isolation and cultivation of Ca2+ tolerant cardiomyocytes from the adult rat: improvements and applications. Xenobiotica. 30 (11), 1063-1077 (2000).
- Egorova, M. V., Afanas'ev, S. A., Popov, S. V. A simple method for isolation of cardiomyocytes from adult rat heart. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 140 (3), 370-373 (2005).
- Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments. (92), e51823 (2014).
- Hohendanner, F., et al. Cellular mechanisms of metabolic syndrome-related atrial decompensation in a rat model of HFpEF. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 115, 10-19 (2017).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), e2033 (2010).
- Bootman, M. D., Higazi, D. R., Coombes, S., Roderick, H. L. Calcium signalling during excitation-contraction coupling in mammalian atrial myocytes. Journal of Cell Science. 119 (Pt 19), 3915-3925 (2006).
- Smyrnias, I., et al. Comparison of the T-tubule system in adult rat ventricular and atrial myocytes, and its role in excitation-contraction coupling and inotropic stimulation. Cell Calcium. 47 (3), 210-223 (2010).
- Pritchett, A. M., et al. Diastolic dysfunction and left atrial volume: a population-based study. Journal of the American College of Cardiology. 45 (1), 87-92 (2005).
- Linz, D., et al. Cathepsin A mediates susceptibility to atrial tachyarrhythmia and impairment of atrial emptying function in Zucker diabetic fatty rats. Cardiovascular Research. 110 (3), 371-380 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Deel, E. D., et al. In vitro model to study the effects of matrix stiffening on Ca(2+) handling and myofilament function in isolated adult rat cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 595 (14), 4597-4610 (2017).
- Wuensch, E., Heidrich, H. G. [On the Quantitative Determination of Collagenase]. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für physiologische Chemie. 333, 149-151 (1963).
- Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
- Horgan, S., Watson, C., Glezeva, N., Baugh, J. Murine models of diastolic dysfunction and heart failure with preserved ejection fraction. Journal of Cardiac Failure. 20 (12), 984-995 (2014).
