Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Isolering af atrieflimren Cardiomyocytes fra en rotte Model af metabolisk syndrom-relaterede hjertesvigt med bevarede uddrivningsfraktion

Published: July 26, 2018 doi: 10.3791/57953
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Internal Medicine and Cardiology, Charité University Medicine, 2German Center for Cardiovascular Research (DZHK)

Summary

Her, beskriver vi en optimeret, Langendorff-baseret procedure til isolering af enkelt celle atrieflimren cardiomyocytes fra en rotte model af metabolisk syndrom-relaterede hjertesvigt med bevarede uddrivningsfraktion. En manuel regulering af intraluminal pres af hjertets hulrum er gennemført for at give funktionelt intakt myocytes egnet til magnetisering sammentrækning kobling undersøgelser.

Abstract

I denne artikel vil vi beskrive en optimeret, Langendorff-baseret procedure til isolering af enkelt celle atrieflimren cardiomyocytes (ACMs) fra en rotte model af metabolisk syndrom (MetS)-relaterede hjertesvigt med bevarede uddrivningsfraktion (HFpEF). Forekomsten af MetS-relaterede HFpEF er stigende, og atrieflimren cardiomyopatier forbundet med atrieflimren remodellering og atrieflimren er klinisk meget relevante som atrial remodellering er en uafhængig prædiktor for dødelighed. Undersøgelser med isolerede encellede cardiomyocytes bruges ofte til at bekræfte og supplere i vivo resultater. Kredsløbssygdomme fartøj rarefication og interstitielle væv fibrose udgør et potentielt begrænsende faktor for succesfuld encellede isolation ACMs fra dyremodeller for denne sygdom.

Vi har behandlet dette spørgsmål ved at ansætte en enhed i stand til manuelt regulering intraluminal presset af hjertets hulrum under proceduren isolation væsentligt øge udbyttet af morfologisk og funktionelt intakt ACMs. De erhvervede celler kan bruges i en række forskellige eksperimenter, som cellekultur og funktionelle Calcium imaging (dvs., excitation sammentrækning kobling).

Vi give forskeren en trinvis protokol, en liste over optimerede løsninger, grundig vejledning til at forberede det nødvendige udstyr, og en omfattende fejlfindingsvejledning. Mens den indledende implementering af proceduren kan være temmelig vanskeligt, vil en vellykket tilpasning tillader læseren at udføre state-of-the-art ACM isolering i en rotte model af MetS-relaterede HFpEF for et bredt spektrum af eksperimenter.

Introduction

MetS beskriver en klynge af risikofaktorer for diabetes mellitus type-2 og hjerte-kar-sygdom og omfatter et øget arterielt blodtryk, dyslipidæmi (rejst triglycerider og sænket high-density lipoprotein kolesterol), øget fastende glukose, og centrale fedme1. Den verdensomspændende forekomsten af MetS skønnes for at være 25-30% og konstant stigende2. HFpEF er en heterogene klinisk syndrom ofte forbundet med MetS. Den kardiale remodeling under HFpEF og dens foregående faser (dvs., hypertensive hjertesygdomme) er også ledsaget af en ombygning af atria3. Reduceret kontraktile funktion og strukturelle ændringer af venstre atrium har været forbundet med øget dødelighed, atrieflimren og ny-debut hjertesvigt4. Atrieflimren remodellering er karakteriseret ved ændringer i ion-kanal funktion, Ca2 + homøostase, atrieflimren struktur, fibroblast aktivering og væv fibrose5. Venstre atriale remodeling i MetS-relaterede HFpEF og dens underliggende patologiske mekanismer er stadig dårligt forstået og kræver en yderligere grundig undersøgelse. Dyremodeller har vist sig at være et værdifuldt værktøj og føre til mange fremskridt inden for atrieflimren cardiomyopatier6,7,8,9.

Undersøgelser med isolerede encellede cardiomyocytes bruges ofte til at bekræfte og supplere i vivo resultater. En isolation, og den potentielle efterfølgende cellekultur, mulighed for undersøgelse af signalering veje, ionisk kanal strømninger og excitation sammentrækning kobling. Fysiologisk betingelser, cardiomyocytes ikke formere. Fusion mellem transkriptionel regulering sekvenser af en atrial natriuretic faktor og en simian 40 store T virusantigen i Transgene mus førte til oprettelsen af de første udødeliggjort ACMs, navnet på-110. Videreudvikling af i-1 celler gav anledning til HL-1 celler, der ikke kun være seriefremstillede passaged men også kontrakt spontant11. De viser imidlertid strukturelle og funktionelle forskelle i forhold til frisk isolerede celler, såsom en mindre organiseret ultrastruktur, en høj forekomst af udvikling af myofibrils11og en hyperpolarisering-aktiveret indad nuværende12. Isolering af ventrikulær cardiomyocytes (VCM) i rotter og mus fra en række forskellige modeller er veletableret13,14,15,16,17,18 , 19. generelt, skåret hjertet er monteret på en Langendorff apparatur og retrogradely perfunderet med en Ca2 +-gratis buffer indeholdende fordøjelsesenzymer, såsom collagenases og proteaser. Calcium er derefter genindført i en trinvis måde de fysiologiske forhold. Men selv om protokollerne dedikeret til isolering af ACMs er tilgængelige20,21, på grund af øget fibrose og pres-relaterede forskelle, deres anvendelighed i sygdomsmodeller med atrieflimren remodeling er begrænset.

