Summary
Zebrafish는 유전자 편집 기술의 출현으로 특히 생물 의학 연구에서 안정적인 유전자 모델 생물으로 사용 되었습니다. 애벌레 고기 예상 되는, DNA 추출 및 유전자 식별 전하실 수 있습니다. 여기, 꼬리 자르기, 빠르면 72 h 후 수정 하 여, zebrafish 애벌레에 대 한 효율적인 유전형 절차를 설명 합니다.
Abstract
Zebrafish (Danio rerio) orthologues를 인간의 질병과 관련 된 것으로 알려진 유전자의 84%를 소유한 다. 또한, 이러한 동물 짧은 생성 시간, 쉽게 처리, 저렴 한 비용, 높은 생식 속도 표시 하는 있고 쉽게 배아에서 DNA의 microinjection에 의해 유전자 조작 의무가 있습니다. 최근 발전 도구를 편집 하는 유전자 돌연변이 제 브라에서 transgenes의 정확한 소개를 활성화는 합니다. 종종 zebrafish에 모델링 질병 해석 genotypes 알려지지 않은 경우에 도전적 일 수 있다 이른 죽음과 애벌레 고기 이끌어 낸다. 이 초기 신분의 genotypes 샘플 풀링 요구 하는 실험에 필요한, 진 식 또는 질량 분석 연구 등 이기도 합니다. 그러나, 광범위 한 genotypic 심사 사후 애벌레 또는 성인 zebrafish에만 수행 됩니다 대부분의 실험실에는 전통적인 방법에 의해 제한 됩니다. 우리는 72 h 후 수정 (hpf)로 빨리 달성 될 수 있는 라이브 zebrafish 애벌레에서 PCR 준비 genomic DNA의 분리 하는 방법에 적응 하 여이 문제를 해결. 이 시간 및 비용 효율적인 기술, 이전 게시 된 유전형 프로토콜에서 향상 된 미세한 핀 biopsies에서 genotypes 식별 수 있습니다. 지 느 러 미는 애벌레 개발에 신속 하 게 다시 생성 합니다. 연구원은 선택 하 고이 높은 처리량 PCR 기반 유전형 절차를 이용 하 여 성인 기에 원하는 genotypes을 올릴 수 있습니다.
Introduction
제 브라 (Danio rerio) 척추 생물 치료 가설1,2,3의 전 임상 시험에 관해서는 뿐만 아니라 질병 조사에 대 한 모델으로 널리 이용 되는. 이 동물 짧은 생성 시간, 쉽게 처리, 저렴 한 비용, 높은 생식 속도 표시 하는 있고 쉽게 배아4DNA의 microinjection에 의해 유전자 조작 의무가 있습니다. 소설 유전자 변형, 유전자 기술 등 아연 손가락 nucleases (ZFN)5, 탈 같은 이펙터 Nucleases (TALENs)6,7는 클러스터 정기적으로 Interspaced 짧은 편집의 증가 개발을 통해 (CRISPR)을 반복 하는 구조/CRISPR 관련 9 (Cas9) 시스템8, zebrafish는 실질적으로 여러 pathologic 조건의 이해를 향상 시킬 태세 이다. 이러한 기술을 모두 체세포 타겟된 녹아웃을 만드는 데는 그리고 zebrafish, 효율적으로 사악한 유전자에 생식 세포 동물8수정. 최근 문학에서 등이 간 질 및 대사 질환의 유전자 모델의 성공적인 개발 zebrafish3,,910,11,12 .
진전 zebrafish 게놈 편집, 신속 하 고 신뢰할 수 있는 유전형 명백한 속도-제한 단계 되고있다. 특정 DNA 변이 예측된 게놈 편집 대상 사이트에 인접 한의 식별 프로토콜의 필수 단계입니다. 전통적으로, 지 느 러 미 클리핑에 의해 유전형 기법만 수행된에 청소년 이나 성인 zebrafish는 일반적으로. 그러나, 성인 기에 올리는 zebrafish 보낸 시간 (> 2 개월) 상당히 지연 연구에 있는 전진. 대부분의 경우, 성인 필수 유전자 (예를 들어, 질병 모델링에서) 또는 해로운 phenotypic 효과로 이어지는 이득의 기능 돌연변이의 녹아웃으로 얻을 수 없다. 또한, 여러 분석 실험 등 RNA 또는 대사 산물 추출, 애벌레의 풀링 요구 하 고 따라서 유일한 특별 게시물 유전형 기술을 사용할 수 있는 경우에 도전적 일 수 있다 genotypes의 사전 식별을 포함. 상기 예제 애벌레 유전형 기법을 정확 하 게 동시에 하 고 전체 복구 및 애벌레의 정상적인 발전의 중요성을 강조 표시 합니다. 초기 단계 zebrafish 유전형 표시 되지 않으면 현재 널리 이용 될; 이 애벌레 genotypes 유전형 실험12,,1314의 실행 전에 보다는 사후 유전형을 통해 식별 되는 질병 모델의 최근 간행물에 의해 반영 됩니다. 이 논문에서는, 애벌레 핀 클립 전략 이전 설립된 유전형 절차를 향상을 목표로 제공 됩니다.
