Summary
Данио рерио были использованы как надежные генетических модельные организмы в биомедицинских исследований, особенно с появлением гена редактирования технологий. Когда личинки фенотипов, как ожидается, добыча и генотип идентификации ДНК может быть сложным. Здесь мы описывают процедуру эффективного генотипирования данио рерио личинок, путем отсечения хвост, 72-h после оплодотворения в кратчайшие сроки.
Abstract
Данио рерио (Danio рерио) обладают orthologues 84% генов, известно, что связано с заболеваниями человека. Кроме того эти животные имеют короткий поколения время, легко обрабатывать, показать высокий уровень репродуктивного, низкая стоимость и легко поддаются генетических манипуляций путем микроинъекции ДНК в эмбрионов. Последние достижения в гене, инструменты редактирования позволяют точного внедрения мутаций и трансгенов в данио рерио. Моделирование в zebrafish часто заболевание приводит к личиночной фенотипы и ранней смерти, которая может быть сложным для интерпретации если генотипы неизвестны. Это раннее выявление генотипов также является необходимой в экспериментах, требующих объединения образцов, таких, как ген выражение или масс спектрометрии исследования. Однако обширные генотипической проверки ограничено традиционными методами, которые в большинстве лаборатории выполняются только на взрослых рыбок данио или в посмертных личинки. Мы решили эту проблему путем адаптации метод для изоляции ПЦР готовые геномной ДНК от живой данио рерио личинки, которые могут быть достигнуты в кратчайшие сроки 72 ч после оплодотворения (hpf). Это время и экономически эффективные техники, по сравнению с ранее опубликованной генотипирования протокол, позволяет идентификации генотипов из микроскопических плавник биопсии. Плавники быстро регенерировать как развиваются личинки. Затем исследователи способны выбрать и поднять желаемого генотипов к взрослой жизни, используя этот высокой пропускной способностью на основе ПЦР генотипирования процедуры.
Introduction
Данио рерио (данио рерио) позвоночных организм, широко используется в качестве модели для проведения расследования болезни, а также для Доклинические испытания терапевтических гипотез1,2,3. Эти животные имеют короткий поколения время, легко обрабатывать, показать высокий уровень репродуктивного, низкая стоимость и легко поддаются генетических манипуляций путем микроинъекции ДНК в4эмбрионов. Через все большее развитие Роман трансгенных и Джин редактирования технологии, такие как Цинк-пальцевый nucleases (ZFN)5, Таль как эффекторных Nucleases (Таленс)6,7и кластерные регулярно Interspaced короткие Рецидивирующий повторяет (ТРИФОСФАТЫ) / связанные ТРИФОСФАТЫ 9 (Cas9) системы8, данио рерио poised для того чтобы существенно улучшить понимание некоторых патологических условий. Эти технологии были использованы для создания целевых нокауты в обоих соматических и микрофлорой ячейки в данио рерио, эффективно порождает генетически изменены животных8. Последние в литературе примерами успешного развития генетической модели эпилепсии и метаболических расстройств в zebrafish3,9,10,11,12 .
С прогресс, достигнутый в zebrafish изменения генома быстрый и надежный генотипирования стал неоспоримым тариф ограничивая шаг. Выявление специфических мутаций ДНК, прилегающих к прогнозируемого изменения генома целевой сайт является важным этапом протокола. Традиционно методов генотипирования плавник отсечения, как правило, только при исполнении несовершеннолетних или взрослых рыбок данио. Однако, время, затраченное поднимая данио рерио до зрелого возраста (> 2 месяца) значительно замедляет прогресс в научных исследованиях. Во многих случаях нельзя достичь совершеннолетия за выбивание важно генов (например, в моделировании болезни) или получить из функция мутаций приводит к пагубным фенотипические эффектам. Кроме того несколько анализов требуют объединения личинок, такие как извлечение RNA или метаболита и таким образом включают предварительной идентификации генотипов, которые может быть сложной задачей, когда доступны только пост Специального генотипирования методы. Эти вышеупомянутые примеры подчеркивают важность личиночной генотипирования методов, которые в то же время точного и полного восстановления и нормального развития личинок. Ранние стадии данио рерио генотипирования не представляется в настоящее время широко использоваться; Это отражено в последних публикациях болезни моделей, в которых определяются личиночной генотипов через post-mortem генотипирования, вместо того, чтобы генотипирования до выполнения эксперимента12,,1314. В этом документе стратегия клип личиночной плавник представлены стремилась улучшить генотипирования ранее установленных процедур.
