Summary
Här beskriver vi en optimerad, av-baserat förfarande för isolering av encelliga förmaksflimmer hjärtmuskelcellerna från en råtta modell av metabola syndromet-relaterade hjärtsvikt med bevarad ejektionsfraktion. En manuell reglering för intraluminal tryck av hjärtats hålrum implementeras för att ge funktionellt intakt myocyter passar excitation-contraction-koppling studier.
Abstract
I den här artikeln beskriver vi en optimerad, av-baserat förfarande för isolering av encelliga förmaksflimmer hjärtmuskelcellerna (ACMs) från en råtta modell av metabola syndromet (MetS)-relaterade hjärtsvikt med bevarad ejektionsfraktion (HFpEF). Prevalensen av MetS-relaterade HFpEF stiger, och förmaksflimmer kardiomyopati förknippas med förmaksflimmer remodeling och förmaksflimmer är kliniskt relevanta som förmaksflimmer remodeling är en oberoende prediktor för dödlighet. Studier med isolerade encelliga hjärtmuskelcellerna används ofta att bekräfta och komplettera i vivo fynd. Cirkulatorisk fartyg rarefication och interstitiell vävnad fibros utgör ett potentiellt begränsande faktor för framgångsrik enskild cell isolering av ACMs från djurmodeller av denna sjukdom.
Vi har tagit upp denna fråga genom att anställa en enhet kan manuellt reglera intraluminal trycket av hjärtats hålrum under förfarandet för isolering, väsentligt öka avkastningen av morfologiskt och funktionellt intakt ACMs. De förvärvade cellerna kan användas i en mängd olika experiment, såsom cellkultur och funktionell kalcium-imaging (dvs, excitation-contraction-koppling).
Vi ge forskaren en stegvisa protokollet, en lista med optimerade lösningar, grundliga instruktioner att förbereda nödvändig utrustning, och en omfattande felsökningsguide. Medan den inledande tillämpningen av förfarandet kan vara ganska svårt, kommer att en lyckad anpassning låta läsaren att utföra state-of-the-art ACM isoleringar i en råtta modell av MetS-relaterade HFpEF för ett brett spektrum av experiment.
Introduction
MetS beskriver ett kluster av riskfaktorer för diabetes mellitus typ 2 och hjärt-kärlsjukdomar och innehåller ett ökat arteriellt blodtryck, dyslipidemi (höjas triglycerider och sänkas high-density lipoprotein kolesterol), ökade fasta glukos och central fetma1. Världen över prevalensen av MetS uppskattas till 25 – 30% och ständigt stigande2. HFpEF är en heterogen kliniska syndrom som ofta förknippas med MetS. Den kardiella remodeling under HFpEF och dess föregående faser (dvs, Hypertensiv hjärtsjukdom) åtföljs av en ombyggnad av atria3. Nedsatt kontraktila funktion och strukturella förändringar av vänster förmak har förknippats med ökad dödlighet, förmaksflimmer och hjärtsvikt nydebuterade4. Förmaksflimmer remodeling kännetecknas av förändringar i den kanal Jonfunktionen, Ca2 + homeostas, förmaksflimmer struktur, fibroblast aktivering och vävnad fibros5. Vänster förmak remodeling i MetS-relaterade HFpEF och dess underliggande patologiska mekanismer är fortfarande bristfällig och kräver en ytterligare fördjupad undersökning. Djurmodeller har visat sig vara ett värdefullt verktyg och leda till många framsteg i fältet förmaksflimmer kardiomyopatier6,7,8,9.
