Summary
Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for å hente og berike phosphopeptides prostatakreft linjer eller vev for en analyse av phosphoproteome via masse massespektrometri-baserte Proteomikk.
Abstract
Phosphoproteomics omfatter store studier av fosforylert proteiner. Protein fosforylering er et viktig skritt i mange signaltransduksjon trasé og er strengt regulert av kinaser og phosphatases. Derfor kan karakteriserer phosphoproteome gi innsikt i identifisere romanen mål og biomarkers for oncologic terapi. Massespektrometri gir en måte globalt oppdage og kvantifisere tusenvis av unike fosforylering hendelser. Men er phosphopeptides mye mindre vanlig enn ikke-phosphopeptides, gjør biokjemiske analyse mer utfordrende. For å overkomme denne begrensningen, er metoder for å berike phosphopeptides før massespektrometri analysen nødvendig. Vi beskriver en prosedyre for å trekke ut og oversikten protein fra vev til peptider, etterfulgt av en berikelse for phosphotyrosine (pY) og phosphoserine/threonin (pST) peptider bruker et antistoff-basert og/eller titandioksid (TiO2)-basert berikelse metode. Etter eksempel forberedelse og massespektrometri, vi senere identifisere og telle phosphopeptides flytende kromatografi-massespektrometri og analyseprogramvare.
Introduction
En anslått 165,000 nye tilfeller og ca 29 000 dødsfall forekommer i 2018 av prostata kreft, som representerer den vanligste kreft og andre ledende årsak til kreft relatert død i menn i USA1. Tidlige stadier av prostata kreft er med resection eller stråling behandling av orgel-begrenset sykdom, hvor er ti år tilbakefall er mellom 20% og 40% for pasienter som gjennomgår prostatektomi og mellom 30% og 50% for pasienter som får stråling terapi2. Fordi prostata kreft er avhengig av androgen Signaliser for vekst, er kirurgiske og kjemiske kastrering terapi også ansatt høy risiko pasienter. Imidlertid oppstår tilbakefall når kreften ikke lenger reagerer på androgen deprivasjon terapi som gjenspeiles av biokjemiske regelmessighet der prostata-spesifikt antigen i serum stiger igjen. På dette punktet i utviklingen oppdages metastaser ofte også. Denne avansert stadium, kalt metastatisk kastrering-resistente prostatakreft, representerer dødelig form av sykdommen der prognosen er en gjennomsnittlig overlevelse tid med mindre enn to år3. Noen er behandling tilgjengelig i sent sykdom, inkludert andre generasjon antiandrogens som enzalutamide og abiraterone, samt taxane-baserte kjemoterapi som docetaxel. Til tross for tilgjengelig behandling fremgang sykdommen ofte. Derfor er oppdagelsen og utvikling av nye behandlingsmetoder nødvendig for å forbedre behandling av prostata kreftpasienter med avansert sykdom.
Massespektrometri (MS)-baserte tilnærminger gir en global analyse av proteom gjennom påvisning av hundrevis til tusenvis av peptid analytter4. Spesielt kan funnet Proteomikk, data-avhengige oppkjøp ("BMH"), også kjent som gi identifikasjon og kvantifisering av peptider4,5. Baserte oppdagelsen Proteomikk kan være ytterligere avgrenset ovenfra og ned Proteomikk, der kjennetegnes intakt proteiner, og opp (også kjent som shotgun) Proteomikk, der peptider analyseres som karakteriserer proteiner5. Dermed foregår hagle Proteomikk, litt proteolyse i eksempel utarbeidelsen foregående MS analysen deler proteiner i peptider. På slutten utføres en databasesøk for å tilordne peptidene tilbake til proteiner for identifikasjon. Etikett-fri så vel som flere isotop-merking [f.eks, stabil isotop merking av aminosyrer i cellekultur (SILAC)] kan metoder brukes til å sammenligne kvantitativt peptider mellom prøver6,7. Mens isotop merking teknikker er gull standard, etikett-fri metoder har vist lignende kvantifisering beskrevne8,9 og har sammenlignbare avveininger mellom sensitivitet og spesifisitet10. Etikett-fri kvantifisering gir større dekning og tillater sammenligninger mellom mange flere prøver, mens ikonbasert metoder er begrenset av kostnader og multipleksing kapasitet6,7,8.
Videre kan hagle MS også brukes til å forhøre post-translasjonell endringer (PTMs) som fosforylering11. På grunn av lavere stoichiometric natur phosphopeptides sammenlignet med totale peptider, er flere metoder ansatt å berike for phosphopeptides, inkludert antistoff-baserte immunoprecipitation av phosphotyrosine (pY) peptider, titandioksid (TiO2 ), og immobilisert metall affinitet kromatografi (IMAC)5,12. Fordi protein fosforylering er et viktig skritt i mange celle signalnettverk trasé, hagle phosphoproteomics tillater forskere å undersøke celle signalisering endringer i ulike kreftformer, herunder brystkreft13, prostata14, nyre15, og eggstokkene,16,17 å forstå kreft biologi og identifisere potensielle nye mål for terapi.
Denne etiketten-fri hagle phosphoproteomic metoden ble bygget og raffinert basert på tidligere arbeid av Utne gruppe18,19,20. Denne protokollen begynner ved å beskrive utvinning og fordøyelsen av proteiner og fosfoproteiner fra vev peptider. Vi da detalj anriking av pY peptider bruker bestemte phosphotyrosine antistoffer og TiO2. Vi beskriver også anriking av phosphoserine/threonin (pST) peptider bruker sterk cation exchange (SCX) etterfulgt av TiO2. Denne protokollen konkluderer med innlevering å en MS-anlegget og bruk av MS analyseprogramvare å identifisere og telle phosphopeptides og deres tilsvarende fosfoproteiner. Anvendelsen av denne protokollen kan utvide utover prostatakreft i andre kreft og felt utenfor onkologi.
Protocol
Eksperimenter med xenograft svulster ble godkjent av Rutgers University institusjonelle Animal Care og bruk komiteen som frem under retningslinjene for National Institutes of Health.
1. protein utvinning
- Forberede lyseringsbuffer (tabell 1). (Volumet avhenger av hvor å høstes.) For i vitro celle prøver, går du til trinn 1.2. For tumor vev, fortsetter du til trinn 1.3.