В прошлом стратегии, используя протеиназы K пищеварения генотип живут данио рерио, личинки привели к переменной полимеразной цепной реакции (ПЦР) эффективности15. Хотя более недавно опубликовал микроскопических хвост биопсии технику предоставляется более многообещающие результаты16, мы и другие группы не смогли воспроизвести высокой эффективностью и восстановления ДНК, сообщили авторы. Серьезный удар протокола, описываемого Уилкинсон и др. 16 может быть передача ткани хвост ПЦР-пробирку. Из-за микроскопических размеров трудно обеспечить надлежащим образом собраны и поворотного закупорить плавника. Для решения этого барьера, мы разработали более протокол для генотипирования большого количества личинки живут рыбки данио рерио с почти 100% эффективность9. С помощью microscalpel, кончик плавник хвоста удаляется и помещены на кусок фильтровальной бумаги. Кусок фильтровальной бумаги, содержащий ткань можно легко визуализировать и правильно помещен в ПЦР-пробирку. Затем выполняется геномной ДНК добыча, следуют амплификации PCR региона интерес к генотип образца. Преимущества этого метода включают высокую эффективность ПЦР, низкий уровень ложных положительных и низкой смертности. Кроме того Генотипирование большого количества эмбрионов можно с помощью этого протокола. Протокол, описываемые позволяет плавник отсечения сотен личинок в течение 2-3 ч, используя этот подход и правильной идентификации генотипируемого рыбы и хвост регенерации в течение двух дней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры с участием животных темы были утверждены и находятся в соответствии с принципами животных ухода представленной Канадского совета Уход за животными и университета Оттавы комитетов ухода за животными.
1. Подготовка
- Подготовьте поверхность рассечения, лентой 9 см Петри блюдо крышкой автоклав лентой по всей внутренней поверхности. Расположите его под микроскопом стерео.
- Место 3-5 дней после оплодотворения (dpf) данио рерио личинок в Петри блюдо и анестезировать в мм Tricaine ˜1.5 в 1 x E3 эмбриона СМИ (5 мм NaCl, 0,17 мм KCl, 0,33 мм2CaCl, 0,33 мм MgSO4, pH 7.2).
- Отрезали конце кончика пипетки P1000 с парой ножницы или лезвие диаметром 2 мм для размещения 3 Личинки dpf с минимальным стрессом.
2. плавник отсечения личинок данио рерио
- Подобрать наркотизированных личинки, с использованием модифицированных микропипеткой P1000 и место данио рерио личинка на ленту позиционируется автоклава на крышке Петри.
- Удалите излишки Tricaine решение, окружающих с помощью микропипеткой личинка. Площадь должна быть сухой, как можно успешно раздел и забрать плавников, но все еще мокрой, чтобы обеспечить выживание.
- С помощью микро скальпель, хвостовой плавник под микроскопом стерео как указано на рисунке 1, как описано в Уилкинсон et al16секция. Во время разреза Придайте устойчивый понижательное давление на сайте разрыв пигмент хвостового плавника, дистальнее ограничение кровообращения (рис. 1A). Придайте нежное давление, чтобы избежать повреждения хорда.
- Визуализации псевдоразреза плавник под микроскопом и положение кусок на вершине кончик microscalpel лезвия (рис. 2A). Место microscalpel, содержащие плавника на поверхность небольшой кусок фильтровальной бумаги.