Studier med isolerade encelliga hjärtmuskelcellerna används ofta att bekräfta och komplettera i vivo fynd. En isolering och eventuella efterföljande cellkulturen, tillåta för utredning av signalering vägar, Joniska kanal strömmar och excitation-contraction-koppling. Under fysiologiska tillstånd, hjärtmuskelceller inte föröka. Fusion mellan de transkriptionell reglerande sekvenserna av en atrial natriuretic factor och en simian virus 40 stora T-antigen i transgena möss ledde till skapandet av de första förevigade ACMs, heter AT-110. Vidareutveckling av AT-1 celler gav upphov till HL-1 celler, som kan inte bara vara seriellt passaged men också kontrakt spontant11. De gör, dock visar strukturella och funktionella skillnader jämfört med nymalen isolerade celler, såsom en mindre organiserade ultrastruktur, en hög förekomst av utveckla myofibrils11och en hyperpolarisering-aktiverat inåt nuvarande12. Isolering av ventrikulära hjärtmuskelcellerna (VCM) hos råttor och möss från en mängd olika modeller är väl etablerad13,14,15,16,17,18 , 19. i allmänhet exciderad hjärtat är monterad på en av apparatur och retrogradely perfusion med en Ca2 +-gratis buffert som innehåller matsmältningsenzymer, såsom kollagenaser och proteaser. Kalcium är sedan återinförde i en stegvis sätt fysiologiska förhållanden. Men även om protokollen tillägnad isolering av ACMs är tillgängliga20,21, på grund av ökad fibros och tryck-relaterade olikheter, är deras användbarhet i sjukdomsmodeller med förmaksflimmer remodeling begränsad.
I den här artikeln har vi implementerat ett protokoll för isolering av förmaksflimmer encelliga hjärtmuskelcellerna från djur som visar förmaksflimmer remodeling (dvs, i synnerhet för ZFS1 råtta modell för MetS-relaterade HFpEF)22. Befintlig isolering protokoll var optimerad och kompletteras med en enkel, skräddarsydda enhet för att styra och ändra intraluminal trycket av hjärtats hålrum, leder till högre avkastning av morfologiskt och funktionellt intakt hjärtmuskelcellerna. Följande protokoll ger forskaren med stegvisa guide, en detaljerad beskrivning av den skräddarsydda utrustningen, en lista över lösningar, samt en omfattande felsökningsguide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment godkändes av den lokala etiska kommittén (TVA T0060/15 och T0003-15) och ske i överensstämmelse med riktlinjerna för vård och användning av försöksdjur (National Institute of Health, U.S.A.).
Obs: Ett förenklat flödesschema förfarandets visas i figur 1.
1. prearrangements
- Förbereda buffertar enligt tabell 1.
| Lösning | PB | CB | DB | SB | S1 | S2 | S3 | NT | |
| Reagens (mM) | |||||||||
| NaCl | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | |
| KCl | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4 | |
| KH2PO4 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | ||
| Na2HPO4 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | ||
| MgSO4 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | ||
| MgCl | 1 | ||||||||
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
| Taurin | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | ||
| Glukos | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| BDM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| CaCl2 | 1 | 0,01 | 0,125 | 0,25 | 0,5 | 1 | |||
| BSA | 150 | 70 | 70 | 70 | |||||
| Renade enzymet blandning (medium Thermolysin) | 0,195 Wünsch enheter/mL | ||||||||
| pH justeras till | 7,4 | 7,4 | 7,4 | 7,4 | 7,4 | 7,4 | 7,4 | 7,4 | |
| pH justeras på | 37 ° C | 4 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | |
| pH justeras med | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH |
Tabell 1: lista över buffertar. PB: perfusion buffert, som kan lagras i 3 dagar vid 4 ° C (300 mL per djur). CB: kanylering buffert, som kan lagras i 3 dagar vid 4 ° C (200 mL per djur). DB: matsmältningen bufferten, vilket måste användas inom dag (40 mL per djur). SB: stoppa buffert, som måste användas inom dag (2 mL per djur). S1: Steg 1 bufferten, vilket måste användas inom dag (2 mL per djur). S2: Steg 2 bufferten, vilket måste användas inom dag (2 mL per djur). S3: Steg 3 bufferten, vilket måste användas inom dag (2 mL per djur). NT: normal Tyrode, som måste användas inom dag (50 mL per djur).
-
Laga av apparaten (figur 2A).
- Spola systemet med 100 mL 70% etanol, följt av 2 tömningar av 100 mL destillerat vatten. Fyll systemet med 200 mL perfusion buffert (PB).
- Ställa in flödet klassar av den peristaltiska pumpen-3 mL/min.
- Kalibrera temperaturen på PB lämnar av apparaten till 39 ° C.
- Placera den skräddarsydda kanyl [16 G, 25 mm långa, vassa spetsen bort (figur 3A)] på toppen av apparaten och starta flödet. Aktivera modulen värme och justera värdet av modulen värme att nå önskad temperatur av PB på spetsen av kanylen. När temperaturen kalibreringen slutförts, flytta skräddarsydda kanylen på sprutan som används för kanylering (figur 2B).