I denne artikel, har vi implementeret en protokol til isolering af atrieflimren encellede cardiomyocytes fra dyr, der udviser atrieflimren remodeling (dvs, især for den ZFS1 rotte model for MetS-relaterede HFpEF)22. Eksisterende isolering protokoller blev optimeret og suppleret med en enkel, custom-made enhed til at kontrollere og ændre intraluminal presset af hjertets hulrum, fører til højere udbytter af morfologisk og funktionelt intakt cardiomyocytes. Følgende protokol giver forsker med en trinvis guide, en detaljeret beskrivelse af specialfremstillet udstyr, en liste over løsninger, samt en omfattende fejlfindingsvejledning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter blev godkendt af det lokale etiske udvalg (TVA T0060/15 og T0003-15) og udført i overensstemmelse med retningslinjerne for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (National Institute of Health, U.S.A.).

Bemærk: En forenklet rutediagram af proceduren er vist i figur 1.

1. prearrangements

  1. Forberede buffere i henhold til tabel 1.
Løsning PB CB DB SB S1 S2 S3 NT
Reagens (mM)
NaCl 135 135 135 135 135 135 135 135
KCl 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4
KH2PO4 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
Na2HPO4 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
MgSO4 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2
MgCl 1
HEPES 10 10 10 10 10 10 10 10
Taurin 30 30 30 30 30 30 30
Glukose 10 10 10 10 10 10 10
BDM 10 10 10 10 10 10 10
CaCl2 1 0,01 0,125 0,25 0,5 1
BSA 150 70 70 70
Renset enzym blend (medium Thermolysin) 0.195 Wünsch enheder/mL
pH justeret til 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4
pH justeret på 37 ° C 4 ° C 37 ° C 37 ° C 37 ° C 37 ° C 37 ° C 37 ° C
pH justeret med NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH

Tabel 1: liste over buffere. PB: perfusion buffer, som kan lagres i 3 dage ved 4 ° C (300 mL pr. dyr). CB: cannulation buffer, som kan lagres i 3 dage ved 4 ° C (200 mL pr. dyr). DB: fordøjelse buffer, som skal bruges samme dag (40 mL pr. dyr). SB: stoppe buffer, som har anvendt i dag (2 mL pr. dyr). S1: Trin 1 buffer, som skal bruges samme dag (2 mL pr. dyr). S2: Trin 2 buffer, som skal bruges samme dag (2 mL pr. dyr). S3: Trin 3 buffer, som skal bruges samme dag (2 mL pr. dyr). NT: normal Tyrode, som skal bruges samme dag (50 mL pr. dyr).

  1. Forberede Langendorff apparater (figur 2A).
    1. Skylle systemet med 100 mL af 70% ethanol, efterfulgt af 2 tømninger af 100 mL destilleret vand. Fyld systemet med 200 mL af perfusion buffer (PB).
    2. Indstil strømningshastigheden af den peristaltiske pumpe til 3 mL/min.
    3. Kalibrere temperatur i PB, forlader apparatet Langendorff til 39 ° C.
      1. Læg skræddersyede kanylen [16 G, 25 mm lang, skarp spids fjernet (figur 3A)] oven på apparatet Langendorff og starte strømmen. Tænde modulet varme og justerer værdien af opvarmning modul at nå den ønskede temperatur i PB, på spidsen af kanylen. Når temperaturen kalibreringen er afsluttet, flytte den skræddersyede kanyle til sprøjten bruges til cannulation (figur 2B).
    4. Forberede pres kontrol enhed (figur 3 c) ved siden af Langendorff system. Montere sommerfugl nålen på stativ klemme og forberede 3 blokerende knob.
      Bemærk: Collagenase enzymaktivitet varierer med temperaturen. En temperaturovervågning af venstre atrium, som en dynamisk tilpasning heraf, er påkrævet senere i proceduren.
  2. Opsætning af udstyr til orgel excision og cannulation ifølge figur 2B. Fylde bægerglasset, sprøjte og petriskål med en iskold cannulation buffer (CB) og forberede cannulation knob.
  3. Heparinize rat med 500 IE heparin pr. 100 g af rottens kropsvægt som følger.
    1. Sætte 2 mL af 100% isofluran i en anæstesi induktion kammer egnet til gnavere. Overføre den 21 uger gamle ZFS-1 fede rotte fra buret til induktion kammer. Tillad rotte at indtaste dyb anæstesi, angivet ved en deceleration af vejrtrækning til halvdelen af sin oprindelige frekvens.
    2. Fjerne rotten fra induktion kammer. Indsprøjtes 500 IE heparin pr. 100 g af rottens kropsvægt i bughinden ved hjælp af en heparin sprøjte.
    3. Returnere rotten i sit bur og mulighed for at vågne op.
      Bemærk: Det er ikke nødvendigt at bevare steriliteten under trin 1.4. Vente 20 min før du fortsætter til næste trin. En ufuldstændig antikoagulation kan forårsage blod koagulation, fører til mikro-hjertet, som væsentligt kan påvirke kvaliteten og udbytte af isolerede cardiomyocytes.