Примечание: Из-за присутствия меланоцитов в пересекал ткани, этот шаг позволяет визуализировать плавника как небольшое черное пятно (рис. 2B). - С помощью ножницы и щипчики (рис. 2 c), передачи документ фильтр, содержащий плавник 96-луночных ПЦР пластины, содержащих 25 мкл 50 мм раствора NaOH в колодец (Рисунок 2D).
- Подготовьте плоским-96-луночных днище, нумерация также согласно этикетке ПЦР-планшете. С помощью модифицированных P1000 пипетки, заполнены с 200 мкл свежие 1 x E3 эмбриона СМИ, тщательно Соберите личинок данио рерио, с использованием мягкое давление. Отказаться от личинок в культуре ткани 96-луночных пластине, в том же хорошо число как ПЦР пластины (рис. 2е).
- Убедитесь, что фильтр бумага хорошо погружен в раствор (Рисунок 2F). Очищайте лезвие microscapel и пинцет между каждого разреза для предотвращения перекрестного загрязнения путем окунать в раствор EtOH 70%. Протрите с чистой бумаги ткани/стереть.
- Повторите шаги 2.1-2.7, до тех пор, пока все эмбрионы были обрезаны.
- Храните личинки в 96-луночных пластины на 28 ° C, пока не было выявлено генотипов.
Примечание: Эмбриона СМИ не должны быть изменены, так как протокол могут быть легко завершены в менее чем за 2 дня. Если требуется больше времени, рекомендуется изменение средств массовой информации.
3. геномной ДНК добыча
- Уплотнение 96-луночных ПЦР пластины и центрифуги, что образцы на 1000 x g за 1 мин, чтобы убедиться, что все документы фильтр погружен в раствор NaOH.
- Для тканей лизиса тепло образцы в Термоциклер на 95 ° C за 5 мин, после охлаждения до 4 ° C на 10 мин.
- Добавьте 6 мкл 500 мм трис-HCl, рН 8,0 для каждого образца. Вихрь.
- Кратко центрифуга пластину на 1500 x g, за 5 мин при комнатной температуре.
- Использование 1.5 мкл ДНК супернатант в реакции PCR.
- Подготовьте ПЦР на генотип личинки, как показано в таблице 1-2.
Примечание: Этот протокол был протестирован для двух приложений: мультиплексной ПЦР-реакции, выявление генотипа, используя Гели агарозы9и гетеродуплексного плавки пробирного (HMA) выявление генотипов с использованием геля полиакриламида электрофореза (страница)17.
4. альтернативные Genomic извлечения с помощью хелатирующий смолы
- Полный шаг 2,5, добавив фильтр-бумаги с подстриженными плавника 96-луночных ПЦР-планшете, содержащая 30 мкл 5% Хелатирующие смолы (сополимер стирола и дивинилбензола, содержащие парные иминодиацетатными ионов).
Примечание: Этот тип смолы обычно используется для подготовки ДНК ПЦР готовы быстро и эффективно18и лизис ткани. - Выполните шаги 2,6-2,8, как указано.
- Кратко Центрифугуйте образцы, чтобы убедиться, что все фильтровальная бумага погружен в пределах хелатирующий смолы и уплотнением 96-луночных ПЦР-планшете.
- Для тканей лизиса тепло образцы в Термоциклер на 95 ° C в течение 15 мин, после охлаждения до 4 ° C на 10 мин.
Примечание: Этот шаг позволяет лизис и последующей привязки полярных смолы бусины в клетчатых компонентов ДНК и РНК, остаются в растворе. - Кратко Центрифугуйте образцы гранулы смолы бусины и получить ДНК в подвеске.
- Выполните шаги 3,5-3.6 для завершения процедуры генотипирования.
5. применение 1: Мультиплексной ПЦР после анализа геля агарозы
- Таблица 1, учреждена мультиплексной ПЦР реакции для включения дискриминацию между гомозиготных мутантов, heterozygotes и личинки WT. Используйте 96-луночных тепловая велосипедист выполнять ПЦР-реакции, используя Велоспорт условий, описанных в таблице 3.