- Förbereda tryck kontroll enheten (figur 3 c) bredvid av systemet. Montera på fjäril injektionsnålen på stativ klämman och förbereda 3 blockerande knop.
Obs: Kollagenas enzymaktivitet varierar med temperaturen. En temperaturövervakning av vänster förmak, liksom en dynamisk justering av dessa, krävs senare under proceduren.
- Ställa in utrustning för den orgel excision och kanylering enligt figur 2B. Fyll bägaren, spruta, och petriskål med en iskall kanylering buffert (CB) och förbereda kanylering knutar.
-
Heparinize råtta med 500 IE av heparin per 100 g av råttans kroppsvikt enligt följande.
- Sätta 2 mL 100% isofluran i en kammare för induktion av anestesi lämplig för gnagare. Överföra 21 veckor gamla ZFS-1 feta råttan från buren till induktion kammaren. Låt råttan att ange djup anestesi, indikeras av en hastighetsminskning av andningen till hälften av dess inledande frekvens.
- Ta bort råttan från induktion kammaren. Injicera bukhinnan med en heparin spruta 500 IE av heparin per 100 g av råttans kroppsvikt.
- Returnera råtta in i sin bur och tillåta det att vakna upp.
Obs: Det är inte nödvändigt att upprätthålla sterilitet under steg 1.4. Vänta 20 min innan du fortsätter till nästa steg. En ofullständig antikoagulation kan orsaka blod koagulering, vilket leder till mikro-infarkter, vilket avsevärt kan påverka kvaliteten och avkastningen av isolerade hjärtmuskelcellerna.
2. hjärta förberedelse
- Sätta 2 mL 100% isofluran i en kammare för induktion av anestesi lämplig för gnagare. Överföra 21 veckor gamla ZFS-1 feta råttan från buren till induktion kammaren. Låt råttan att ange djup anestesi, indikeras av en hastighetsminskning av andningen till hälften av dess inledande frekvens.
- Avliva djuret genom halshuggning med hjälp av en giljotin som är lämplig för gnagare. Fixera lemmar råtta på en polystyren skum yta. Lyft och ta bort huden som täcker den xiphoid processen med kirurgisk sax. Öppna bukhinnan nedanför rib burar på båda sidor och exponera membranet.
- Öppna mellangärdet genom att göra ett snitt längs den främre båge med fina sax. Skär igenom revbenen på båda sidor längs den linea mediaclavicularis till nyckelben ben, med kirurgisk sax, för att exponera den mediastinum i situ.
- Ta bort lungorna i distala ändarna av hila med fina sax. Klipp ut tymus att exponera aortabågen.
- Nypa basen av hjärtat med pincett och dra försiktigt ned mot svansen djuret. Skär över aorta samtidigt bibehålla en pull på hjärtat, lämnar ett 5 mm långt segment av aorta kopplad till hjärtat. Snabbt överföra hjärtat i 50 mL iskallt CB i 50 ml-bägaren (figur 2B).
Obs: Under steg 2,5 – 3.3, hjärtat är effektivt i ischemiska förhållanden. Undvika att överskrida totalt 3 min för dessa steg för att inte skada hjärtmuskelcellerna.
3. kanylering
- Vänta cirka 10 s för hjärtat att svalna och beslagta sammandragningar. Överföra hjärtat i en petriskål innehållande 50 mL av färska, iskall CB. Ta försiktigt bort fettvävnad kring aorta med pincett och sax.
- Infoga den skräddarsydda kanyl (samma som användes i steg 1.2.3), som är knuten till de 10 mL spruta fylld med iskall CB, 3 mm i aorta. Fixera aorta på kanylen genom att knyta en av de två kanylering knop (figur 3B) i indraget proximala till spetsen av kanylen.
Obs: Var noga med att inte skada aortaklaffen genom en penetration med kanylen. - Försiktigt spola aorta med 5 mL iskallt CB sprutan bifogas kanylen tills inget mer blod syns i hjärtats kranskärl. Försiktigt massera vänster förmak med pincett och injicera den återstående 5 mL CB, möjliggör något överflödigt blod avlägsnas från hålrummet i petriskål.
- Andra kanylering vigas (sutur: USP 3/0, silk) i indraget distala spets av kanylen. Demontera kanylen med bifogade hjärtat från sprutan. Montera kanylen med bifogade hjärtat att den av med hjälp av en lämplig adapter.