과거에는, K 성분을 소화 유전자 형을 채용 하는 전략 라이브 zebrafish 애벌레 변수 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 효율15이어졌다. 더 최근 미세한 꼬리 생 검 기술은 더 유망한 결과16제공 게시, 비록 우리와 다른 그룹 하지 못했습니다 고효율와 저자에 의해 보고 된 DNA 복구를 재현. 윌 킨 슨 외 에 의해 설명 하는 프로토콜의 주요 좌절 16 PCR 튜브에 꼬리 조직의 전송 될 수 있습니다. 미세한 크기로 인해 fin 수집 및 pipetting으로 적절 하 게 제대로 되었음을 보장 하기 어렵다. 이 배리어를 해결 하기 위해 우리는 유전형 거의 1009라이브 zebrafish 애벌레의 큰 숫자에 대 한 향상 된 프로토콜을 개발 했습니다. microscalpel을 사용 하 여, 지 느 러 미 꼬리의 끝은 제거 하 고 필터 종이 조각에 배치. 조직을 포함 하는 필터 종이 쉽게 시각화 하 고 올바르게 PCR 튜브에 배치 수 있습니다. 게놈 DNA 추출 다음 다음 유전자 형 표본에 관심 영역의 PCR 증폭, 수행 됩니다. 이 방법의 장점은 높은 PCR 효율, 낮은 거짓 긍정적인 평가 낮은 사망률을 포함합니다. 또한, 많은 수의 배아의 유전형이이 프로토콜을 사용 하 여 가능 하다. 여기에 설명 된 프로토콜 지 느 러 미-클리핑 수백이 접근 및 genotyped 물고기와 2 일 이내 꼬리 재생의 정확한 식별을 사용 하 여 2-3 h 이내 애벌레의 수 있습니다.
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Protocol
절차와 관련 된 동물 주제 승인 되며 동물 보호 지침에 따라 제공 캐나다 위원회에 의해 동물 관리 및 오타와의 대학에 동물 보호 위원회.
1입니다. 준비
- 그것의 내부 표면에 걸쳐 9 cm 배양 접시 뚜껑 압력솥 테이프로 녹화 하 여 해 부 표면 준비. 스테레오 현미경 위치.
- 3-5 일 후 수정 (dpf)를 배치 zebrafish 애벌레는 페 트리에서 접시와 ˜1.5 m m Tricaine 1 x E3 배아 미디어 (5 m m NaCl, 0.17 m m KCl, 0.33 m m CaCl2, 0.33 m m MgSO4, pH 7.2)에서 anesthetize.
- 최소한의 스트레스와 3 dpf 애벌레에 맞게 2 mm의 직경에 한 쌍의가 위 또는 면도날과 P1000 피 펫 팁의 끝을 잘라.
2. 지 느 러 미 클리핑 Zebrafish 애벌레의
- 수정된 P1000 micropipette를 사용 하 여 마 취 유 충을 선택 하 고 위치 고압 테이프에 zebrafish 애벌레 Petri 접시 뚜껑에 배치.
- 애벌레는 micropipette를 사용 하 여 주변 초과 Tricaine 솔루션을 제거 합니다. 지역으로 하 여 성공적으로 섹션은 지 느 러 미를 선택 하지만 생존을 위해 아직도 젖은 건조 해야 한다.
- 마이크로 메스, 섹션 윌 킨 슨 외16에 설명 된 대로 그림 1에 표시 된 대로 스테레오 현미경 아래 꼬리 지 느 러 미를 사용 하 여. 절 개를 하는 동안 사이트 내에서 안료 격차는 꼬리 지 느 러 미, 말 초 혈액 순환 (그림 1A)의 한계에의 꾸준한 하향 압력을 적용. notochord 손상 되지 않도록 부드러운 압력을 적용 합니다.