Примечание: ПЦР-реакции также могут выполняться в любой других обычных ПЦР тепловая велосипедист. Этот пример описывает ПЦР стратегией, используемой пена, и др. 9 для выявления aldh7a1 WT и вставки 5-ВР мутантных аллелей в же мультиплекс реакции. - Подготовить гель агарозы 1% в буфере Борат натрия, окрашенных с 1 x GelRed.
Примечание: 20 x Борат натрия буферный запас состоит из 40 мл 10 M NaOH, 1800 мл ddH2O, pH скорректирована до 8,5 с 76 г борной кислоты и затем завершить окончательный объем 2 Л с помощью ddH2O. - Побегите гель в буфере Борат натрия 1 x 15 мин на 250 V. Чтобы облегчить этот процесс, если возможно, используйте гель системы, которая совместима с многоканальные пипетки для возможностей выше пропускной способности, уменьшая время для загрузки образцов.
- Изображения гель под ультрафиолетовой (УФ) света, чтобы позволить дискриминации различных генотипов.
6. приложения 2: Гетеродуплексного плавки пробирного
- Подготовьте страница 12% гели с помощью пластины распорку 1,5 мм и 15-образцы Расчески. Подготовьте две страницы гели, используя 12.21 мл ddH2O, 2.52 мл 10 x трис/Борат/ЭДТА (КЭ), 10 мл 30% акриламида, 250 мкл 10% Аммония пероксодисульфат (APS) и 20 мкл tetramethylethylenediamine (TEMED). Использовать 1 x TBE буфер (0,089 М трис-HCl, 0,089 M борной кислоты и 0,002 М Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)) как работает буфер.
- Тепло продуктов ПЦР на 94 ° C за 5 мин.
- Прохладный трубы на льду или в Термоциклер 10 мин при 4 ° C.
- Загрузите 10 мкл на ПЦР сэмпл и 8 мкл маркер молекулярного веса.
- Запустите страницу на 150 V в 1 x TBE, с использованием системы вертикального электрофореза, за 1 ч или до маркер молекулярного веса почти достигает линии ног стеклянной пластины.
- Изображения гель под УФ светом допускать дискриминацию различных генотипов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эффективность протоколироване была продемонстрирована генотипирования потомство гетерозиготных Креста (aldh7a1+/ ot100, здесь показано как aldh7a1+ /-) ()на рисунке 3A- C)9. Мутантный аллель aldh7a1ot100имеет 5-база пара (bp) вставки первого кодирования экзона гена aldh7a1 данио рерио, что приводит к фреймшифт и потери функции из-за раннего стоп кодон9. Четыре грунтовки использовались в мультиплекс реакции для получения три отличительные полосы для различения WT, гетерозиготной (aldh7a1+ /-) и генотипов гомозиготных мутант (aldh7a1- / -) (от пена, и др. 9): Gen1_FW 5'-ATGATGCAGCGCGTGCTGAC-3», «Gen2_RV»: 5' - CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3', «5 nt-ins-specific_FW»: 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3» и «WT-specific_RV»: 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3'). Амплификация обе аллели, используя Gen1_FW и Gen1_RV грунты привело ампликон 434-bp. 293-ВР группы возникло от конкретных амплификации аллеля мутанта, и группа 195-ВР был получен специально для WT аллеля, как показано на рисунке 3A. После ПЦР, 8 мкл каждого 20 мкл реакции тома была проанализирована на геле агарозы натрия Борат 1%, как показано на рисунке 3B. Достаточно личиночной ДНК было извлечено из 98% (n = 576) образцов, что приводит к высоким показатель эффективности ПЦР. Экстракции ДНК с помощью метода NaOH получает в среднем 4,7 0,5 нг/мкл личиночной ДНК на сэмпл после процедуры биопсии плавник, в ~ 30 мкл тома. Экстракции ДНК с помощью хелатирующий смолы приводит к подобной доходности, в среднем 3,8 0,5 нг/мкл ДНК на сэмпл. Это количество ДНК, собранных из личинок плавник transections генерирует ПЦР готовые геномной ДНК достаточно высокого качества для идентификации генотипов. Каждый образец ДНК может использоваться в ˜30 реакций амплификации PCR. Амплификация продукты, полученные с помощью грунтовки, Gen1_FW и Gen2_RV может также использоваться для виртуализации приложения9, которые успешно определены 5-ВР вставки в гомозиготной мутантов (aldh7a1- / -) (рис. 3 c ). Сэнгер последовательность была выполнена через внешний сервис для проверки, если продукты PCR были пригодны для этого приложения. Образцы ДНК от геля агарозы подтвердил гомозиготных мутантов и WTs (n = 3) были использованы. Рекорды Phred19 (> 30) были получены, указывающее читает высокого качества, за исключением первого и последнего 40 пар.