Obs: Detta protokoll sysselsätter förhöjt tryck i ventrikulära kaviteten under perfusionen på av apparaten. Ytterligare kanylering Knut är skyldig att upprätthålla detta tryck genom att undvika läckage anterograd buffert genom aorta.
4. Tryck Manipulation och matsmältning
- Starta den peristaltiska pumpen av av apparaten att inleda perfusionen av hjärtats vävnad med PB. Knyt en dubbel överhandsknop (sutur: USP 3/0, silk) runt basen av hjärtat, exklusive aorta. Upprepa detta steg tills en inflation av höger och vänster förmak samt koronar sinus, märks.
- Punktering atrium med fjäril nålen av tryck kontroll enheten (figur 3D) och tillåta atrium att tömma. Manipulera intraluminal trycket av förmak genom att justera höjden av fjäril slangen. Hålla atrium något uppblåst resten av förfarandet. övervaka och justera.
Obs: Detta steg måste utföras snabbt, eftersom en långvarig inflation av vänster förmak kommer att resultera i hjärtmuskelcellen död. - Mäta den ungefärliga temperaturen i vänster förmak genom att placera en temperatursond mellan vänster förmak och vänster kammare. Justera temperaturen på den av värme modul med detta, med inriktning på en ungefärlig temperatur av 37 ° C för vänster förmak.
- BEGJUTA hjärtat med PB för totalt 3 min.
- Växla perfusionen till matsmältningen buffert (DB) för cirka 14 – 18 min.
Obs: Matsmältningen är klar när vänster förmak struktur kollapsar och vävnaden förvärvar en mjölkig konsistens. - Nypa atrium med pincett och anta ett lätt drag. Ta bort vänster förmak med fina sax och överföra atrium i en stor väger båt innehållande 2 mL stoppa buffert (SB), helt dränka vävnaden.
- Kassera den återstående hjärtvävnad följa riktlinjerna i laboratoriet där förfarandet utförs.
5. cell bearbetning och kalcium åter anpassning
- Finhacka den förmaksflimmer vävnaden i små bitar ungefär 2 mm x 2 mm med fina sax.
- Skingra vävnaden genom en skonsam sugkraft och utmatning av vävnad bitarna med överföring pipett. Fortsätt proceduren under cirka 5 minuter tills en makroskopisk dissociation av vävnad kan observeras.
Obs: Undvika luftbubblor under detta steg, som utsätter cellerna för att luften kommer att resultera i hjärtmuskelcellen död. - Överföra cellerna till en 15 mL koniska rör. Tillåta vävnad bitarna sedimentera i 30 s. överföring av supernatanten till en annan 15 mL koniska rör. Tillåta cellerna sedimentera i 15 min.
- Avlägsna och Kassera supernatanten. Tillsätt 2 mL av steg 1 buffert (se tabell 1). Tillåta hjärtmuskelcellerna sedimentera i 10 min.
Obs: Kasserade supernatanten även fibroblaster och endotelceller. Hänvisas till andra protokoll om man vill använda dessa celler för experiment14,23. Pelleten innehåller mestadels förmaksflimmer hjärtmuskelceller, som kan bekräftas genom ljusmikroskop. De mikroskopiska egenskaperna av förmaksflimmer hjärtmuskelcellerna diskuteras i steg 6.1. - Avlägsna och Kassera supernatanten. Tillsätt 2 mL av steg 2-buffert. Tillåta hjärtmuskelcellerna sedimentera i 10 min.
- Avlägsna och Kassera supernatanten. Tillsätt 2 mL av steg 3 buffert. Tillåta hjärtmuskelcellerna sedimentera i 10 min.
- Avlägsna och Kassera supernatanten. Tillsätt 250 µL av normala Tyrode (NT) innehållande 1 mM Ca2 +.
- Över 50 µL av den normala Tyrode innehållande förmaksflimmer hjärtmuskelceller på en glasbotten maträtt, som har varit belagd med 25% laminin (och får torka i förväg). Tillåta hjärtmuskelcellerna sedimentera i 10 min.
- Fyll en glasbotten maträtt med 500 µL av NT som innehåller 1 mM CaCl2.