-
Høste celler
- Samle inn cellene i et 50 mL konisk rør og spinne dem på 700 x g i 5 min på 4 ° C. Forkaste nedbryting og holde pellet på is. Gjenta dette trinnet for alle retter å samle cellene i en pellets. (Vanligvis ca 5 nesten confluent 15 cm retter av celler kreves for 5 mg protein, men dette kan være avhengig av den celle linjen og trenger å empirisk hver etterforsker.)
- Vask pellets med 30 mL av kjølt fosfat-bufret saltvann (PBS) og spinn på 700 x g i 5 min på 4 ° C før aspirating PBS. Legge til 1,5 mL lyseringsbuffer per 5 mg protein brukes til celle pellets. Pipetter opp og ned et par ganger. Gå til trinn 1.4.
-
Høsting vev
- Veie svulsten og legge 2 mL iskald lyseringsbuffer for hver 100 mg av vev i et reagensrør kultur. (Vanligvis 50-150 mg av vev våt vekt er nødvendig.)
- Homogenize i lysate ved hjelp av en håndholdt eller Borstemmaskin homogenizer (pulse 2 x 15 s.) Rengjør homogenizer før første smakebit og mellom eksempler ved hjelp av 10% blekemiddel, 70% etanol og deionisert vann i rekkefølge.
- Å nedskrive og alkylate, varme homogenisert prøvene ved 95 ° C i 5 minutter. Så avkjøle dem på isen i 15 min. På is, sonicate lysate 3 x (dvs, puls for 30 s med 60 s pauser mellom pulser). Utvalget skal ikke viskøse eller klumpete på dette punktet. Varme lysate ved 95 ° C i 5 min21.
- Sentrifuger i lysate i den samme sonication rør med en swing bøtte rotor 3500 x g ved 15 ° C for 15 min. samle nedbryting og kast pellet.
- Bestemme protein konsentrasjonen ved å utføre en Bradford analysen22. Eventuelt fortynne den lysate til 5 mg/mL med et lyseringsbuffer. Lagre den på 20 ° C.
Merk: Eksperimentet kan pauses her. Fryse prøvene ved-80 ° C og fortsette senere.
2. lysate fordøyelse
- Fortynne prøven 12-fold ved hjelp av 100 mM Tris (pH = 8.5) å redusere guanidinium. Fortynne alle prøver til samme volum å minimere virkningene av ulike fordøyelsen. Lagre 12.5 µg til av ufordøyd lysate å bekrefte det på en Coomassie-farget gel23.
- 5 mg protein, legge til 10 µg av Lysyl Endopeptidase (Lys-C) og ruge det ved romtemperatur for 5-6 h. justere pH til 8.0 ved untitrated å legge til 1 M Tris (pH ~ 11).
- Forberede 1 mg/mL av L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl keton (TPCK)-behandlet trypsin i 1 mM HCl (med 20 mM CaCl2). Legg til trypsin i 1: 100 trypsin: protein forholdet og ruge det på 37 ° C 3 h.
- Legge til samme mengde frisk trypsin som i trinn 2.3. Inkuber det på 37 ° C over natten.
- Lagre 12.5 µg av den fordøyde lysate å bekrefte komplett fordøyelsen på en Coomassie-farget gel23.
3. omvendt fase utvinning
- Registrere lysate volumet. Filtrere prøven ved hjelp av en 15 mL 10 kDa cutoff filter. Sentrifuge prøven på 3500 x g bruker swing bøtte rotoren (eller 3500 x g i en fast vinkel rotor) på 15 ° C til retentate volumet er mindre enn 250 µL (dette tar ca 45-60 minutter). Samle gjennomflytsenhet og kast retentate.
Merk: Eksperimentet kan pauses her. Fryse prøvene ved-80 ° C og fortsette senere. - For å syre prøven, legger du til ca 20 µL av 5% trifluoroacetic acid (TFA) per mL av lysate. Bland dem godt og måle pH prøven ved hjelp av pH strimler. Justere pH til 2,5 med 5% TFA.
- Koble kortere slutten av en C-18-kolonnen til en vakuum manifold. Sette vakuum mellom 17 og 34 kPa (eller i henhold til produsentens instruksjoner). Bruker glass Pipetter, våt kolonnen med 3 mL 100% acetonitrile (ACN). Ikke la kolonnen tørr.
- Bruke glass equilibrate Pipetter, kolonnen med 6 mL på 0,1% TFA som 2 x 3 mL. Legg sur prøven i kolonnen. Ikke Legg mer enn 3 mL samtidig. Justere vakuum målrettingsland ca 1 til 2 dråper per sekund.
- Bruke glass vask Pipetter, kolonnen med 9 mL på 0,1% TFA som 3 x 3 mL. Elute kolonnen med 2 mL 40% ACN, 0,1% TFA. Samle to 2 mL brøker i kultur BILLEDRØR . Kast kolonnen.
- Dekker eluate rør med parafilm og 3-5 hull på forsiden bruker en 20G nål. Fryse eluate på tørris i minst 30 min før det er helt fylt.
- Lyophilize fraksjoner over natten. Kontroller at prøvene er helt tørt før du stopper lyophilizer dagen. Lagre rør i en 50 mL konisk rør med delikate kluter på-80 ° C.
Merk: Eksperimentet kan pauses her.
4. Immunoprecipitation og berikelse av pY peptider24
- Resuspend det lyofiliserte pulveret med 0,5 mL iskalde immunoprecipitation (IP) bindende bufferen i hver fraksjon. Basseng fraksjoner ved å overføre 0,5 mL rørets volumet fra andre brøken til første brøk og lagre pipette spissen. Kraftig vortex (i stedet for pipettering opp og ned) å sikre at prøven er fullstendig oppløst før du overfører den til en 3,6 mL skrukork cryotube.
- Som i trinn 4.1., skyll lyophilization rør med en annen 0,5 mL IP bindende buffer (tabell 1) i hver retning. Overføre løsningen til 3,6 mL skrukork røret bruker samme pipette spissen for å unngå tap av prøven. Gjenta skylling 1 x mer, gjør endelige rørets volum 2 mL (etter 5 mg protein). Måle pH prøve å sikre at det er ca 7.4. Hvis det er for surt, iterativt legge 10 µL av 1 M Tris (untitrated, pH ~ 11). Hvis det er for grunnleggende, iterativt legge 10 µL av fortynnet HCl (1:25 eller 1: 100).
-
Forvask pY perler (for 5 mg starter lysate)
- 25 µg 4G 10 antistoff og 12,5 µg 27B10.4 antistoff er nødvendig per prøve. Etter benytter en p200 Pipetter med kutt tips overføre antistoffer i separate microcentrifuge rør, vaske antistoffer med 450 µL av iskalde IP bindende buffer 2 x. Sentrifuge dem 100 x g for 1 min 4 ° C og leveringstanken ut nedbryting.