2. hjerte forberedelse

  1. Sætte 2 mL af 100% isofluran i en anæstesi induktion kammer egnet til gnavere. Overføre den 21 uger gamle ZFS-1 fede rotte fra buret til induktion kammer. Tillad rotte at indtaste dyb anæstesi, angivet ved en deceleration af vejrtrækning til halvdelen af sin oprindelige frekvens.
  2. Aflive dyret ved halshugning ved hjælp af en guillotine egnet til gnavere. Fiksere lemmer af rotte på en overflade, polystyren skum. Ophæve og fjerne den hud, der dækker formet som et sværd proces med kirurgisk saks. Åbn bughinden nedenfor ribben bure på begge sider og udsætte mellemgulvet.
  3. Åbn mellemgulvet ved at gøre et snit langs den forreste bue ved hjælp af fine sakse. Skære igennem ribbenene på begge sider langs linea mediaclavicularis til clavicula knoglen, ved hjælp af kirurgiske saks, for at eksponere mediastinum in situ.
  4. Fjerne lungerne i distale enderne af hila med fine sakse. Skære thymus at eksponere aortabuen.
  5. Knivspids bunden af hjertet med pincet og træk forsigtigt mod halen af dyret. Går på tværs af aorta samtidig opretholde en pull på hjertet, efterlader et 5 mm lang segment af aorta knyttet til hjertet. Hurtigt overføre midt i 50 mL iskold CB i 50 ml bægerglas (figur 2B).
    Bemærk: Under trin 2,5 – 3.3, hjertet er effektivt i iskæmisk betingelser. Undgå at overskride ialt 3 min for disse skridt for ikke at beskadige cardiomyocytes.

3. cannulation

  1. Vent cirka 10 s for hjertet at køle ned og gribe sammentrækninger. Overføre midt i en petriskål, som indeholder 50 mL af friske, iskold CB. Fjern forsigtigt fedtvævet omkring aorta ved hjælp af saks og pincet.
  2. Indsæt den skræddersyede kanyle (den samme som bruges i trin 1.2.3), som er knyttet til 10 mL sprøjte fyldt med iskolde CB, 3 mm i aorta. Fiksere aorta på kanylen ved at binde en af de to cannulation knob (figur 3B) i indrykningen proksimalt for spidsen af kanylen.
    Bemærk: Pas på ikke at beskadige aortaklappen ved en penetration med kanylen.
  3. Forsigtigt tømme aorta med 5 mL iskold CB ved hjælp af sprøjten knyttet til kanylen, indtil nogen mere blod er synlige i kranspulsårerne. Blidt massage venstre atrium med pincet og injicere de resterende 5 mL af CB, giver mulighed for eventuelle overskydende blod skal fjernes fra hulrum i petriskålen.
  4. Binde den anden cannulation knude (sutur: USP 3/0, silke) i indrykningen distalt for spidsen af kanylen. Afmontere kanyle med vedlagte hjertet fra sprøjten. Montere kanyle med vedlagte hjertet til Langendorff ved hjælp af en passende adapter.
    Bemærk: Denne protokol beskæftiger forhøjet tryk i den ventrikulære hulrum under perfusion på Langendorff apparater. Yderligere cannulation knude er forpligtet til at opretholde dette pres ved at undgå enhver anterograd buffer lækage gennem aorta.