6. funktionell utvärdering av Excitation-contraction-koppling
- Utvärdera cellmorfologi och lönsamhet under ett ljusmikroskop med en 20 X förstoring (figur 4A och 4B). Slumpmässigt väljer cirka 100 celler och klassificera dem som antingen lönsamt eller olönsamma för att bedöma lönsamheten av förfarandet cell isolering.
Obs: Viabla celler kännetecknas av symmetriska sarcomere struktur, avsaknad av membran blebs och en rod form. -
Lastceller med Ca2 +-känsliga fluorescerande färgämne inom 20 min för att slutföra steg 5,9.
- Lägga till 10 µM Fluo4-AM till 500 µL av NT. ta bort supernatanten från glasbotten skålen (från steg 5,9). Lägg till NT som innehåller Fluo4-AM till glasbotten skålen. Inkubera blandningen i 20 min i rumstemperatur. Avlägsna och Kassera supernatanten. Tvätta provet 2 x använder 500 µL av NT.
-
Visualisera de Ca2 +-excitation med confocal Mikroskop enligt följande.
- Överföra glasbotten skålen till confocal Mikroskop och visualisera den Ca2 +-excitation med confocal Mikroskop (laser intensitet på 5,8%, magnetiseringen på 488 nm, emission på 515 nm) med en 40 X förstoring.
- BEGJUTA cellerna med NT värms upp till 37 ° C med hjälp av lämplig superfusion anordning. Alternativt håll cellerna varm med hjälp av ett Mikroskop-monterad värme inkubator.
- Stimulera hjärtmuskelcellerna i ett elektriskt fält med kommersiellt tillgängliga, Mikroskop-monterad stimulator elektroder på en frekvens av 1 Hz och en elektrisk ström av 24 A. vänta på 1 min så att cellerna att nå en steady-state av Ca2 + hantering.
- Placera den Skanna linje parallellt med tvärgående axeln, halvvägs mellan kärnan och kanten av en slumpmässigt vald, makroskopiskt avtalsslutande cell. Förvärva linje scanna bilder av repetitiva skanning.
- Använd fritt tillgängliga bildprogram för att uppskatta signal intensiteten omedelbart före en elektrisk stimulering (F0) över hela cellen. Rita signalintensitet över hela cellen under loppet av 1 stimulering cykel (F). Dela (F) av (F0) för att få den respektive Ca2 + övergående.
Figur 1: förenklat flödesschema av förfarandet isolering. Förfarandet är mycket tidskänsliga tills enzymatisk nedbrytning av myocyter är slutförd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: beredning av utrustningen före isoleringen. (A) denna panel visar en self-made av apparat: (1) ett mantelskyddat reaktionskärlet med PB; (2) en mantlade reaktionskärlet med CB; (3) en 3-vägs Avstängningskranen; (4) en spruta. (5) en Peristaltisk pump; (6) en värme nedsänkning; (7) en mantlade bubbelfälla; och (8) den kanyl och hjärtat. (B) denna panel visar upplägget för den kanylering och orgel excision för ett optimerat arbetsflöde: (1) en 100 mL-bägare med 50 mL iskallt CB; (2) en 10 mL spruta med iskall CB; (3) en petriskål med iskall CB; (4) en ljuskälla; (5) skräddarsydda kanyl med en kanylering Knut (se även figur 3A och 3B); (6) fina, böjd pincett; (7) vävnad tången; (8) fin pincett, vinklad 45°; (9) buk kirurgisk sax; (10) fina kirurgisk sax; (11) 4 x 30 G nålar; och (12) en 15 G nål. (C), denna panel visar Mikroskop-monterad utrustning för confocal bildtagning: (1) elektrisk stimulator elektroder; (2) en superfusion penna; (3) en glasbotten skålen med ACMs; och (4) nedsänkt platina elektrisk stimulator elektroder. (D) i denna panel visas den Mikroskop set-up för confocal bildtagning: (1) mikroskopet confocal; (2) en superfusion penna; (3) en superfusion buffert reservoar; (4) en superfusion flödesregulator; (5) en superfusion värme modul; (6) en datorarbetsplats; och (7) en elektrisk stimulator. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: skräddarsydd utrustning. (A) denna panel visar de manipulerade 15 G kanyl med en luerlock. Pilarna anger två fördjupningar för kanylering knutar. (B) dessa är kanylering knutar, två dubbla overhand knutar placerad ovanpå varandra för snabb åtdragning. Pilarna anger där och i vilken ordning Knut behöver skärpas. (C), denna panel visar den monterade tryck kontroll enheten. En 21 G fjärilsnål är hooked på en stativ klämma. Slangen förvaras i samma höjd som nålen. Skruven upp öppnas. Höjden av fjäril slangen kan ändras som anges av pilarna för att ändra intraluminal trycket i vänster förmak. (D), vänster atrium punkteras med tryck kontroll enheten. Denna bild visar en idealiskt uppblåsta vänster förmak. Ellipsen markerar placeringen av överhandsknop. (E), vänster atrium punkteras med tryck kontroll enheten. Denna bild visar en överdrivet uppblåst vänster förmak, som kommer att resultera i en lägre avkastning av livskraftiga ACMs. Ellipsen markerar placeringen av överhandsknop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På 21 veckor ålder, kan 60 – 90% av livskraftiga ACMs (beräknad som beskrivs i steg 6.1), efter kalcium åter anpassning (steg 5,4-5,7), isoleras från ZSF-1 feta råttor genom denna metod (figur 4A). Hos råttor kännetecknas ACMs av en annan och mer heterogen fenotyp jämfört med VCMs24,25. Figur 4B visar en enskilda ACM med bevarade membran och sarcomere struktur, båda starka indikatorer på en funktionellt integrerad cell.