Этот протокол был впоследствии используется для генотип различные другие мутации у рыбок данио, гетеродуплексного плавления анализа. Plpbpot101 и plpbpot102 мутантных аллелей гена plpbp (рис. 4A-D) каждый привести к фреймшифт и раннего стоп-кодон. Для того, чтобы определить plpbp-null данио рерио личинки, 2 праймера были использованы для усиливать первый кодирования экзона, включая сайт мутации (plpbp-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 'и plpbp-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3'). Усиление plpbp фрагмента в WT животных приводит в 272-bp ампликон (homoduplex). Ампликон, полученные из plpbpot101 (4-bp удаления аллеля, рис. 4 c) состоит из фрагмент 268-bp и что plpbpot102 (5bp-замены, удаления 2-bp аллеля, Рисунок 4 d), 270-bp, как показано на рисунке 4A-B. После денатурации и отжига ПЦР фрагментов от гетерозиготных животных будет содержать гетеродуплексного и homoduplex ДНК17. Homoduplex и гетеродуплексного полос можно легко отделить и визуализируется с помощью электрофореза геля полиакриламида (страница). Наличие открытых угол между соответствием и несоответствующие нити ДНК, вызванные несовершенной отжига вследствие возникновения мутации вызывают гетеродуплексного ДНК для миграции значительно более медленными темпами, чем ДНК homoduplex17. Различных миграционных производятся различных мутаций. Гетерозиготных генотипов (plpbp+/ ot101, plpbp+/ ot102) поэтому будет отображать фрагменты ДНК гетеродуплексного, а также соединение гетерозиготной (plpbpot101/ot102) (Рисунок 4а-B). Точное генотипирования достигается этот гетеродуплексного плавки пробирного как уникальный шаблон страницы, полученные для каждого генотипа и собственный гетерозиготных мутации могут быть визуализированы (рис. 4A-B). Гомозиготная мутантов будет отображать шаблон homoduplex в страницы-геля и поэтому быть неотличимы WTs. Для различения этих генотипов, еще один раунд страницы гель анализов должны выполняться в какие продукты PCR от WT аллели нужно смешивать с образцами необходимо изучить, как описано в других разделах17.
Около 90% (88/98) WT и гетерозиготных эмбрионов были успешно подняты до зрелого возраста (> 2 месяца). Как потеря функции мутантов, которые отображают ранней смерти фенотип, aldh7a1 и plpbp лечения животные не могут подниматься до совершеннолетия. Однако генотипы всех сохранившихся WT и гетерозиготных взрослых были идентичны личиночной плавник отсечения результатов, указывающее 100% точность скорости для идентификации генотипов с помощью процедуры биопсии личиночной плавник.