4. Tryk Manipulation og fordøjelse

  1. Start den peristaltiske pumpe af Langendorff apparatet til at indlede perfusion af hjertets væv med PB. Binde et dobbelt overhånd knude (sutur: USP 3/0, silke) rundt i bunden af hjertet, bortset fra aorta. Gentag dette trin, indtil en inflation af de højre og venstre atrium, samt koronar sinus, er bemærket.
  2. Punktere atrium med sommerfugl nålen af pres betjeningsanordning (figur 3D) og tillade atrium at punktere. Manipulere intraluminal presset af atrium ved at justere højden af sommerfugl slange. Holde atrium lidt oppustet hele resten af proceduren; overvåge og justere i overensstemmelse hermed.
    Bemærk: Dette trin skal udføres hurtigt, da en langvarig inflation af venstre atrium vil resultere i cardiomyocyte død.
  3. Måle den omtrentlige temperatur i venstre atrium ved at placere en temperatur sonde mellem venstre forkammer og venstre hjertekammer. Justere temperaturen i Langendorff opvarmning modul i overensstemmelse hermed, rettet mod en omtrentlige temperatur på 37 ° C i venstre atrium.
  4. Perfuse hjerte med PB for et samlet beløb på 3 min.
  5. Skifte perfusion til en fordøjelsen buffer (DB) i cirka 14 – 18 min.
    Bemærk: Fordøjelsen er fuldført, når den venstre atriale struktur kollapser og vævet erhverver en mælkeagtig konsistens.
  6. Knivspids atrium med pincet og vedtage en lille pull. Fjerne venstre atrium ved hjælp af fine saks og overføre atrium i et stort vejer båden indeholdende 2 mL stoppe buffer (SB), fuldt sænkes ned i vævet.
  7. Bortskaf de resterende hjerte væv efter retningslinjerne i laboratoriet, hvor proceduren er udført.

5. celle forarbejdning og Calcium fornyet tilpasning

  1. Hakkekød den atriale væv i små stykker ca 2 mm x 2 mm ved hjælp af fine sakse.
  2. Sprede væv af en blide suge og udslyngning af væv bidder ved hjælp af en overførsel pipette. Fortsæt denne procedure for ca. 5 min. indtil en makroskopisk dissociation af væv kan observeres.
    Bemærk: Undgå luftbobler under dette trin, som udsætter celler til luft vil resultere i cardiomyocyte død.
  3. Overfør celler til en 15 mL konisk slange. Tillad væv klumper nøjes med 30 s. overførsel supernatanten ind i en anden 15 mL konisk rør. Tillad cellerne til at nøjes med 15 min.
  4. Fjern og kassér supernatanten. Der tilsættes 2 mL af trin 1 buffer (Se tabel 1). Tillad cardiomyocytes nøjes med 10 min.
    Bemærk: Den kasserede supernatanten indeholder også fibroblaster og endotelceller. Henvises til andre protokoller, hvis det ønskes at bruge disse celler til eksperimenter14,23. Pellet indeholder for det meste atrielle cardiomyocytes, som kan bekræftes ved lysmikroskopi. De mikroskopiske Karakteristik af atrieflimren cardiomyocytes beskrives trin 6.1.
  5. Fjern og kassér supernatanten. Der tilsættes 2 mL af trin 2 buffer. Tillad cardiomyocytes nøjes med 10 min.
  6. Fjern og kassér supernatanten. Der tilsættes 2 mL af trin 3 buffer. Tillad cardiomyocytes nøjes med 10 min.
  7. Fjern og kassér supernatanten. Tilsæt 250 µL af normale Tyrode (NT) indeholdende 1 mM Ca2 +.
  8. Overføre 50 µL af de normale Tyrode indeholdende atrieflimren cardiomyocytes på en glas-bund fad, som har været belagt med 25% laminin (og lov til at tørre på forhånd). Tillad cardiomyocytes nøjes med 10 min.
  9. Fyld en glas-bund fad med 500 µL af NT indeholdende 1 mM CaCl2.

6. funktionel evaluering af Excitation sammentrækning kobling

  1. Evaluering af celle morfologi og levedygtighed under et lysmikroskop ved hjælp af en 20 X forstørrelse (figur 4A og 4B). Tilfældigt vælge ca 100 celler og klassificere dem som enten levedygtige eller ikke-levedygtige for at kunne vurdere levedygtigheden af celle isolation procedure.
    Bemærk: Levedygtige celler er karakteriseret ved symmetriske sarkomeret struktur, fravær af membran blebs og en stang form.
  2. Indlæse celler med Ca2 +-følsomme fluorescerende farvestof indenfor 20 min for at fuldføre trin 5.9.
    1. Tilføje 10 µM Fluo4-AM til 500 µL af NT. Fjern supernatanten fra glas-bund fad (fra trin 5.9). Føje NT indeholdende Fluo4-AM til fadet, glas-bund. Inkuber blanding i 20 min. ved stuetemperatur. Fjern og kassér supernatanten. Vask prøve 2 x bruger 500 µL af NT.
  3. Visualisere Ca2 +-excitation med en Konfokal mikroskop som følger.
    1. Overføre glas-bund fad til en Konfokal mikroskop og visualisere Ca2 +-excitation med en Konfokal mikroskop (laser intensitet på 5,8%, excitation på 488 nm, emission på 515 nm) ved hjælp af en 40 X forstørrelse.
    2. Perfuse celler med NT opvarmet til 37 ° C ved hjælp af en passende superfusion enhed. Alternativt kan du holde cellerne varme ved hjælp af et mikroskop-monteret varme inkubator.
    3. Stimulere cardiomyocytes i et elektrisk felt med kommercielt tilgængelige, mikroskop-monteret stimulator elektroder på en frekvens på 1 Hz og en elektrisk strøm af 24 A. vente for 1 min så cellerne til at nå en steady-state af Ca2 + håndtering.
    4. Placer den scan line parallelt med tværgående akse, halvvejs mellem kernen og kanten af et tilfældigt udvalgte, makroskopisk kontraherende celle. Erhverve linje scanne billeder af gentagne scanning.
    5. Brug frit tilgængelige imaging software til at anslå signal intensiteten umiddelbart før en elektrisk stimulation (F0) hele cellen. Plot signal intensitet på tværs af hele cellen i løbet af 1 stimulation cyklus (F). Opdele (F) af (F0) for at få de respektive Ca2 + forbigående.