De förvärvade ACMs kan behandlas på olika sätt. Som exemplifieras i figur 5, kan cellerna laddas med fluorescerande färgämnen används för att studera morfologi och/eller funktion. Exempelvis användes di-8-ANEPPS för att avgränsa tubulär systemet i ett förmaksflimmer råtta cellen (figur 5A). I en annan uppsättning av experiment, är mitokondrierna-färgning långt rött-fluorescens färgämne (t.ex., mitotracker-röd-FM) anställd att upptäcka cytosoliska mitokondrier (figur 5B) i förmaksflimmer ombyggnad. Som visas i figur 5 c, ACMs isolerad med detta protokoll är också lämpliga för live-cell Ca2 + imaging och Visa intakt excitation-contraction koppling med en 1 Hz fält-stimulering. Alla bilder kan användas för vidare analys med hjälp av olika algoritmer tillgängliga för forskare6,7 (figur 5 d).
Figur 4: respektive avkastningen av livskraftiga, encelliga AM. (A) denna panel visar avkastningen av en isolering efter förnyad anpassning av ACMs till 1 mM Ca2 + i NT. (B) denna panel visar en isolerad, encelliga förmaksflimmer hjärtmuskelcellen. Sarcomere strukturen, cellmembranet och nucleus syns tydligt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: färgning av råtta ACMs med fluorescerande färgämnen. (A) i denna panel visas färgningen av cellmembranet och tubulär nätverk med den fluorescerande färgen Di8ANNEPS. (B) denna panel visar färgningen av mitokondrier med den fluorescerande färg mitotracker-röd-FM. (C) denna panel visar övergripande linje genomsökning av en Ca2 +-excitation med fluorescerande färgämnet Fluo4-AM över en enda cell. Pilarna anger de elektrisk stimulering, bedrivs vid 1 Hz. (D) i denna panel visas de longitudenal Ca2 + transienter härrör från panel C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskrivs vi först ett protokoll för isolering av encelliga ACMs från en råtta modell av MetS-relaterade HFpEF som visar markerade förmaksflimmer remodeling22. Förfarandet är unikt utmanande som överdriven fettvävnad kan göra kirurgisk beredning, liksom kanylering av aorta, allt svårare. Felsökningsguiden anges i tabell 2 adresser de flesta vanliga problem i förfarandet isolering.
| Problemet | Möjlig orsak | Lösning |
| Inget flöde genom fjäril slangen | Felaktig stängning av aorta med kanylering knutar | Ta bort fettdepåer innan åtdragning |
| Lägg till 3rd kanylering Knut med respektive indrag | ||
| Dra Knut med handen för ökad kraft | ||
| Blockerade nål | Justera position in i lumen | |
| Häva blockeringen av mild pull med spruta | ||
| Höger förmak / koronar sinus inte uppblåst | Felaktig stängning av hjärtat bas | Blockera flödet med ytterligare knop |
| Höger förmak skadad under beredning | Nära läckage med clips/knop | |
| Dålig matsmältning / atrium inte mjuka | Nedsatt enzymaktivitet genom fel temperatur | Justera temperaturen till 37 ° C |
| Inaktiv/degraderad enzym | Ersätt | |
| Gammal/alltför fibrotiska atrium | Öka koktiden (i steg om + 50%) | |
| Skadade aortaklaffen | Grunt penetration under kanylering | |
| Dålig cell avkastning | Atrium över rötas | Minska koktiden (i steg om 25%) |
| Minska intraluminal trycket genom att sänka fjäril slangen | ||
| Atrium under-rötas | Öka koktiden (i steg om 25%) | |
| Öka intraluminal trycket genom att höja slangen fjäril | ||
| Cell spridning alltför aggressiv | Vara mer skonsam |
Tabell 2: felsökningsguide. Denna tabell visar vanliga problem förfarandet för isolering och deras respektive lösningar.
I en färsk studie, har vi visat att ZFS-1 feta råttan modellen uppvisar omfattande förmaksflimmer remodeling med en ökad förmaksflimmer storlek22. En ökning av storleken på vänster förmak har erkänts som en viktig prognostisk markör för diastolisk dysfunktion26 och orsakar en rarefication av mikrovaskulära fartyg i förhållande till vävnaden. Detta leder till en minskad spridning av mag bufferten genom retrograd perfusionen i aorta under förfarandet isolering, rendering enskild cell isolering i denna modell särskilt utmanande. Andra kännetecknande dragen av förmaksflimmer remodeling, förmaksflimmer fibros och ökad fibros har visats för ZDF råtta — en råtta modell för metabola diabetes och en förälder stam av ZFS1 råttor27. Kollagen insättningar försämra effekten av de matsmältningsenzymer för att befria hjärtmuskelcellerna från den extracellulära matrixen och, därför kräver ytterligare justeringar cell isolering förfarande28.
Mekanismen genom vilken trycket enheten underlättar förbättrad isolering resultaten i denna modell av förmaksflimmer remodeling är sannolikt relaterade till en lokaliserad dämpning av koronara blodflödet i vänster förmak. En viktig komponent av koronara blodflödet är koronara perfusionstrycket, som definieras som lutningen mellan koronar trycket och de slut-diastoliskt trycket av respektive hålighet29. Under det beskrivna förfarandet leder en blockering av basen hjärtat till en global ökning av kranskärl trycket och intraluminal trycket under hjärtat. Efterföljande punkteringen av vänster förmak underlättar en lokal, selektiv droppe intraluminal trycket i vänster förmak hålrummet. Således inte bara en stor koronar genomblödning tryckgradienten är etablerad, men perfusion volymen ökar också av vidarekopplas matsmältningen lösningen från överbelastade vänster kammare i vänster förmak.
Valet av matsmältning enzymer är dessutom avgörande för ACM isolering: renade enzymet blandningar av kollagenas I och II har visat sig vara överlägsen mindre riktade och mindre rena enzymer som kollagenaser30. Detta enzym bara tillåter inte en högre avkastning av morfologiskt och funktionellt intakt hjärtmuskelceller men också minimerar eventuella klumpar av enstaka celler efter sin isolering31. Renade enzymet smälter av kollagenaser med en extra hög dispase eller medellång thermolysin innehåll är vanligast för råtta hjärtmuskelcellen isoleringar. Medan VCMs isoleras bäst vid högre koncentrationer, bästa resultaten av förmaksflimmer myocyter förvärvades med en koncentration av 0.195 Wünsch enheter/mL med hjälp av detta protokoll32.
Eftersom prevalensen av MetS-relaterade HFpEF stiger2 och förmaksflimmer kardiomyopatier leda till förmaksflimmer remodeling och förmaksflimmer förmaksflimmer är kliniskt högst relevanta, forskning på detta område är av avgörande intresse. Många nya djurmodeller för HFpEF växer fram33,34 och förmaksflimmer remodeling i linje med en ökad incidens av förmaksflimmer hjärtrytmrubbningar är hallmark funktioner av sjukdomen. Den beskrivna metoden tillåter forskare att isolera livskraftig enda hjärtmuskelcellerna från råtta modeller med förmaksflimmer remodeling för ytterligare en studie med en exceptionellt hög avkastning och bevarade mekaniska och elektriska funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av DZHK (tyska centrum för kardiovaskulär forskning, D.B.), EKFS (Else-Kröner-Fresenius Stiftung, F.H.), och av BMBF (tyska ministeriet för utbildning och forskning) samt Bosnien och Hercegovina-Charitéen kliniska forskare program finansieras av Charitéen - Universität Berlin och Berlin Institute of Health (F.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
- Alberti, K. G., et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).