- Resuspend perler å en lager konsentrasjon på 0,5 mg/mL bruker IP bindende buffer. (Gjør ikke vortex perlene.) Etter aliquoting nødvendig gjødsel (50 µL 4G 10 antistoff slurry og 25 µL 27B10.4 antistoff slurry per prøve) inn i et enkelt rør, spinne ned lager sentrifuge rør 200 x g for 1 min på 4 ° C. Vask sideveggene med nedbryting før retur perler til lagring i kjøleskapet.
- Legge til pre vasket pY perler resuspended prøve løsningen i skrukork cryotubes. Inkuber dem på 4 ° C på en over-gjennomgående rotator over natten.
- Plass den skrukork cryotubes i et 50 mL sentrifuge rør med en delikat tørke. Nedspinning perler på 100 x g i 1 lagre nedbryting, som vil bli brukt til å berike for pST peptider. (Berikelse for pST begynner på trinn 7 og kan utføres parallelt pY peptid behandling).
- Resuspend perler med 300 µL IP bindende bufferen. Overføre dem til en 2 mL microcentrifuge rør og spinne dem ned på 100 x g for 1 min på 4 ° C.
- Skyll inkubering rør 3 x med 200 µL IP bindende bufferen. Overføre innholdet til samme Microcentrifuge rør hver gang. Deretter spinne dem ned.
- Vask perler i microcentrifuge rør 3 x med 500 µL IP bindende bufferen og spinne dem ned på 100 x g for 1 min. Deretter vaske perlene 4 x med 450 µL av 25 mM NH4HCO3, pH 7.5 og rotere dem ned på 100 x g 1 min. Bruk en frisk 25 mM NH4HCO3 løsning fra pulver hver gang.
- Sentrifuge perler på 1500 x g i 1 Bruk en gel-lasting tips å fjerne nedbryting helt av dipping spissen av gel-lasting spissen under perlene overflate.
- Legge til 4 x perle volumet på 0,1% TFA til perlene (dvs.legge til 300 µL på 0,1% TFA for 75 µg av pY perle slurry). Bland dem godt og ruge blandingen i en thermomixer på 1000 rpm i 15 min på 37 ° C.
- Overføre rørets til filtere 0,2 µm spinn. Raskt spinne ned elueringsrør og overføre residualvolum til samme spinn filter bruker en P10 pipetter. Nedspinning spinn filteret 850 x g i 1 overføre tilsettes til en Lav protein-bindende microcentrifuge tube. Vakuum konsentrere eluate til tørrhet natten på 40 ° C og med varme tiden 300 min.
Merk: Eksperimentet kan pauses her. Fryse prøvene ved-80 ° C og fortsette senere.
5. titandioksid berikelse25 av pY peptider
- Resuspend tørrfisk ned phosphopeptides i 200 µL av 50% ACN, 0,1% TFA. Vortex og sentrifuge dem på 10.000 x g for 30 s. Gjenta denne 1 x for å resuspend dem godt.
- Forbereder TiO2 perler i tips som har en kapasitet for 200 µL prøver.
- Forsiktig Trykk på de små tips-side tips å flytte materialet til slutten. Skyll spissen av tilføyer 200 µL av 100% ACN, etterfulgt av invertere tips og blar den lille enden for å flytte væske mot cap.
- Bruker et barberblad, kuttet i små spissen av tuppen og plasser den over en Lav protein-bindende rør. (Unngå å bruke polystyren rør som TiO2 vil holde seg til sidene av røret.) Ta hetten og sett brønnene å stupe ut de resterende ACN. Gjenta vask med 200 µL av 100% ACN. TiO2 perlene er nå plassert i lav protein-bindende røret for følgende.
- Forutsetning TiO2 med 500 µL av 100% ACN 2 x. Pipetter det blande perler med løsemiddelet. Sentrifuge dem 100 x g for 1 min.
- Betingelse TiO2 med 500 µL 0,2 M natrium fosfat bufferen (pH ~ 7) 2 x. Vask perler med 300 µL av balanse buffer 3 x. TiO2 er svært tett, vil perlene utligne raskt.
- Legge til 400 µL av 50% ACN, 0,1% TFA i lav protein-bindende røret, etterfulgt av å legge til 84 µL av melkesyre. Overføre resuspended phosphopeptides inn i lav protein-bindende røret og ruge dem 1t ved hjelp av en over-gjennomgående rotator.
- Sentrifuge perler på 100 x g for 1 min til pellets dem. Vask dem med 300 µL balanse bufferen (tabell 1) 2 x og spinne dem ned på 100 x g for 1 min.
- Skyll perler med 300 µL av skylling buffer 2 x. Overføre dem til et 0,2 µm spinn filter. Spin dem 1500 x g for 1 min.
- Bildeoverføringsenheten filteret slik rent 1,5 mL lav protein-binding. Elute innholdet 2 x med 200 µL av 0,9% NH3 i H2O. måle pH med pH strimler, hvilke burde være mellom 10 og 11. Vakuum konsentrere seg eluate til tørrhet over natten til å fordampe ammoniakk.
6. avsalte pY peptider for MS Analyses
- Rekonstituer phosphopeptides med 15 µL på 0,1% TFA ved vortexing og sentrifugering dem på 10.000 x g for 30 å resuspend dem. Gjenta denne 1 x for å resuspend dem godt. Ikke Pipetter opp og ned.
- Rengjør prøven med et C-18-tips med bindende kapasitet på 5 µg og følger produsentens protokollen.
- Helt tørr elueringsrør volumet av vakuum konsentrasjon. Dette tar 1-2 h. Resuspend tørket phosphopeptides i 12.5 µL massespektrometri løsning (se tabell 1) (eller anbefalt av forskerens MS Proteomikk kjernen anlegget). Vortex og kort Nedspinning løsningen på 10.000 x g for 30 s. Gjenta denne 2 x å resuspend dem godt. Prøvene er klar for innsending til et massespektrometri (trinn 11).
Merk: Følgende nedenfor er knyttet til pST peptid berikelse bare.
7. omvendt fase utvinning av pST peptider
- Måle peptid konsentrasjonen av nedbryting ervervet fra trinn 4.6 ved å utføre en peptid analysen. En tilstrekkelig mengde for pST massespektrometri er 2,5 mg.