Figure 1
Figur 1: forenklede rutediagram forretningsorden isolation. Proceduren er meget tidsfølsomme enzymatisk fordøjelsen af myocytes er fuldført. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: forberedelse af udstyr inden isoleringen. (A) dette panel viser en self-made Langendorff apparater: (1) et dobbeltvægget reaktion fartøj med PB; (2) en dobbeltvægget reaktion fartøj med CB; (3) en 3-vejs stophane; (4) en sprøjte; (5) en peristaltisk pumpe; (6) en varme fordybelse; (7) en dobbeltvægget boble fælde; og (8) kanyle og hjerte. (B) dette panel viser set-up for cannulation og orgel excision for en optimeret arbejdsflow: (1) et 100 mL baegerglas med 50 mL iskold CB; (2) en 10 mL sprøjte med iskold CB; (3) en petriskål med iskold CB; (4) en lyskilde; (5) den skræddersyede kanyle med en cannulation knude (Se også figur 3A og 3B); (6) fine, buet pincet; (7) væv pincet; (8) fine pincet, vinklet 45°; (9) abdominal kirurgisk saks; (10) fine kirurgisk saks; (11) 4 x 30 G nåle; og (12) en 15 G kanyle. (C) dette panel viser den mikroskop-monteret udstyr til fluorescens imaging: (1) elektriske stimulator elektroder; (2) en superfusion pen; (3) en glas-bund fad med ACMs; og (4) nedsænket platin elektriske stimulator elektroder. (D) dette panel viser mikroskop set-up for den Konfokal billedbehandling: (1) Konfokal mikroskop; (2) en superfusion pen; (3) en superfusion buffer reservoir; (4) en superfusion flow regulator; (5) en superfusion opvarmning modul; (6) en computerarbejdsplads; og (7) en elektrisk stimulator. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: specialfremstillet udstyr. (A) dette panel viser de manipulerede 15 G kanyle med en Luer lock. Pilene angiver to fordybninger til cannulation knob. (B) disse er cannulation knob, to dobbelt overhånd knuder placeret oven på hinanden for hurtig stramning. Pilene angiver, hvor og i hvilke rækkefølge knude skal strammes. (C) dette panel viser den samlede pres kontrol enhed. 21 G sommerfugl nål er hooked til et stativ klemme. Slangen er holdt i samme højde som nålen. Skrue toppen er åbnet. Elevation af sommerfugl slangen kan ændres, som er angivet med pilene for at ændre intraluminal presset af venstre atrium. (D) venstre atrium er punkteret med pres kontrol enhed. Dette billede viser et ideelt oppustede venstre atrium. Ellipsen markerer placeringen af overhånd knude. (E) i venstre atrium er punkteret med pres kontrol enhed. Dette billede viser en oppustet venstre forkammer, hvilket vil resultere i en lavere udbytte af levedygtige ACMs. Ellipsen markerer placeringen af overhånd knude. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

21 uger gamle, kan 60 – 90% af levedygtige ACMs (anslået som beskrevet i trin 6.1), efter calcium fornyet tilpasning (trin 5.4-5.7), isoleres fra ZSF-1 fede rotter ved denne metode (figur 4A). Hos rotter, er ACMs karakteriseret ved en anden og mere heterogene fænotype i forhold til VCMs24,25. Figur 4B viser en individuel ACM med bevarede membraner og sarkomeret struktur, begge stærke indikatorer for et funktionelt integreret celle.

De erhvervede ACMs kan behandles i en række forskellige måder. Som eksemplificeret i figur 5, kan cellerne indlæses med fluorescerende farvestoffer anvendes til at studere morfologi og/eller funktion. For eksempel, blev di-8-ANEPPS brugt til at afgrænse de rørformede system i en atrial rotte celle (figur 5A). I et andet sæt af forsøg, er mitokondrier-farvning langt rød-fluorescens dye (f.eks., mitotracker-rød-FM) ansat til at opdage cytosole mitokondrier (figur 5B) i atrieflimren remodellering. Som vist i figur 5 c, ACMs isoleret med denne protokol er også velegnet til live-celle Ca2 + imaging og Vis intakt excitation-sammentrækning kobling med en 1 Hz felt-stimulation. Alle billeder kan bruges til videre analyse ved hjælp af en række algoritmer til forsker6,7 (fig. 5 d).