Рисунок 1. Клип личиночной плавник. (A). Non разорвала личиночной плавника на три дня после оплодотворения (dpf). Линия представляет сайт перерезка, расположен в пределах разрыв пигмент. Черные стрелки демонстрирует предел хвостового кровообращение. (B). личинки следующее плавник процедуры отсечения на 3 dpf. (C). личиночной данио рерио плавник волоски на 5 dpf. Регенерация плавник от формирования blastemal наблюдается только 2 дня после плавник перерезка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Процедура для отсечения личиночной плавник. (A). личинки находятся на ленту и избыточного эмбриона массовой информации будет удален. Под микроскопом плавник является перерезанных гори в регионе разрыва пигмент, как показано на рисунке 1A. С помощью microscalpel, плавник собраны и помещены на фильтровальную бумагу поверхности просто касанием (B) и может быть легко визуализированы как черное пятно. Держите кусок фильтровальной бумаги, содержащий плавника и вырезать небольшой площади окружающих нужный регион (C). Место небольшой кусок фильтровальной бумаги, содержащий плавника в колодец 96 хорошо плиты (D). Соответствующие личинка должны быть помещены в соответствующий хорошо из 96-луночных пластины с плоским дном в 200 мкл эмбриона СМИ (E). Кусок фильтровальной бумаги необходимо погружать в решении лизис (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
На рисунке 3. Генотипирование гетерозиготных Креста aldh7a1 от личинок плавник биопсии. (A). Ожидаемый результат, где усиление WT и aldh7a1ot100 аллели приводит ампликон 434-bp. 293-ВР группы возникает от амплификации аллеля мутанта (aldh7a1ot100, 5-ВР вставки), и получено 195-ВР полоса для WT аллеля. (B). пример ПЦР-амплификации от aldh7a1 личинок плавник тканей. Переулок 7 показан маркер молекулярного веса 1 КБ. Дорожки 1-6 представляют один плавник биопсии. Результаты ПЦР выявлять aldh7a1- / - (aldh7a1ot100/ot100) генотипов (полоса 1), aldh7a1+ / гетерозиготных генотипов (aldh7a1+/ ot100) (полос 3, 4 и 5) и WT ( aldh7a1+/ +) генотипов (дорожки 2 и 6). (C). выравнивание между виртуализированного WT и аллеля aldh7a1ot100 , показывающий положение вставки 5-ВР мутации. Эта цифра была адаптирована из дополнительного рисунок 5 пена и др. 9 с разрешения от генетики общества Америки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Генотипирование plpbp составные гетерозиготной (2 bp удаления /4 bp удаление) от личинок плавник биопсии. (A). Ожидаемый результат усиления WT аллеля в которых привело к тому, 272-bp ампликонами. 4-bp удаления аллеля (plpbpot101) и 5-ВР замещения с 2-bp удаления аллеля (plpbpot102) производят ампликон длины 268-bp и 270-bp соответственно. Гетеродуплексного образуется между аллеля WT и Мутантный аллель в гетерозиготных генотипов (plpbp+ /). Формирование гетеродуплексного благодаря рассогласовывать аллели приведет к отсталости диапазона в гель, по сравнению с WT homoduplex. (B). амплификации PCR результате личиночной плавник вырезок из потомков plpbp+/ ot101x plpbp+/ ot102 крест. Переулок 1 показан маркер молекулярного веса 1 КБ. Полосы 2-10 представляют один плавник биопсии. Результаты ПЦР выявлять мутант генотипов (plpbp-null составные гетерозиготных plpbpot101/ot102, полосы, 2, 4 и 8), гетерозиготных генотипов (полос 3, 6, 7, 9 и 10) и WT генотипов (майной 5). (C). выравнивание между виртуализированного WT и аллеля plpbpot101 , показывающий положение 4-bp удаления мутации. (D). выравнивание между виртуализированного WT и аллеля plpbpot102 , показывающий положение 2-ВР удаления и замены 5-ВР (жирным шрифтом). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Компоненты | 20 мкл реакция | 100 реакций | Окончательный высококонцентрированные |
| Нуклеаза свободный H2O | 7.45 МКЛ | 745 МКЛ | |
| Го Taq 2 x (Promega, M7122) | 10 МКЛ | 1000 МКЛ | 1 x |
| грунт Gen1_FW | 0,25 МКЛ | 25 МКЛ | 0.125 МКМ |
| Грунтовка 5 nt-ins-specific_FW | 0,3 МКЛ | 30 МКЛ | 0,15 МКМ |
| Gen2_RV грунтовка | 0,25 МКЛ | 25 МКЛ | 0.125 МКМ |
| Грунтовка WT-specific_RV | 0,25 МКЛ | 25 МКЛ | 0.125 МКМ |
| ДНК | 1.5 МКЛ | -- |
Таблицы 1. Реакция условия для PCR используется для мультиплексирования aldh7a1 аллеля в настоящем Протоколе. Праймеры используются заключаются в следующем: Gen1_FW 5' - ATGATGCAGCGCGTGCTGAC - 3', «Gen2_RV»: 5' - CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3», «5 nt-ins-specific_FW»: 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3' и «WT-specific_RV»: 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3'. Грунтовка запасы были 10 мкм.
| Компоненты | Реакция 13 мкл | 100 реакций | Окончательный высококонцентрированные |
| H2O | 3.25 МКЛ | 325 МКЛ | |
| Го Taq 2 x (Promega, M7122) | 6.25 МКЛ | 625 МКЛ | 1 x |
| Грунтовка FW | 1 МКЛ | 100 МКЛ | 0,77 МКМ |
| Грунтовка RV | 1 МКЛ | 100 МКЛ | 0,77 МКМ |
| ДНК | 1.5 МКЛ | -- |
В таблице 2. Условия реакции для ПЦР для plpbp аллеля в настоящем Протоколе. Форвард грунтовка используется был PLPBP-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 'и в обратном, PLPBP-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3'. Грунтовка запасы были 10 мкм.
| Шаг цикла | Темп. | Время | Циклы |
| Первоначальный денатурации | 95 ° C | 3 мин | 1 |
| Денатурировать | 95 ° C | 30 сек | 36 |
| Отжиг * | X ° C | 30 сек | |
| Расширение | 72 ° C | 20 сек/КБ | |
| Окончательное расширение | 72 ° C | 5 мин | 1 |
| 4 ° C | удерживайте |
Таблица 3. Условия PCR, используемые в настоящем Протоколе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Джин, инструменты редактирования применялись точно ввести мутации и трансгенов в zebrafish в последние лет5,6,,78. При выполнении болезни, моделирование в данио рерио, ранних личиночных или несовершеннолетних фенотипов часто наблюдаются9,12,,1314. Представленные здесь протокол описывает экстракции ДНК, ПЦР готовые из небольших рыбок данио личиночной хвост биопсий, позволяя генотипирования личинок в возрасте 3 dpf. Раннее выявление генотипов имеет решающее значение для нескольких приложений, лаборатория, особенно когда пост Специального генотипирования не является возможным9. Зная генотипов с самого раннего возраста также облегчает выживание исследования и фенотипического анализа мутантов. Этот протокол также является особенно полезным для повышения личинки специфическим генотипам до погашения. Личинок генотипирования пока широко не используется в лабораториях данио рерио во всем мире, и этот протокол направлен на содействие распространению этой техники. Во время манипулирования пересекал плавники, использование этого метода обеспечивает уверенность относительно присутствия ДНК внутри образца; плавник биопсии могут быть легко визуализированы как тёмное пятно на фильтровальной бумаге на протяжении всего процесса обработки. Это является важным улучшением протокола Опубликовано Уилкинсон и др. 16.
Несколько важных шагов в рамках протокола, следует правильно, для получения качественных результатов. Прежде всего перерезка личиночной плавник должно произойти в течение пигмент разрыв, дистальнее предел циркуляцию крови, чтобы избежать кровотечения. Это обеспечивает выживание личинки во время биопсии плавник. Кроме того должны соблюдаться черная точка на фильтровальной бумаге, маркировка размещение плавника, перед размещением фильтровальную бумагу в растворе NaOH. Это гарантирует наличие тканей плавника (и, следовательно, ДНК), в каждом примере хорошо. Фильтровальная бумага также должны быть погружены в растворе NaOH гарантировать лизис клеток и успешных экстракции ДНК. Этот протокол не был протестирован для младших возрастов чем 3 dpf, как были использованы только что вылупившихся личинок. В генотип младший эмбрионов (Невыведенные < 3 dpf) Хорион удаления потребуется. В случае, если происходит что недостаточно амплификации PCR, Стандартное PCR оптимизации стратегии должны быть прикладной (например, различной концентрации грунт, отжига температура, и/или концентрации ДНК). Хотя достаточно ДНК извлекается успешно выполнить несколько типов реакций PCR (как показано для генотипирования примеры aldh7a1 и plpbp ), концентрация ДНК получены после этой процедуры отсечения плавник маленький (~ 5 нг/мкл на образец) и таким образом, повышение концентрации ДНК в реакции PCR может позволить больший успех амплификации.
Личиночной плавник ДНК, извлеченные с этот протокол может использоваться для нескольких реакций амплификации, позволяя точной идентификации генотипов личиночной данио рерио и в духе высокой пропускной способности. Гетеродуплексного плавки пробирного в гелях PAGE может использоваться для идентификации различных перегласовок17. Учитывая, что ~ 30 мкл ДНК получается за образец, и ~ 1-1,5 мкл ДНК используется в реакции PCR, около 30 реакций PCR может быть запущен на извлеченные сэмпл. Продукты PCR также подходят для Сэнгер виртуализации приложений; высокое качество чтений были получены, позволяя точное подтверждение WT и гомозиготных мутант последовательности для aldh7a1. Извлечение геномной ДНК из личинок данио рерио имеет множество применений в исследованиях. Первоначальная цель разработки этого протокола был эффективно генотип личинки, которые не достигают зрелости из-за специфических мутаций в aldh7a19. Кроме того этот протокол включен сегрегации генотипов и наблюдения за связанные с эпилепсией фенотипов конкретно в aldh7a1- / - рыбы от личиночной стадии последующей9. Объединение личинки каждого генотипа для подходов, таких как извлечение RNA или метаболита добыча может быть точно выполнен после генотипирования, используя этот личиночной плавник отсечения процедура9. В заключение после короткого периода подготовки, опытного следователя может использовать этот простой и время эффективный протокол, требует только минимальной и недорогие реактивы, регулярно выполнять сотни плавник клипов в день. Использование этого протокола стало возможным исследования, описываемого пена и др. и мы надеемся служат аналогичной цели для более широкого сообщества данио рерио.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить редких болезней модели и сетевой механизм (RDMM) (финансируется Канадским институтов здравоохранения исследований (КНИИЗ) и геном Канада). CK поддерживается стипендия премии UROP (Университет Оттавы). DLJ поддерживается Ванье Канада Магистратура стипендии. ИАП поддерживается премию докторантура стипендий Канадского институтов здравоохранения исследований (КНИИЗ). Авторы благодарят генетики общества Америки для предоставления разрешения опубликовать этот протокол и использовать адаптация дополнительная цифра 5 от пена, и др.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Stewart, A. M., Kalueff, A. V. Developing better and more valid animal models of brain disorders. Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).
- Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: legacies and new directions. Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
- Bedell, V. M., et al. In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Pena, I. A., et al. Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency. Genetics. 207, 1501-1518 (2017).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, 2410 (2013).
- Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135, 249-260 (2015).
- Scheldeman, C., et al. Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).
- Zabinyakov, N., et al. Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology. PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).
- Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), (2016).
- Kawakami, K., Hopkins, N.
- Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
- Zhu, X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 4, 6420 (2014).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).
- Ewing, B., Green, P. Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 8, 175-185 (1998).