- 현미경 sectioned 지 느 러 미를 시각화 하 고 microscalpel 블레이드 (그림 2A)의 팁 위에 조각 위치. 필터 종이의 작은 조각의 표면에 지 느 러 미를 포함 하는 microscalpel를 놓습니다.
참고: transected 조직에서 melanocytes의 존재로 인해이 단계 작은 블랙 스팟 (그림 2B)로 지 느 러 미의 시각화 수 있습니다. - 50mm 잘 (그림 2D) 당 NaOH 솔루션의 25 μ를 포함 하는 96-잘 PCR 플레이트에 지 느 러 미를 포함 하는 필터 종이 위와 핀셋 (그림 2C), 전송 사용 하.
- PCR 접시의 라벨에 따라 잘 번호 플랫-아래 96 잘 접시를 준비 합니다. 신선한 1 x E3 배아 미디어의 200 µ L로 가득 수정된 P1000 피 펫을 사용 하 여, 조심 스럽게 zebrafish 애벌레 부드러운 압력을 사용 하 여 수집 합니다. 같은 PCR 플레이트 (그림 2E)으로 잘 번호 96-잘 조직 문화 접시에 있는 애벌레를 분배.
- 필터 종이 (그림 2F) 솔루션에 빠져들 잘는 다는 것을 확인 하십시오. Microscapel 70 %EtOH 솔루션으로 그것을 찍기 하 여 교차 오염을 방지 하기 위해 각 컷 사이 핀셋의 블레이드를 청소. 깨끗 한 종이 티슈/지우기와 블레이드를 닦아.
- 2.1-2.7 단계를 반복 하 여 모든 배아 잘립니다 되었습니다.
- genotypes 발견 되었습니다 때까지 28 ° C에 96 잘 접시에 애벌레를 저장 합니다.
참고: 배아 미디어 프로토콜은 2 일 이내에 쉽게 완료 될 수 있다 때문에 바뀔 필요가 없습니다. 더 많은 시간이 필요한 경우 미디어 변경 것이 좋습니다.
3. 게놈 DNA 추출
- 96-잘 PCR 접시와 원심 분리기 1000 x g 되도록 모든 필터 종이 1 분에 샘플 NaOH 솔루션 내에서 잠긴 인감.
- 조직 세포에 대 한 뒤에 10 분 동안 4 ° C에 냉각 5 분 동안 95 ° C에서 thermocycler에서 샘플을 열.
- 500 mM Tris HCl, pH 8.0 각 샘플의 6 μ를 추가 합니다. 와 동입니다.
- 짧게 원심 1500 x g, 실 온에서 5 분에 접시.
- PCR 반응 당 DNA 상쾌한의 1.5 μ를 사용 합니다.
- 표 1-2와 같이 유전자를 PCR는 애벌레를 준비 합니다.
참고:이 프로토콜은 두 응용 프로그램에 대 한 테스트 되었습니다: 다중 PCR 반응 agarose 젤9, heteroduplex 녹는 genotypes polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)17을 사용 하 여 공개 하는 분석 결과 (HMA)을 사용 하 여 유전자 형을 공개.
4. 대체 게놈 추출 Chelating 수 지를 사용 하 여
- 96-잘 PCR 접시에 잘린된 지 느 러 미와 지를 추가 하 여 완료 단계 2.5 킬레이트 화 수 지 (스 티 렌-divinylbenzene 공중 합체 짝된 iminodiacetate 이온을 포함) 5%의 30 μ를 포함.
참고: 수 지의이 종류 주로 조직 세포와 신속 하 고 효율적인 방식으로18에서 PCR 준비 DNA의 준비에 대 한 사용 됩니다. - 단계 2.6-2.8로 표시 합니다.
- 96-잘 PCR 접시를 봉인 하 고 모든 필터 종이 chelating 수 지 내에서 잠긴 ㄴ 다는 것을 확인 하는 예제를 간단히 원심.
- 조직 세포에 대 한 뒤에 10 분 동안 4 ° C에 15 분 동안 95 ° C에서 thermocycler에서 샘플을 열.
참고:이 단계 동안 수 있습니다 세포와 세포질 분 대를 북극 수 지 구슬의 후속 바인딩 DNA와 RNA 해결책에 남아 있다. - 짧게 원심 작은 수 지 구슬 고 현 탁 액에서 DNA를 샘플.