Figure 4
Figur 4: respektive udbytte af levedygtige, encellede AM. (A) dette panel viser udbyttet af en isoleret efter fornyet tilpasning af ACMs til 1 mM Ca2 + i NT. (B) dette panel viser en isolerede, encellede atrieflimren cardiomyocyte. Sarkomeret struktur, cellemembranen og kernen er klart synlige. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: farvning af rotte ACMs med fluorescerende farvestoffer. (A) dette panel viser farvning af en cellemembran og rørformede netværk med de fluorescerende farvestof Di8ANNEPS. (B) dette panel viser farvning af mitochondrier med fluorescerende farvestof mitotracker-rød-FM. (C) dette panel viser den tværgående linje scanning af en Ca2 +-excitation med fluorescerende farvestof Fluo4-AM over en enkelt celle. Pilene angiver den elektrisk stimulation, udført på 1 Hz. (D) dette panel viser longitudenal Ca2 + transienter stammer fra panelet C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her, beskrevet vi første gang en protokol til isolering af enkelt celle ACMs fra en rotte model af MetS-relaterede HFpEF der viser mærket atrieflimren remodeling22. Proceduren, der er entydigt udfordrende som overdreven fedtvæv kan gøre den kirurgiske forberedelse, samt cannulation af aorta, stadig vanskeligere. Guiden fejlfinding fastsat i tabel 2 adresser de mest almindelige spørgsmål af proceduren isolation.

Problem Mulig årsag Løsning
Ingen flow gennem sommerfugl slange Forkert lukning af aorta med cannulation knob Fjern fedtvæv før stramning
Tilføje 3rd cannulation knude med respektive indrykning
Træk knude med hånden for øget kraft
Blokerede nål Justere position i lumen
Fjerne blokeringen af blid trække med sprøjte
Højre atrium / koronar sinus ikke oppustet Forkert lukning af hjertet base Blok flow med ekstra knob
Højre atrium beskadiget under forberedelse Luk lækage med clips/knob
Dårlig fordøjelse / atrium ikke blødgøre Nedsat enzymaktivitet gennem forkert temperatur Justere temperaturen til 37 ° C
Inaktiv/nedbrudt enzym Erstat
Gamle/overdrevent fibrotisk atrium Øge fordøjelsestid (i trin på + 50%)
Beskadigede aortaklappen Lavvandede penetration under cannulation
Dårlig celle udbytte Atrium over fordøjet Formindske fordøjelsestid (i trin på 25%)
Reducere intraluminal pres ved at sænke sommerfugl slange
Atrium under fordøjet Øge fordøjelsestid (i trin på 25%)
Øge intraluminal pres ved at hæve sommerfugl slange
Celle spredning for aggressiv Være mere skånsom

Tabel 2: fejlfinding guide. Denne tabel viser almindelige problemer af proceduren isolation og deres respektive løsninger.

I en nylig undersøgelse, har vi vist, at den ZFS-1 fede rotte model udstiller omfattende atrieflimren remodeling med en øget atrieflimren størrelse22. En stigning i den venstre atriale størrelse er blevet anerkendt som en vigtig prognostiske markør for diastolisk dysfunktion26 og forårsager en rarefication af mikrovaskulære fartøjerne i forhold til væv. Dette fører til en nedsat fordeling af de udtog buffer gennem den retrograd perfusion af aorta under proceduren isolation, gengivelse den encellede isolation i denne model, især udfordrende. Andre hallmark egenskaber af atrieflimren remodeling, atrieflimren fibrose og øget fibrose har været vist for ZDF rotter — en rotte model for metaboliske diabetes og én overordnet stamme af ZFS1 rotter27. Kollagen indskud forringe effekten af fordøjelsesenzymer at befri cardiomyocytes fra den ekstracellulære matrix, og derfor kræver yderligere justeringer af celle isolation procedure28.

Den mekanisme, hvorved enheden pres letter forbedret isolering resultaterne i denne model af atrieflimren remodeling er mest sandsynligt i forbindelse med en lokaliseret dæmpning af koronar blodgennemstrømningen i venstre atrium. En større komponent af koronar blodgennemstrømningen er koronar perfusion pres, der er defineret som forløb mellem de koronar arterie og ende-diastolisk presset af de respektive hulrum29. Under proceduren beskrevet fører en blokering af hjertet base til en global stigning i kranspulsåren pres og intraluminal pres hele hjertet. Den efterfølgende punktering af venstre atrium letter en lokal, selektiv drop intraluminal pres i den venstre atriale hulrum. Således ikke kun en stor koronar perfusion trykgradient er etableret, men perfusion volumen øges også af Omkørselsafstanden fordøjelsen løsning fra overbelastede venstre hjertekammer til venstre forkammer.