- International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention. IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome. , Available from: https://www.idf.org/e-library/consensus-statements/60-idfconsensus-worldwide-definitionof-the-metabolic-syndrome.html (2006).
- Melenovsky, V., et al. Left atrial remodeling and function in advanced heart failure with preserved or reduced ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 8 (2), 295-303 (2015).
- Goette, A., et al. EHRA/HRS/APHRS/SOLAECE expert consensus on atrial cardiomyopathies: definition, characterization, and clinical implication. EP Europace. 18 (10), 1455-1490 (2016).
- Schotten, U., Verheule, S., Kirchhof, P., Goette, A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiological Reviews. 91 (1), 265-325 (2011).
- Hohendanner, F., DeSantiago, J., Heinzel, F. R., Blatter, L. A. Dyssynchronous calcium removal in heart failure-induced atrial remodeling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (6), H1352-H1359 (2016).
- Hohendanner, F., et al. Inositol-1,4,5-trisphosphate induced Ca2+ release and excitation-contraction coupling in atrial myocytes from normal and failing hearts. The Journal of Physiology. 593 (6), 1459-1477 (2015).
- Tada, Y., et al. Role of mineralocorticoid receptor on experimental cerebral aneurysms in rats. Hypertension. 54 (3), 552-557 (2009).
- Iwasaki, Y. K., et al. Atrial fibrillation promotion with long-term repetitive obstructive sleep apnea in a rat model. Journal of the American College of Cardiology. 64 (19), 2013-2023 (2014).
- Field, L. J. Atrial natriuretic factor-SV40 T antigen transgenes produce tumors and cardiac arrhythmias in mice. Science. 239 (4843), 1029-1033 (1988).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Sartiani, L., Bochet, P., Cerbai, E., Mugelli, A., Fischmeister, R. Functional expression of the hyperpolarization-activated, non-selective cation current I(f) in immortalized HL-1 cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 545 (Pt 1), 81-92 (2002).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Gunduz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50289 (2013).
- Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (91), e51109 (2014).
- Thum, T., Borlak, J. Isolation and cultivation of Ca2+ tolerant cardiomyocytes from the adult rat: improvements and applications. Xenobiotica. 30 (11), 1063-1077 (2000).
- Egorova, M. V., Afanas'ev, S. A., Popov, S. V. A simple method for isolation of cardiomyocytes from adult rat heart. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 140 (3), 370-373 (2005).
- Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments. (92), e51823 (2014).
- Hohendanner, F., et al. Cellular mechanisms of metabolic syndrome-related atrial decompensation in a rat model of HFpEF. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 115, 10-19 (2017).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), e2033 (2010).
- Bootman, M. D., Higazi, D. R., Coombes, S., Roderick, H. L. Calcium signalling during excitation-contraction coupling in mammalian atrial myocytes. Journal of Cell Science. 119 (Pt 19), 3915-3925 (2006).
- Smyrnias, I., et al. Comparison of the T-tubule system in adult rat ventricular and atrial myocytes, and its role in excitation-contraction coupling and inotropic stimulation. Cell Calcium. 47 (3), 210-223 (2010).
- Pritchett, A. M., et al. Diastolic dysfunction and left atrial volume: a population-based study. Journal of the American College of Cardiology. 45 (1), 87-92 (2005).
- Linz, D., et al. Cathepsin A mediates susceptibility to atrial tachyarrhythmia and impairment of atrial emptying function in Zucker diabetic fatty rats. Cardiovascular Research. 110 (3), 371-380 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Deel, E. D., et al. In vitro model to study the effects of matrix stiffening on Ca(2+) handling and myofilament function in isolated adult rat cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 595 (14), 4597-4610 (2017).
- Wuensch, E., Heidrich, H. G. [On the Quantitative Determination of Collagenase]. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für physiologische Chemie. 333, 149-151 (1963).
- Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
- Horgan, S., Watson, C., Glezeva, N., Baugh, J. Murine models of diastolic dysfunction and heart failure with preserved ejection fraction. Journal of Cardiac Failure. 20 (12), 984-995 (2014).