- 3.5-3.6 유전형 절차를 완료 하려면 단계를 따릅니다.
5. 응용 프로그램 1: 다중 PCR Agarose 젤 분석 뒤
- 표 1, 다음 설정 다중 PCR 반응 homozygous 돌연변이, heterozygotes, WT 애벌레 사이 차별 활성화. 96-잘 열 cycler를 사용 하 여 표 3에 설명 된 사이클링 조건을 사용 하 여 PCR 반응을 수행.
참고: PCR 반응 또한 어떤 다른 기존의 PCR 열 cycler에서 수행할 수 있습니다. 이 예제에서는 페 냐, 그 외 여러분 에 의해 사용 되는 PCR 전략을 설명 합니다. aldh7a1 WT 및 같은 다중 반응에서 5 bp 삽입 돌연변이 체 대립 유전자를 확인 9 . - 1 물 나트륨 붕 산 염 버퍼에 1 %agarose 젤 준비 x GelRed.
참고: 나트륨 붕 산 염 버퍼 재고 x 20이 이루어집니다 10 M NaOH, ddH2O, 1800 mL 40 mL의 pH 8.5 붕의 76 g를 조정 하 고 다음 2 L 최종 볼륨 ddH2o.를 사용 하 여 완료 - 1 x 나트륨 붕 산 염 버퍼 250 V에서 15 분 동안에 젤을 실행 합니다. 과정을 촉진 하기 위하여 가능 하다 면, 젤 시스템 샘플 로드 시간을 줄임으로써 더 높은 처리량 기능을 사용 하려면 멀티 채널 pipets와 호환 되는 사용 합니다.
- 이미지 다른 genotypes의 차별 수 있도록 자외선 (UV)에서 젤.
6. 응용 프로그램 2: Heteroduplex 분석 결과 용 해
- 페이지 12% 젤 1.5 m m 간격 장치 격판덮개 15-샘플 빗을 사용 하 여 준비 합니다. 12.21 mL ddH2O, 트리 스/Borate/EDTA (TBE), 30% 아크릴 아 미드 10 mL, 250 μ x 10의 2.52 mL의 10% 염화 persulfate (AP)를 사용 하 여 두 페이지 젤 준비 및 tetramethylethylenediamine (TEMED)의 20 μ. 1 x TBE 버퍼를 사용 하 여 (0.089 0.089 M 붕 산 및 0.002 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) M Tris HCl) 버퍼를 실행.
- 5 분 동안 94 ° C에서 PCR 제품을 열.
- 차가운 얼음에 또는 4 ° c.에서 10 분 동안 thermocycler 튜브
- PCR 견본 당 10 μ 분자량 마커의 8 μ를 로드 합니다.
- 150 V 1 x TBE를 사용 하 여 수직 전기 시스템 1 h 또는 분자량 표식까지 거의 도달 유리 접시의 피트 라인에서 페이지를 실행 합니다.
- 이미지 다른 genotypes의 차별 수 있도록 UV 빛에서 젤.
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Representative Results
protocoll의 효율성 유전형에 의해 입증 되었다 heterozygous 십자가의 자손 (aldh7a1+ ot100, aldh7a1+로 여기 표시) (그림 3A-C)9. Aldh7a1ot100돌연변이 체 대립 유전자에 frameshift와 손실의 기능 때문에 이른 정지 codon9zebrafish aldh7a1 유전자의 첫 번째 코딩 exon 5 기본적인 쌍 (bp) 삽입 합니다. 4 개의 뇌관 WT와 homozygous 돌연변이 (aldh7a1-/-) genotypes heterozygous (aldh7a1+), 구별 3 독특한 밴드를 다중 반응에서 사용 되었다 (페 냐에서 외. 9): Gen1_FW 5'-ATGATGCAGCGCGTGCTGAC-3', "Gen2_RV": 5'-CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3', "5 nt-기능-specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3', 그리고 "WT-specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3'). Gen1_FW 및 Gen1_RV 뇌관을 사용 하 여 두 대립 유전자의 증폭 434-bp amplicon 귀착되는. 293-bp 밴드는 돌연변이 체 대립 유전자의 특정 증폭에서 발생 그리고 195-bp 밴드는 WT 대립 유전자를 위해 특별히 그림 3A와 같이. PCR, 각 20 µ L 반응 볼륨의 8 µ L를 다음 그림 3B와 같이 1 %agarose / 나트륨 붕 산 염 젤에 분석 했다. 충분 한 애벌레 DNA 98%에서 발견 되었다 (n = 576) 샘플, 효율 높은 PCR 결과의. DNA 추출 NaOH 기술을 사용 하 여 평균 4.7 0.5 ng / µ L의 지 느 러 미 생 검 절차 ~ 30 µ L 볼륨에 따라 샘플 당 애벌레 DNA 얻습니다. DNA 추출 chelating 수 지를 사용 하 여 유사한 수확량, 평균 3.8 0.5 ng / µ L의 DNA 샘플 당 발생 합니다. 이 양의 DNA 애벌레 핀 transections에서 수집 genotypes 식별 수 있도록 충분 한 품질의 PCR 준비 게놈 DNA를 생성 합니다. 각 DNA 샘플 ˜30 PCR 증폭 반응에 사용할 수 있습니다. 시퀀싱 응용 프로그램9, 성공적으로 식별 homozygous 돌연변이 (aldh7a1-/-) (그림 3C에서 5 bp 삽입 증폭 제품 뇌관 Gen1_FW 및 Gen2_RV를 사용 하 여 얻은 사용하실 수 있습니다. ). 생어 시퀀싱 PCR 제품이 응용이 프로그램에 대 한 적합 한 경우 테스트 하는 외부 서비스를 통해 수행 되었다. Agarose 젤에서 DNA 샘플 확인 homozygous 돌연변이 WTs (n = 3 각) 사용 되었다. 높은 Phred19 점수 (> 30) 첫 번째 및 마지막 40 자료 쌍을 제외 하 고 높은 품질 읽기를 나타내는 가져온.
이 프로토콜은 이후 heteroduplex 분석을 용 해 하 여 다양 한 다른 zebrafish 돌연변이 유전자 형을 사용. Plpbp 유전자의 (그림 4A-D) 각 plpbpot101 및 plpbpot102 돌연변이 대립 frameshift 및 이른 정지 codon으로 이어질. Plpbp식별-null zebrafish 애벌레, 2 개의 뇌관 돌연변이 사이트를 포함 하 여 첫 번째 코딩 exon를 증폭 하는 데 사용 되었다 (plpbp-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 '와 plpbp-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3'). WT 동물에 plpbp 단편의 증폭 272-bp amplicon (homoduplex)에서 발생합니다. Plpbpot101 (4-bp 삭제 대립 유전자, 그림 4C)에서 얻은 amplicon 268-혈압의 조각 및 plpbpot102 (5bp 대체, 2 bp 삭제 대립 유전자, 그림 4D)의 이루어져 있다 270-혈압, 그림 4A-B에서 보듯이 변성, 어 닐 링 후 PCR 파편 heterozygous 동물에서 heteroduplex 및 homoduplex DNA17포함 됩니다. Homoduplex 및 heteroduplex 밴드 쉽게 분리 될 수 있다 그리고 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)를 사용 하 여 시각. 돌연변이의 발생으로 인해 불완전 한 어 닐 링에 의해 발생 하는 일치 하 고 일치 하지 않는 DNA 물가 사이 오픈 각도의 heteroduplex homoduplex DNA17보다 훨씬 느린 속도로 마이그레이션할 DNA 발생할. 고유한 마이그레이션 패턴 독특한 돌연변이 의해 생산 됩니다. Heterozygous genotypes (plpbp+ ot101, plpbp+ ot102) 따라서 heteroduplex DNA 파편으로 heterozygous 화합물 (plpbpot101/ot102) (그림 표시 4A-B). 정확한 유전형이이 heteroduplex 독특한 페이지 패턴 각 유전자 형을 획득 하 고 뚜렷한 heterozygous 돌연변이 구상 될 수 있다 분석 결과 용 해 (그림 4A-B)에 의해 얻은. Homozygous 돌연변이 페이지 젤에 homoduplex 패턴을 표시 하 고 따라서 WTs를 구별할 수 있을 것. 이러한 genotypes 구별, 페이지 젤 분석의 또 다른 라운드 WT 대립 필요가17설명 되어 있는 대로, 공부 샘플 혼합에서 PCR 제품에서 수행 되어야 합니다.
약 90% (88/98) WT 및 heterozygous 배아를 성공적으로 성인 기에 올렸다 (> 2 개월). Aldh7a1 와 plpbp 는 이른 죽음 표현 형을 표시 하는 손실의 기능 돌연변이, 치료 되지 않는 동물 성인 기에 발생 하지 수 없습니다. 그러나, 모든 살아남은 WT 및 heterozygous 성인 genotypes genotypes 애벌레 핀 생 검 절차를 사용 하 여 식별에 대 한 100% 정확도 비율을 나타내는 애벌레 핀 클리핑 결과 동일 했다.
그림 1입니다. 애벌레 핀 클립. (A). 3 일 후 수정 (dpf)에서 애벌레 핀 비 절단. 라인은 transection, 안료 간격 내에 있는 사이트를 나타냅니다. 검은 화살표 꼬리 혈액 순환의 한계를 보여 줍니다. (B). 유 충 다음 지 느 러 미 3 dpf에서 클리핑 절차. (C). 5 dpf에 애벌레 zebrafish 핀 자라나. 지 느 러 미 재생 blastemal 대형에서 유일한 2 일 후 느 transection을 관찰 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 애벌레 핀 클리핑 절차. (A). 애벌레 테이프에 놓이고 초과 배아 미디어 제거 됩니다. 그림 1A와 같이 현미경, fin 안료 간격의 지역에서 transected은. microscalpel을 사용 하는 지 느 러 미를 수집 하 고 필터 종이에 배치 하면 터치 (B), 표면 및 검은 반점으로 쉽게 구상 될 수 있다. 필터 종이 지 느 러 미를 포함 하 고 원하는 지역 (C)를 둘러싼 작은 정사각형을 잘라. 96 잘 접시 (D)의 우물에는 지 느 러 미를 포함 하는 필터 종이의 작은 조각을 놓습니다. 해당 유 충 배아 미디어 (E)의 200 µ L에서 평면 아래 96 잘 접시의 해당 배치 되어야 합니다. 필터 종이 조각 세포의 용 해 솔루션 (F)에서 침수 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 유전형 애벌레 핀 biopsies에서 aldh7a1 heterozygous 십자가의. (A). 예상된 결과 WT 및 aldh7a1ot100 대립 유전자의 증폭 434-bp amplicon에 결과. 293-bp 밴드 (aldh7a1ot100, 5 bp 삽입), 돌연변이 체 대립 유전자의 증폭에서 발생 그리고 195-bp 밴드는 WT 대립 유전자에 대 한. (B). aldh7a1 애벌레 지 느 러 미 조직에서 예의 PCR 증폭. 1 kb 분자량 마커 레인 7에 표시 됩니다. 레인 1-6 각 단일 지 느 러 미 생을 나타냅니다. PCR 결과 확인 aldh7a1-/- (aldh7a1ot100/ot100) genotypes (1 레인) aldh7a1+ heterozygous genotypes (aldh7a1+ ot100) (3, 4, 및 5 차선)와 무게 ( aldh7a1+ +) genotypes (레인 2, 6)입니다. (C). 정렬 시퀀스 WT 5 bp 삽입 돌연변이의 위치를 보여주는 aldh7a1ot100 대립 유전자 사이. 이 수치는 페 냐 외 의 보충 그림 5에서 적응 시켰다 9 미국의 유전학 사회에서 부여 하는 권한이 있는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. Plpbp 의 유전형 heterozygous (2 bp 삭제/4 bp)에서 삭제 애벌레 핀 biopsies 복합. (A). 예상된 결과 WT 대립 유전자의 증폭 272-bp amplicon에 결과. 4 혈압 삭제 대립 유전자 (plpbpot101)와 2 혈압 삭제 대립 유전자 (plpbpot102)와 5-bp 대체 각각 amplicon 길이 268-혈압과 270-bp의 생산. heteroduplex WT 대립 유전자 (plpbp+) heterozygous 유전자에 돌연변이 체 대립 유전자 사이 형성 된다. 대립 유전자 일치 때문에 heteroduplex의 형성 WT homoduplex에 비해 젤 내의 악대의 지체가 될 수 있습니다. (B). PCR 확대의 자손의 애벌레 핀 잘라낸에서 결과 plpbp+ ot101x plpbp+ ot102 십자가. 1 kb 분자량 마커 레인 1에 표시 됩니다. 차선 2-10 각 단일 지 느 러 미 생을 나타냅니다. PCR 결과 식별 돌연변이 genotypes (plpbp-null 복합 heterozygous plpbpot101/ot102, 2, 4, 및 8 차선), heterozygous genotypes (3, 6, 7, 9, 및 10 차선)와 WT genotypes (5 레인). (C). 시퀀스 WT 및 4-bp 삭제 돌연변이의 위치를 보여주는 plpbpot101 대립 유전자 사이의 정렬. (D). 정렬 시퀀스 WT (굵게) 2-혈압 삭제 및 5 bp 대체의 위치를 보여주는 plpbpot102 대립 유전자 사이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 구성 요소 | 20 μ 반응 | 100 반응 | 최종 하자마자 |
| Nuclease 무료 H2O | 7.45 Μ | 745 Μ | |
| 이동-Taq 2 (Promega, M7122) x | 10 Μ | 1000 Μ | 1 x |
| 뇌관 Gen1_FW | 0.25 Μ | 25 Μ | 0.125 Μ M |
| 뇌관 5 nt-기능-specific_FW | 0.3 Μ | 30 Μ | 0.15 Μ M |
| 뇌관 Gen2_RV | 0.25 Μ | 25 Μ | 0.125 Μ M |
| 뇌관 WT-specific_RV | 0.25 Μ | 25 Μ | 0.125 Μ M |
| DNA | 1.5 Μ | -- |
표 1입니다. 멀티플렉스 PCR에 사용에 대 한 반응 조건에서 aldh7a1 이 프로토콜에서 대립 유전자. 사용 하는 뇌관은 다음과 같습니다: Gen1_FW 5'-ATGATGCAGCGCGTGCTGAC-3', "Gen2_RV": 5'-CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3', "5 nt-기능-specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3', 그리고 "WT-specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3'. 뇌관 주식 10 µ M 이었다입니다.
| 구성 요소 | 13 μ 반응 | 100 반응 | 최종 하자마자 |
| H2O | 3.25 Μ | 325 Μ | |
| 이동-Taq 2 (Promega, M7122) x | 6.25 Μ | 625 Μ | 1 x |
| 뇌관 FW | 1 Μ | 100 Μ | 0.77 Μ M |
| 뇌관 RV | 1 Μ | 100 Μ | 0.77 Μ M |
| DNA | 1.5 Μ | -- |
표 2입니다. PCR에 사용에 대 한 반응 조건 plpbp 이 프로토콜에서 대립 유전자. 앞으로 뇌관을 사용 했다 PLPBP-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 '와 반대로, PLPBP-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3'. 뇌관 주식 10 µ M 이었다입니다.
| 사이클 단계 | 임시입니다. | 시간 | 사이클 |
| 초기 변성 | 95 ° C | 3 분 | 1 |
| 변성 시키기 | 95 ° C | 30 초 | 36 |
| 어 닐 링 * | ° C X | 30 초 | |
| 확장 | 72 ° C | 20 초/kb | |
| 마지막 확장 | 72 ° C | 5 분 | 1 |
| 4 ° C | 보류 |
표 3입니다. 이 프로토콜에 사용 되는 PCR 조건.
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Discussion
편집 도구는 정확 하 게 지난 돌연변이 제 브라에서 transgenes 소개 고용 되었다 유전자 년5,6,,78. 질병 zebrafish에 모델링을 수행할 때 초기 애벌레 또는 젊은 고기는 종종9,12,13,14을 관찰 하 게 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜 설명 3 dpf 어린 애벌레의 유전형을 수 있도록 작은 zebrafish 애벌레 꼬리 생 검에서 PCR 준비 DNA 추출을 합니다. 특히 특별 게시물 유전형 하지 않을 때 가능한9genotypes의 조기 식별 여러 실험실 응용, 결정적 이다. 이른 나이에서 genotypes을 알고 또한 용이 하 게 생존 연구 및 phenotypic 돌연변이 분석. 이 프로토콜은 또한 특정 genotypes 성숙의 애벌레의 양육에 대 한 특히 유용 합니다. 애벌레 유전형은 아직 널리 사용 되지 않습니다 zebrafish 실험실에는 전세계 그리고이 프로토콜이 기술의 보급을 촉진 하는 것을 목표로. Transected 지 느 러 미를 조작 하는 동안이 메서드를 사용 하 여 샘플; 내 DNA의 존재로 신뢰를 제공 합니다. 지 느 러 미 생 처리 과정 전반에 걸쳐 필터 종이에 짙은 반점으로 쉽게 구상 될 수 있다. 이 윌 킨 슨 외 의해 프로토콜의 중요 한 향상을 나타냅니다. 16.
프로토콜 내에서 몇 가지 중요 한 단계 품질 결과를 얻을 올바르게 따라야 합니다. 맨먼저, 애벌레 지 느 러 미의 transection 안료 간격, 출혈 방지, 혈액 순환 제한 하 원심 내에서 발생 해야 합니다. 이 지 느 러 미 생 검 동안 애벌레의 생존을 보장합니다. 또한, 지 느 러 미의 위치를 표시 하는 필터 종이에 검정색 점이 NaOH 솔루션에서 필터 종이 배치 하기 전에 관찰 해야 합니다. 이 각 샘플 잘에 지 느 러 미 조직 (와 그러므로, DNA)의 존재를 보장합니다. 필터 종이 또한 셀 세포 및 DNA 추출 NaOH 솔루션 내에서 몰두 해야 합니다. 이 프로토콜은 부 화 애벌레만 사용 했다 3 dpf 보다 젊은 연령에 대 한 테스트 하지. 유전자 형 젊은 배아를 (깐 < 3 dpf) chorion 제거 해야 할 것 이다. 그 부족 한 PCR 증폭 발생, 표준 PCR 최적화 전략 적용 (예를 들어, 다양 한 뇌관 농도, 온도, 또는 DNA 농도 어 닐 링) 이어야 한다. 충분 한 DNA PCR 반응 ( aldh7a1 및 plpbp 유전형 예제와 같이)의 여러 종류를 성공적으로 수행을 추출, 다음 지 느 러 미 클리핑 절차 얻은 DNA의 농도 작은 (~ 5 ng / µ L 당 샘플) 따라서, 증폭의 큰 성공에 대 한 수 있습니다 PCR 반응에 있는 DNA의 농도 증가.
이 프로토콜 추출 애벌레 핀 DNA 애벌레 zebrafish genotypes와 높은 처리 방식으로 정확한 식별을 허용 여러 증폭 반응에 사용할 수 있습니다. Heteroduplex 분석 결과 페이지 젤에 녹는 다른 돌연변이17를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. DNA의 ~ 30 μ는 샘플에 따라 받은 고 ~ 1-1.5 μ DNA의 PCR 반응 당 사용, 추출된 샘플 당 약 30 PCR 반응은 실행할 수 있습니다. PCR 제품은 또한 적합 생어 시퀀싱 응용 프로그램; 읽기의 높은 품질, WT의 정확한 확인 및 aldh7a1를 위한 homozygous 돌연변이 시퀀스 얻은 했다. 애벌레 zebrafish에서 게놈 DNA 추출 연구에 많은 응용 프로그램을 있다. 이 프로토콜을 개발에 대 한 원래 목표 aldh7a19특정 돌연변이 인해 성인에 도달할 수 없는 유전자 형 애벌레 효과적으로 했다. 또한,이 프로토콜 활성화 genotypes의 분리와 특히 애벌레 단계 이후9 aldh7a1-/- 물고기에에서 고기 간 연결의 관측. RNA 추출 등 대사 산물 추출 방법에 대 한 각 유전자 형의 애벌레의 풀링 유전형 클리핑 절차9이 애벌레 지 느 러 미를 사용 하 여 후 정확 하 게 실행할 수 있습니다. 결론적으로, 훈련의 짧은 기간 후 경험된 조사만 최소화 하 고 저렴 한 시 약, 정기적으로 수행 하는 하루 핀 클립의 수백을 요구이 간단 하 고 시간 효율적인 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용 가능 하 게 페 냐 그 외 여러분 에 의해 설명 하는 연구 그리고 잘하면 광범위 한 제 브라 지역 사회에 대 한 유사한 목적을 될 것입니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
저자는 드문 질병 모델과 메커니즘 (RDMM) 네트워크 (캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR) 및 게놈 캐나다에 의해 자금)을 감사 하 고 싶습니다. CK은 UROP 장학금 수상 (오타와의 대학)에 의해 지원 됩니다. DLJ는 Vanier 캐나다 대학원 장학금에 의해 지원 됩니다. IAP는 캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR) 박사 후 펠로 십 수상에 의해 지원 됩니다. 저자는 유전학의 미국 협회 권한을 부여에 대 한이 프로토콜을 게시 하 고 페 냐에서 보충 그림 5의 적응을 사용 하 여 감사 외.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
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