Derudover valg af fordøjelsen enzymer er afgørende for ACM isolation: renset enzym blandinger af collagenase I og II har vist sig at være overlegen i forhold til mindre målrettet og mindre ren enzymer som collagenases30. Dette enzym tillader ikke kun for et højere udbytte af morfologisk og funktionelt intakt cardiomyocytes men også minimerer eventuelle sammenklumpning af enkelt celler efter deres isolation31. Renset enzym blandinger af collagenases med en ekstra høj dispase eller medium thermolysin indhold er mest almindeligt anvendt til rotte cardiomyocyte isolering. Mens VCMs er bedst isoleret ved højere koncentrationer, de bedste resultater af atrieflimren myocytes er anskaffet med en koncentration af 0.195 Wünsch enheder/mL ved hjælp af denne protokol32.

Som forekomsten af MetS-relaterede HFpEF stiger2 og atrieflimren cardiomyopatier førende til atrieflimren remodellering og atrial fibrillation er klinisk meget relevante, forskning på dette område er af afgørende interesse. Mange nye dyremodeller for HFpEF er ved at opstå33,34 og atrieflimren remodeling i overensstemmelse med en øget forekomst af atrieflimren rytme forstyrrelser er kendetegnende træk ved sygdommen. Den beskrevne metode gør det muligt for forskere at isolere levedygtige enkelt cardiomyocytes fra rotte modeller med atrieflimren remodeling for en yderligere undersøgelse med et usædvanligt højt udbytte og bevaret mekaniske og elektriske funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af DZHK (tyske Center for hjerte-kar-forskning, D.B.), EKFS (Else-Kröner-Fresenius Stiftung, F.H.), og af BMBF (tysk Ministeriet for uddannelse og forskning) samt BIH-Charité kliniske videnskabsmand program finansieret ved Charité - Universitätsmedizin Berlin, og Berlin Institute of Health (F.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ZSF-1 Obese rat Charles River Laboratories, Inc. 21 weeks old
Fine Iris Scissors Fine Science Tools GmbH 14094-11
Surgical Scissors Fine Science Tools GmbH 14001-18
Micro Dressing Forceps (curved, serrated) Aesculap, Inc. BD312R
Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) Aesculap, Inc. BD537R
Tying Forceps (angled) Aesculap, Inc. MA624R
Rodent and Small Animal Guillotine Kent Scientific Corp. DCAP
Low Cost Induction Chamber 3.0 L Kent Scientific Corp. SOMNO-0730 
Butterfly Winged Infusion Set 21 G Hospira, Inc. 181106101
Abbocath 16 G Hospira, Inc. 0G7149702
Microlance Hypodermic Needle Becton Dickinson GmbH 301300 modify needle to make cannula
Braun Original Perfusor Syringe 50 ml B. Braun Melsungen AG 8728810F
Braun Inject Solo Syringe 10 ml B. Braun Melsungen AG 2057926
Beaker 50ml Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) 21 106 17
Duroplan petri dish (100 x 20 mm) Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) 21 755 48
Seraflex Suture USP 3/0 SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG IC208000
VWR disposable Square Weighin Boats 100ml VWR, Inc. 10803-148
Styrofoam surface
Sodium chloride Sigma-Aldrich, Inc. 71380
Potassium chloride Sigma-Aldrich, Inc. P4504
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich, Inc. P5379
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich, Inc. S0876
Magensium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich, Inc. 230391
Magensium chloride Sigma-Aldrich, Inc. M8266
HEPES Sigma-Aldrich, Inc. H3375
Taurine Sigma-Aldrich, Inc. T0625
Glucose Sigma-Aldrich, Inc. G7528
2,3-Butanedione monoxime Sigma-Aldrich, Inc. B0753
Calcium chloride solution (1 M) Sigma-Aldrich, Inc. 21115
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich, Inc. A9647
Liberase Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) LIBTM-RO
Heparin Rotexmedica GmbH 3862357
Forene (Isoflurane) Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG 10182054
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane Sigma-Aldrich, Inc. L2020
WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm WillCo Wells B.V. HBST-3522
Fluo4 AM Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) F14201 5µM for 20min at RT
Di-8-ANNEPS Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) D3167 10µM for 45 min at 37° C 
Mitotracker RED FM Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) M22425 20nM for 30 min at 37° C
Jacketed reaction vessel 500 ml Gebr. Rettberg GmbH 107024414
Jacketed reaction vessel 1000 ml Gebr. Rettberg GmbH 107025414
Jacketed bubble trap Gebr. Rettberg GmbH 134720001
ED heating immersion circulator Julabo GmbH 9116000
Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) ISM 831
Voltcraft Thermometer 302 K/J Conrad Electronic SE 030300546
Tubing
LSM 700 microscope Carl Zeiss, Inc.
ZEN 2.3 imaging software Carl Zeiss, Inc. 410135-1011-240 
Single channel heater controller TC-324B Warner Instruments, LLC 64-2400
8 channel perfusion system Warner Instruments, LLC 64-0185
8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters Warner Instruments, LLC 64-0105