- Justere pH til 3.5 med 5% TFA.
- Koble kortere slutten av en C-18-kolonnen til en vakuum manifold. Sette vakuum mellom 17 og 34 kPa (eller i henhold til produsentens instruksjoner). Våt kolonnen med 3 mL 100% ACN. Ikke la kolonnen tørr.
- Equilibrate kolonnen med 6 mL på 0,1% TFA som 2 x 3 mL. Legg sur prøven i kolonnen. Ikke Legg mer enn 3 mL samtidig. Justere vakuum målrettingsland ca 1-2 dråper per sekund.
- Vask kolonnen med 9 mL på 0,1% TFA som 3 x 3 mL. Elute kolonnen med 2 mL 40% ACN, 0,1% TFA. Samle to 2 mL brøker i kultur BILLEDRØR. Kast kolonnen.
- Dekker eluate rør med parafilm og 3-5 hull på forsiden bruker en 20G nål. Fryse eluate på tørris i minst 30 min før det er helt fylt.
- Lyophilize valgte fraksjoner over natten. Kontroller at prøvene er helt tørt før du stopper lyophilizer dagen. Lagre rør i en 50 mL konisk rør med delikate kluter på-80 ° C.
Merk: Eksperimentet kan pauses her.
8. sterk Cation Exchange (SCX) av pST peptider
- Resuspend lyofilisert peptidene i 2 mL Buffer A (tabell 1). Basseng fraksjoner for hvert utvalg. (Løsningen vil være skyet.)
- Forberede vakuum manifold. Koble en SCX-kolonnen til en 3 mL sprøyte med stempelet fjernet. Sette vakuum mellom 17 og 34 kPa (eller i henhold til produsentens instruksjoner).
- Tilstand SCX kolonnen med 4 mL av ACN, etterfulgt av 4 mL Buffer A.
- Laste det 2 mL av utvalget fra trinn 8.1 og samle eluate umiddelbart. Last 3 mL A:B (80.9:19.1) bufferen og samle eluate. Basseng eluates hver eksempel og aliquot dem i 2 mL lav protein-bindende rør.
- Vakuum konsentrere alle prøver til ca 30% av volumet gjenstår. (Dette trinnet tar ca 2-4 h.) Basseng i dele inn 1 lav protein-bindende røret for hvert utvalg.
- Koble kortere slutten av en C-18-kolonnen til en vakuum manifold. Sette vakuum mellom 17 og 34 kPa (eller i henhold til produsentens instruksjoner). Våt kolonnen med 3 mL 100% ACN 2 x. Gjør ikke la kolonnen tørr.
- Equilibrate kolonnen med 3 mL 0,1% TFA 2 x. Belaste prøven i kolonnen. Ikke Legg mer enn 3 mL samtidig. Justere vakuum målrettingsland ca 1-2 dråper per sekund.
- Vask kolonnen med 3 mL 0,1% TFA 2 x. Elute kolonnen med 4 mL av 50% ACN, 0,1% TFA.
9. titandioksid berikelse av pST peptider
-
Forbereder TiO2 perler i tips som har en kapasitet for 200 µL prøver
- Trykk forsiktig på siden lite tips tips å flytte perler til slutten. Fjerne hetten og hell perler i en polypropylen 15 mL konisk rør.
- Skyll spissen av tilføyer 200 µL av 100% ACN, invertere spissen et par ganger og flicking den lille enden for å flytte væske mot cap. Bruker et barberblad, kuttet i små spissen av tuppen og plasser den over polypropylen 15 mL konisk røret. Ta hetten og sett brønnene å stupe ut de resterende ACN. Gjenta vask med 200 µL av 100% ACN. TiO2 perler er nå plassert i 15 mL konisk røret for følgende.
- Forutsetning TiO2 med 500 µL av 100% ACN 2 x. Pipetter det blande perler med løsemiddelet. Sentrifuge dem 100 x g for 1 min.
- Tilstand TiO2 med 500 µL 0,2 M natrium fosfat bufferen (pH ~ 7) to ganger. Vask perler med 300 µL av balanse buffer 3 x.
- Overføre eluted phosphopeptides inn i polypropylen 15 mL konisk røret. Legge til 560 µL av melkesyre og ruge det 1t ved hjelp av en over-gjennomgående rotator.
- Sentrifuge blandingen på 100 x g for 1 min til pellets perler. Vask dem med 300 µL balanse bufferen (tabell 1) 3 x. Spin dem ned på 100 x g for 1 min.
- Skyll perler med 300 µL av skylling buffer 2 x. Overføre dem til et 0,2 µm spinn filter. Spin dem ned på 1500 x g for 1 min.
- Bildeoverføringsenheten filteret slik rent 1,5 mL lav protein-binding. Elute innholdet 2 x med 200 µL av 0,9% NH3 i H2O. La løsningen sitte på phosphopeptides i 2 minutter før eluting dem. Måle pH, hvilke burde være mellom 10 og 11.
- Vakuum konsentrere seg eluate til tørrhet over natten til å fordampe ammoniakk.
10. avsalte pST peptider for MS analyser
- Forsiktig Trykk på de små tips-side tips å flytte materialet til slutten. Skyll spissen av tilføyer 200 µL av 100% ACN, etterfulgt av invertere tips og blar den lille enden for å flytte væske mot cap.
- Bruker et barberblad, kuttet i små spissen av tuppen og plassere den over en polypropylen 15 mL konisk rør. Ta hetten og sett brønnene å stupe ut de resterende ACN. Gjenta vask med 200 µL av 100% ACN. TiO2 perlene er nå plassert i polypropylen 15 mL konisk røret for følgende.
- Rengjør prøven med et C-18-tips med bindende kapasitet på 100 µg. (følg produsentens instruksjoner.)
- Helt tørr elueringsrør volumet av vakuum konsentrasjon. Dette tar 1-2 h.
- Resuspend tørket phosphopeptides i 12.5 µL massespektrometri løsning (eller anbefalt av forskerens MS Proteomikk kjernen anlegget). Vortex og sentrifuge dem på 10.000 x g for 30 s. Gjenta 2 x resuspend dem godt. (Ikke Pipetter opp og ned.)
11. massespektrometri analyse
- Sende prøvene til MS Proteomikk kjernen anlegget å utføre flytende kromatografi-tandem MS (LC-MS/MS) bruker de anbefalte innstillingene. Eksempelinnstillinger er som følger (se tabell 2 for et sammendrag):
- Laste 5 µL av prøvene på en felle kolonne (2 cm lange x 75 µm diameter) og vasker dem med 0,1% TFA i 5 min med en flow rate på 5 µL/min.
- Få trap i tråd med en nano analytisk kolonne (20 cm x 75 µm) med en flow rate på 300 nL/min.
- De segmenterte lineære graderingene (en prosentandel av 0,16% maursyre, 80% ACN i 0,2% maursyre) er forskjellige mellom pY og pST eksempler:
- Elute dem ved hjelp av en gradient 4-15% i 5 minutter og 15 til 50% i 40 min 50-90% i 5 min for pY-prøver.
- Elute dem ved hjelp av en gradient 4-15% i 30 min, 15-25% i 40 min, 25-50% i 44 min og 50-90% 11 min for pST prøver.
- Erverve MS data i data-avhengige vinningen måte med en syklisk serie av en full scan med en oppløsning på 120 000 etterfulgt av MS-/ MS (HCD, relativ kollisjon energi på 27%) av de 20 mest intense ionene og en dynamisk utelukkelse varighet 20 s.
- Etter MS kjøre ferdigstillelse, importere MS raw-filer i en MS analyse programvare program å identifisere og telle phosphopeptides. (MaxQuant programvare8,26,27 ble brukt i dette eksperimentet. Med mindre spesifisert i tabell 3, ble standardinnstillingene brukt.)
Representative Results
Denne protokollen beskriver i detalj en metode for protein utvinning og fordøyelsen etterfulgt av phosphopeptide berikelse og påfølgende MS analyse (figur 1). Komposisjonene til alle buffere og løsninger som brukes i denne protokollen er oppført i tabell 1. Sekvensiell bruk av Lys-C og trypsin gir en effektiv fordøyelse. En Coomassie-farget gel av pre-oversikten lysate bekrefter tilstedeværelsen av proteiner, mens farging av post fordøyd lysate bekrefter komplett fordøyelsen (figur 2A). For en komplett fordøyelsen, skal ingen band vises over 15 kDa, unntatt den 30 kDa og 23.3 kDa band for Lys-C og trypsin, henholdsvis. Tillegg av Lys-C reduserer også antall tapte cleavages (figur 2B). Fordi pY peptider representerer bare 2% av phosphoproteome28, er immunoprecipitation av pY peptider bruker en pY-spesifikke antistoffer første trinn i pY peptid berikelse. Resulterende nedbryting blir inndataene for pST peptid berikelse. PY immunoprecipitation skiller effektivt pY peptider fra pST peptider hvor gjennomsnittlig 85% av phosphopeptides identifisert fra pY forberedelse er pY (figur 3A) og over 99% av phosphopeptides identifisert fra pST forberedelse er pST (figur 3B). Titandioksid brukes til å berike for phosphopeptides i begge preparater. Forventet prosentandelen av peptider i MS-klar utarbeidelsen som er fosforylert er mellom 30-50% (figur 4A). Variasjon i phosphopeptide berikelse prosent kan være større i pY utarbeidelsen som følge av det er mange færre pY peptider enn pST peptider. I phosphopeptide arter har fleste phosphopeptides oppdaget en enkle eller doble phosphoryl gruppe (figur 4B).
Etter utfører massespektrometri, lastes MS raw-filer inn i en MS analyseprogramvare. Parameterinnstillingene i eksperimentet er oppført i tabell 3 men varierer fra programvare til programvare og kan variere fra versjon til versjon. Parameterne som ikke vises ble igjen som standard, inkludert en FDR cutoff av 1% for samsvarende peptid-spektrum (PSM) med minimum Andromeda score på 40 for identifikasjon av endrede peptider27. Angi en lokalisering sannsynlighet cutoff større enn 0,75 filtrerer ut ca 5% av pY peptider og 15% og 34% av pS og pT peptider, henholdsvis (figur 5A). Etter bruk av disse filtrene, er forventet antall phosphopeptide-IDer på slutten av MS analysen ca 300 pY peptider (for 5 mg Start protein) og ca 7500 pS peptider og 640 pT peptider (for 2,5 mg Start peptid beløp) fra de respektive berikelse forberedelsene (figur 5B). Antall gjentak og variasjon av phosphopeptide signal intensiteten bestemmer tilstrekkelig makt for statistiske sammenligninger. I fire separate forsøk med grupper som inneholder biologiske duplikater eller triplicates, ble prosent koeffisientene av variant (CV %) for oppdaget phosphopeptides beregnet. Distribusjoner av lavere variasjon (f.eks, pST grupper 1-5 i figur 5C) indikerer at den prøvetaking, forberedelser og massespektrometri går var konsekvent. På den annen side, distribusjoner av høyere variabilitet (f.eks, pST gruppe 6 i figur 5C) angir bråk data som vil kreve større fold-endringer å oppdage betydelige forskjeller i nedstrøms differensial analyser.
Figur 1: arbeidsflytdiagram. Proteiner fra eksempler er utdraget og fordøyd. Peptider er trukket ut av solid fase utvinning (SPE) og phosphotyrosine (pY) peptidene er immunoprecipitated. Parallelt, er phosphoserine/threonin (pST) peptidene beriket fra nedbryting i pY immunoprecipitation trinn. Sterk cation exchange (SCX) utføres på nedbryting fjerne svært ladet peptider å redusere ion undertrykkelse12. Begge forberedelser gjennomgå phosphopeptide berikelse via titandioksid (TiO2). Etter eksempel opprydding utføres flytende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) for å måle phosphopeptide overflod. Rådata er deretter lastet inn en MS analyseprogramvare å identifisere phosphopeptides. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: evaluering av fordøyelsen. (A) tre eksempler med 12.5 µg lysate før fordøyelsen, post-Lys-C fordøyelsen, og etter trypsin fordøyelsen vises. En Coomassie gel-flekk test viser en ren fordøyelsen etter sekvensiell bruk av Lys-C og trypsin. Molekylvekt (MW) størrelse markørene er i kilodaltons (kDa). (B) A reduksjon i tapte cleavages er observert når Lys-C ble lagt til i protokollen. Andelen phosphopeptides uten tapte cleavages økt fra 48% til 64% og 60% til 84% i gjennomsnitt for pY og pST berikelse preparater, henholdsvis. Grafene summere dataene innhentet fra to eksperimenter utført uten Lys-C og fem eksperimenter med Lys-C. Feilfeltene er standard avvik som representerer 38 pY og 38 pST prøver fra 2 separate forsøk (uten Lys-C) og 62 pY og 60 pST prøver fra 5 separate forsøk (med Lys-C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: anriking av pY og pST phosphopeptides. Disse skjermbildene viser prosentandelene av pSTY phosphopeptides fra enten (A) den pY eller (B) pST berikelse forberedelsene. PY anriking av pY immunoprecipitation og titandioksid resulterte i 85% phosphopeptides å være i pY peptider, mens bare 0,1% av phosphopeptides i pST anriking pY. Disse verdiene ble trukket fra undersøke Phospho (STY)Sites.txt-fil av en representant eksperimentet etter filtrere ut forurensninger, omvendt sekvenser og phosphopeptides med lokalisering sannsynligheter mindre enn 0,75. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Phosphopeptide berikelse med titandioksid. (A) andelen oppdaget phosphopeptides (i forhold til totalt peptider) fra prøvene i fire separate forsøk er vist. (B) dette panelet viser gjennomsnittlig sammensetningen av mono-, dobbelt- og multi-fosforylert peptider i fire separate forsøk. Feilfeltene i panelet A er standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: forventet phosphoresidue identifikasjoner. (A) dette panelet viser fosforylering lokalisering sannsynligheten for IDer fra pY berikelse (venstre) og pST berikelse (høyre). Mener andelen IDer som oppfyller > 0,75 sannsynlighet cut-off er 93%, 75% og 52% for pY, pS og pT, henholdsvis. (B) gjennomsnittet antall IDer med en > 0,75 lokalisering sannsynligheten er 300 for pY, 7500 for pS og 640 for pT. (C) dette panelet viser fiolin tomter den prosent variasjonskoeffisienten (CV %) av phosphopeptides. En evaluering av % CV ble bare utført hvis signalet intensitetsverdien ble oppdaget i hver biologiske replikere eller tre eksemplarer. Dataene er Hentet fra fire separate forsøk. Feilfeltene i paneler A og B er standard avvik fra 34 pY og 34 pST prøver fra 4 separate forsøk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Buffer | Volum | Komposisjon | |
| 6 M guanidinium chloride lyseringsbuffer | 50 mL | 6 M guanidinium chloride, 100 mM tris pH 8.5, 10 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine, 40 mM chloroacetamide, 2 mM natrium orthovanadate, 2,5 natrium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 500 mg n-octyl-glycoside, svært rent vann til volum | |
| 100 mM natrium pyrophosphate | 50 mL | 2,23 g natrium pyrophosphate decahydrate, ultra rent vann til volum | |
| 1M β-glycerophosphate | 50 mL | 15.31 g β-glycerophosphate, svært rent vann til volum | |
| 5% trifluoroacetic acid | 20 mL | Legg 1 mL av 100% trifluoroacetic syre i 19 mL ultra ren vann | |
| 0,1% trifluoroacetic acid | 250 mL | Legge til 5 mL 5% trifluoroacetic syre 245 mL ultra ren vann | |
| pY elueringsbufferen | 250 mL | 0,1% trifluoroacetic acid, 40% acetonitrile, ultra rent vann til volum | |
| pST elueringsbufferen | 250 mL | 0,1% trifluoroacetic acid, 50% acetonitrile, ultra rent vann til volum | |
| IP bindende buffer | 200 mL | 50 mM tris pH 7.4, 50 mM natriumklorid, svært rent vann til volum | |
| 25 mM ammonium bikarbonat, pH 7.5 | 10 mL | Oppløses være 19.7 mg i 10 mL steril svært rent vann, pH til 7.5 med 1 N saltsyre (~ 10-15 µL/10 ml løsning), gjør frisk | |
| 1M fosfatbuffer, pH 7 | 1000 mL | 423 mL 1 M natrium dihydrogen fosfat, 577 mL 1 M natrium hydrogen fosfat | |
| Balanse buffer | 14 mL | 6.3 mL acetonitrile, 280 µL 5% trifluoroacetic acid, 1740 µL melkesyre, 5.68 mL ultra ren vann | |
| Skylling buffer | 20 mL | 9 mL acetonitrile, 400 µL 5% trifluoroacetic acid, 10.6 mL ultra ren vann | |
| Massespektrometri løsning | 10 mL | 500 µL acetonitrile, 200 µL 5% trifluoroacetic acid, 9,3 mL ultra ren vann | |
| Buffer A | 250 mL | 5 mM monopotassium fosfat (pH 2,65), 30% acetonitrile 5 mM kalium klorid, ultra-rent vann til volum | |
| Buffer B | 250 mL | 5 mM monopotassium fosfat (pH 2,65), 30% acetonitrile 350 mM kalium klorid, svært rent vann til volum | |
| 0,9% ammonium hydroksid | 10 mL | 300 μL 29.42% ammonium lut, 9,7 mL ultra ren vann | |
Tabell 1: buffere og løsninger. Denne tabellen viser komposisjoner av buffere og løsningene som brukes i denne protokollen.
| LC--MS-/ MS innstillinger | ||
| Parameteren | pY innstillingen | pST innstillingen |
| Prøve lasting (µL) | 5 | |
| Lasting strømningshastighet (µL/min) | 5 | |
| Gradient strømningshastighet (nL/min) | 300 | |
| Lineær gradient (prosent 0,16% maursyre, 80% ACN i 0,2% maursyre) | 4 - 15% for 5 min | 4 - 15% for 30 min |
| 15 - 50% for 40 min | 15 - 25% til 40 min | |
| 50 - 90% for 5 min | 25 - 50% for 44 min | |
| 50 - 90% for 11 min | ||
| Full skanneoppløsning | 120 000 | |
| Antall mest intense ioner valgt | 20 | |
| Relativ kollisjon energi (%) (HCD) | 27 | |
| Dynamisk eksklusjon (s) | 20 | |
Tabell 2: LC-MS innstillinger. Dette er et eksempel på LC-MS for en vanlig hagle phosphoproteomic eksperiment. Prøvene var lastet på en felle kolonne. Fellen ble brakt i tråd med en analytisk kolonne. Disse innstillingene ble optimalisert for bruk av LC-MS systemet oppført i tabell av materialer og reagenser. Disse innstillingene må justeres for andre LC-MS-systemer.
| MaxQuant innstillingene | ||
| Innstillingen | Handlingen | |
| Gruppe-spesifikke parametere | ||
| Type | Type | Velg Standard |
| Mangfold | Satt til 1 | |
| Fordøyelsen modus | Enzym | Velg Trypsin/P |
| Max. tapte cleavages | Til 2 | |
| Modifikasjoner | Variabel endringer | Legge til Phospho (SVINESTI) |
| Etikett-fri kvantifisering | Etikett-fri kvantifisering | Velg LFQ |
| LFQ min. forholdet teller | Satt til 1 | |
| Rask LFQ | Krysse av | |
| Diverse | Nytt kvantifisere | Krysse av |
| Globale parametere | ||
| Sekvenser | FASTA filer | Velg fasta arkiv dataoverførte fra UniProt |
| Fast endringer | Legge til Carbamidomethyl (C) | |
| Avansert identifikasjon | Mellom kjører | Krysse av |
| Match vinduet | Satt til 5 min | |
| Justering vinduet | Satt til 20 min | |
| Matche uidentifisert funksjoner | Krysse av | |
| Protein kvantifisering | Min. forholdet teller | Satt til 1 |
| Mappeplasseringer | Endre følgelig | |
Tabell 3: MS analyse programvareinnstillinger. I MaxQuant, ble gruppespesifikke og globale parameterne i tabellen valgt eller justert. Alle andre parametere forble på standard. Disse eksperimentene ble utført med versjon 1.5.3.30. Parameterne kan variere fra versjon til versjon og fra programvare til programvare.
Discussion
Før du bruker denne protokollen å berike for phosphopeptides, er en nøye vurdering av eksperimentell design avgjørende. Bruke biologiske gjentak er en mer kostnadseffektiv bruk massespektrometri ressurser enn tekniske gjentak. Antall gjentak som kreves avhenger delvis på variasjon av dataene. En fersk studie viste at mens øke antall gjentak utover tre bare marginalt øker antall identifikasjoner, antall betydelig identifikasjoner mellom grupper øker med mer replikerer10.
På grunn av lavere overflod av fosfoproteiner i cellen er tilstrekkelig Start protein beløpene nødvendig for å oppnå en global phosphoproteome fra prostatakreft prøver i oppdagelsesmodus. I disse eksperimentene, ble 5 mg protein brukt. Cirka fem nesten confluent 15 cm retter celleområde gi nok protein som innspill til denne protokollen, selv om dette blir cellen linje-avhengige. Som for tumor vev er den forventede avkastningen av protein ca 6-8% av vev vekt. I innstillingen i vitro er en positiv kontroll prøve å vurdere 1 mM vanadate i 30 min før høsting cellene. Vanadate, en konkurransedyktig protein phosphotyrosyl fosfatase inhibitor, vil bevare fosforylering tyrosin, dermed øker antall pY peptid identifikasjoner29.
Ren fordøyelsen er et viktig skritt for å maksimere phosphopeptide identifikasjon. I tillegg til det Coomassie flekk testen, kan prosent av tapte cleavages i data brukes til å evaluere fordøyelsen effektivitet (figur 2). Kvalitetskontroll er tilgjengelig som analyserer tapte cleavages og andre beregninger for å vurdere MS data kvalitet30. Mens trypsin er de vanligste, alternativ proteaser er tilgjengelig generert5 til adressen dekning hull i proteom der optimale tryptic peptider ikke31. Innstillingene for MS analyseprogramvare ville må endres tilsvarende for å endringer i proteaser.
Protokollen bruker immunoprecipitation (for pY berikelse) og titandioksid (TiO2) å berike for phosphopeptides. Alternative tilnærminger til å berike for peptider inkluderer immobilisert metall affinitet kromatografi (IMAC), andre metalloksider for metalloksid affinitet kromatografi (MOAC) som aluminiumhydroksid og polymer-baserte metall ion affinitet fange (PolyMAC) 5,12. Tidligere studier har vist at ulike berikelse metoder berike for ulike grupper av phosphopeptides32. For eksempel beriker IMAC flere multi-fosforylert peptider mens MOAC fortrinnsvis beriker for mono-fosforylert peptider33. Representant resultatene av denne protokollen gjenspeiler denne observasjonen (figur 4B). En fersk publikasjon vist at IMAC og MOAC bruker en hybrid materiale kan potensielt gi større dekning av phosphopeptide arter34. Derfor kan denne protokollen endres for å bruke andre berikelse metoder parallelt for å muliggjøre enda mer omfattende phosphoproteomic analyser.
MaxQuant26 programvarepakke brukes til å analysere MS dataene i denne protokollen, men kommersielle programmer35 er også tilgjengelig for phosphopeptide identifikasjon og kvantifisering. For phosphopeptide identifikasjon brukes en lokalisering sannsynlighet cutoff. Dette filteret er utført for å velge for phosphopeptides med høy sikkerhet (dvs., større enn 0,75) i phosphoresidue identifikasjon10,28. Med andre ord, er summerte sannsynligheten for alle andre rester som kan inneholde phospho-gruppen mindre enn 0,25. Denne cutoff kan heves for å øke stringens av phosphopeptide valg. I forhold til antall identifikasjoner er forventet antall pY peptider i hundrevis, og forventet antall pST peptider er i høy tusenvis. Disse verdiene gjenspeiler tidligere observert phosphoproteome distribusjon der om lag 2%, 12% og 86% av phosphosites er pY, pT og pS, henholdsvis28.
Hvis pY og pST berikelse trinnene utføres parallelt, kan prøve forberedelsene i protokollen fullføres på seks dager. Ved sammenkobling med den kraftige verktøyet av MS, gir phosphopeptide berikelse protokoller som dette en global tilnærming for forskere å samle inn data for å analysere phosphoproteome i sine respektive forskningsfelt.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker medlemmer av Drake laboratoriet for å gi råd og innspill på manuskriptet. Vi takker også medlemmer av biologiske masse massespektrometri anlegg av Robert Wood Johnson medisinskolen og Rutgers, The State University of New Jersey, for å gi råd og utføre massespektrometri på våre prøver. Larry C. Cheng støttes av National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health prisen nummer T32 GM008339. Thomas G. Graeber støttes av NCI/NIH (SPORE i prostata kreft P50 CA092131; P01 CA168585) og en American Cancer Society forskning Scholar Award (RSG-12-257-01-TBE). Justin M. Drake støttes av den avdeling av forsvarer prostata kreft forskning Program W81XWH-15-1-0236, prostata Cancer Foundation ung forsker pris, New Jersey Health Foundation og en presisjon medisin initiativ Pilot Award fra Rutgers Cancer Institute i New Jersey.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultra-Low Temperature Freezer | Panasonic | MDF-U76V | |
| Freezer -20 °C | VWR | scpmf-2020 | |
| Swing rotor bucket | ThermoFisher Scientific | 75004377 | |
| Vacuum manifold | Restek | 26080 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7420020 | |
| CentriVap Benchtop Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| End-over-end rotator | ThermoFisher Scientific | 415110Q | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 620177 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC901024 | |
| Glass culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-26 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| 20G needle | BD | B305175 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Screw cap cryotube | ThermoFisher Scientific | 379189 | |
| Nunc 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific | 12-565-268 | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 02-707-181 | |
| Millipore 0.2 µm spin filter | Millipore Sigma | UFC30GVNB | |
| Low protein-binding Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| anti-Phosphotyrosine, Agarose, Clone: 4G10 | Millipore Sigma | 16101 | |
| 27B10.4 antibody | Cytoskeleton | APY03-beads | |
| Peptide assay kit | Thermo Scientific | 23275 | Step 7 |
| TopTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Steps 5 and 9 |
| SCX columns (PolySULFOETHYL A) | PolyLC Inc | SPESE1203 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| Trifluoracetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | PI-28904 | |
| Acetonitrile (ACN) | Fisher Scientific | A21-1 | |
| Lactic acid | Sigma-Aldrich | 69785-250ML | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Trypsin, TPCK Treated | Worthington Biochemicals | LS003740 | |
| Lysyl Endopeptidase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 125-05061 | |
| MonoTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Step 10 |
| ZipTip | MilliporeSigma | ZTC18S096 | Step 6 |
| nanoEase, MZ peptide BEH C18, 130A, 1.7 μm, 75 μm x 20 cm | Waters | 186008794 | Step 11: analytical column |
| Acclaim PepMap 100 C18 LC Columns | ThermoFisher Scientific | 164535 | Step 11: trap column |
| Ultimate 3000 RLSCnano System | Dionex | ULTIM3000RSLCNANO | Step 11 |
| Q Exactive HF | ThermoFisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | Step 11 |
| MilliQ water | deionized water used to prepare all solutions and bufferes | ||
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | sonicator |
| Polytron System PT | Kinematica AG | PT 10-35 GT | homogenizer |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Paller, C. J., Antonarakis, E. S. Management of biochemically recurrent prostate cancer after local therapy: evolving standards of care and new directions. Clinical Advances in Hematology & Oncology. 11 (1), 14-23 (2013).
- Lowrance, W. T., Roth, B. J., Kirkby, E., Murad, M. H., Cookson, M. S. Castration-resistant prostate cancer: AUA guideline amendment 2015. The Journal of Urology. 195 (5), 1444-1452 (2016).
- Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nature Biotechnology. 28 (7), 710-721 (2010).
- Zhang, Y. Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R.
- Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (4), 1017-1031 (2007).
- Bantscheff, M., Lemeer, S., Savitski, M. M., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: critical review update from 2007 to the present. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (4), 939-965 (2012).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Rubbi, L., et al. Global phosphoproteomics reveals crosstalk between Bcr-Abl and negative feedback mechanisms controlling Src signaling. Science Signaling. 4 (166), ra18 (2011).
- Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
- Rush, J., et al. Immunoaffinity profiling of tyrosine phosphorylation in cancer cells. Nature Biotechnology. 23 (1), 94-101 (2005).
- Fila, J., Honys, D.
- Mertins, P., et al. Proteogenomics connects somatic mutations to signalling in breast cancer. Nature. 534 (7605), 55-62 (2016).
- Drake, J. M., et al. Phosphoproteome integration reveals patient-specific networks in prostate cancer. Cell. 166 (4), 1041-1054 (2016).
- Lue, H. W., et al. Metabolic reprogramming ensures cancer cell survival despite oncogenic signaling blockade. Genes & Development. 31 (20), 2067-2084 (2017).
- Francavilla, C., et al. Phosphoproteomics of primary cells reveals druggable kinase signatures in ovarian cancer. Cell Reports. 18 (13), 3242-3256 (2017).
- Zhang, H., et al. Integrated proteogenomic characterization of human high-grade serous ovarian cancer. Cell. 166 (3), 755-765 (2016).
- Skaggs, B. J., et al. Phosphorylation of the ATP-binding loop directs oncogenicity of drug-resistant BCR-ABL mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (51), 19466-19471 (2006).
- Zimman, A., et al. Activation of aortic endothelial cells by oxidized phospholipids: a phosphoproteomic analysis. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2812-2824 (2010).
- Zimman, A., Berliner, J. A., Graeber, T. G. Phosphoproteomic analysis of aortic endothelial cells activated by oxidized phospholipids. Methods in Molecular Biology. , 53-69 (2013).
- Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Meyer, T. S., Lamberts, B. L. Use of coomassie brilliant blue R250 for the electrophoresis of microgram quantities of parotid saliva proteins on acrylamide-gel strips. Biochimica el Biophysica Acta. 107 (1), 144-145 (1965).
- Bergstrom Lind, S., et al. Immunoaffinity enrichments followed by mass spectrometric detection for studying global protein tyrosine phosphorylation. Journal of Proteome Research. 7 (7), 2897-2910 (2008).
- Pinkse, M. W., Uitto, P. M., Hilhorst, M. J., Ooms, B., Heck, A. J. Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Analytical Chemistry. 76 (14), 3935-3943 (2004).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Olsen, J. V., et al. Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks. Cell. 127 (3), 635-648 (2006).
- Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. The Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
- Bielow, C., Mastrobuoni, G., Kempa, S. Proteomics quality control: quality control software for MaxQuant results. Journal of Proteome Research. 15 (3), 777-787 (2016).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- Bodenmiller, B., Mueller, L. N., Mueller, M., Domon, B., Aebersold, R. Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome. Nature Methods. 4 (3), 231-237 (2007).
- Leitner, A., Sturm, M., Lindner, W. Tools for analyzing the phosphoproteome and other phosphorylated biomolecules: a review. Analytica Chimica Acta. 703 (1), 19-30 (2011).
- Yang, D. S., et al. Design and synthesis of an immobilized metal affinity chromatography and metal oxide affinity chromatography hybrid material for improved phosphopeptide enrichment. Journal of Chromatography A. 1505, 56-62 (2017).
- Al Shweiki, M. R., et al. Assessment of label-free quantification in discovery proteomics and impact of technological factors and natural variability of protein abundance. Journal of Proteome Research. 16 (4), 1410-1424 (2017).