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberti, K. G., et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).
  2. International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention. IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome. , Available from: https://www.idf.org/e-library/consensus-statements/60-idfconsensus-worldwide-definitionof-the-metabolic-syndrome.html (2006).
  3. Melenovsky, V., et al. Left atrial remodeling and function in advanced heart failure with preserved or reduced ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 8 (2), 295-303 (2015).
  4. Goette, A., et al. EHRA/HRS/APHRS/SOLAECE expert consensus on atrial cardiomyopathies: definition, characterization, and clinical implication. EP Europace. 18 (10), 1455-1490 (2016).
  5. Schotten, U., Verheule, S., Kirchhof, P., Goette, A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiological Reviews. 91 (1), 265-325 (2011).
  6. Hohendanner, F., DeSantiago, J., Heinzel, F. R., Blatter, L. A. Dyssynchronous calcium removal in heart failure-induced atrial remodeling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (6), H1352-H1359 (2016).
  7. Hohendanner, F., et al. Inositol-1,4,5-trisphosphate induced Ca2+ release and excitation-contraction coupling in atrial myocytes from normal and failing hearts. The Journal of Physiology. 593 (6), 1459-1477 (2015).
  8. Tada, Y., et al. Role of mineralocorticoid receptor on experimental cerebral aneurysms in rats. Hypertension. 54 (3), 552-557 (2009).
  9. Iwasaki, Y. K., et al. Atrial fibrillation promotion with long-term repetitive obstructive sleep apnea in a rat model. Journal of the American College of Cardiology. 64 (19), 2013-2023 (2014).
  10. Field, L. J. Atrial natriuretic factor-SV40 T antigen transgenes produce tumors and cardiac arrhythmias in mice. Science. 239 (4843), 1029-1033 (1988).
  11. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2979-2984 (1998).
  12. Sartiani, L., Bochet, P., Cerbai, E., Mugelli, A., Fischmeister, R. Functional expression of the hyperpolarization-activated, non-selective cation current I(f) in immortalized HL-1 cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 545 (Pt 1), 81-92 (2002).
  13. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
  14. Gunduz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
  15. Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).
  16. Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50289 (2013).
  17. Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (91), e51109 (2014).
  18. Thum, T., Borlak, J. Isolation and cultivation of Ca2+ tolerant cardiomyocytes from the adult rat: improvements and applications. Xenobiotica. 30 (11), 1063-1077 (2000).
  19. Egorova, M. V., Afanas'ev, S. A., Popov, S. V. A simple method for isolation of cardiomyocytes from adult rat heart. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 140 (3), 370-373 (2005).
  20. Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
  21. Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments. (92), e51823 (2014).
  22. Hohendanner, F., et al. Cellular mechanisms of metabolic syndrome-related atrial decompensation in a rat model of HFpEF. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 115, 10-19 (2017).
  23. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), e2033 (2010).
  24. Bootman, M. D., Higazi, D. R., Coombes, S., Roderick, H. L. Calcium signalling during excitation-contraction coupling in mammalian atrial myocytes. Journal of Cell Science. 119 (Pt 19), 3915-3925 (2006).
  25. Smyrnias, I., et al. Comparison of the T-tubule system in adult rat ventricular and atrial myocytes, and its role in excitation-contraction coupling and inotropic stimulation. Cell Calcium. 47 (3), 210-223 (2010).
  26. Pritchett, A. M., et al. Diastolic dysfunction and left atrial volume: a population-based study. Journal of the American College of Cardiology. 45 (1), 87-92 (2005).
  27. Linz, D., et al. Cathepsin A mediates susceptibility to atrial tachyarrhythmia and impairment of atrial emptying function in Zucker diabetic fatty rats. Cardiovascular Research. 110 (3), 371-380 (2016).
  28. Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  29. Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
  30. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
  31. Deel, E. D., et al. In vitro model to study the effects of matrix stiffening on Ca(2+) handling and myofilament function in isolated adult rat cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 595 (14), 4597-4610 (2017).
  32. Wuensch, E., Heidrich, H. G. [On the Quantitative Determination of Collagenase]. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für physiologische Chemie. 333, 149-151 (1963).
  33. Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
  34. Horgan, S., Watson, C., Glezeva, N., Baugh, J. Murine models of diastolic dysfunction and heart failure with preserved ejection fraction. Journal of Cardiac Failure. 20 (12), 984-995 (2014).

Tags

Medicin sag 137 Atrial remodeling HFpEF metabolisk syndrom atrieflimren myocyte isolation atrieflimren dysfunktion rotte model
Isolering af atrieflimren Cardiomyocytes fra en rotte Model af metabolisk syndrom-relaterede hjertesvigt med bevarede uddrivningsfraktion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bode, D., Guthof, T., Pieske, B. M., … More

Bode, D., Guthof, T., Pieske, B. M., Heinzel, F. R., Hohendanner, F. Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction. J. Vis. Exp. (137), e57953, doi:10.3791/57953 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter