Summary
وقد استخدمت الزرد كالكائنات نموذج الوراثية الموثوقة في البحوث الطبية الحيوية، لا سيما مع ظهور تكنولوجيات تحرير الجينات. عندما تعمل اليرقات المتوقع، تحديد النمط الوراثي واستخراج الحمض النووي يمكن أن يكون تحديا. هنا، نحن تصف إجراء التنميط تتسم بكفاءة لليرقات الزرد، بقطع الذيل، أقرب وقت الإخصاب بعد 72-ح.
Abstract
الزرد (دانيو rerio) تمتلك أورثولوجويس 84 في المائة من الجينات معروفة مرتبطة بالأمراض التي تصيب الإنسان. وبالإضافة إلى ذلك، هذه الحيوانات يكون وقت جيل قصيرة وسهلة للتعامل معها، وعرض ارتفاع معدل الإنجاب، منخفضة تكلفة، وقابلة بسهولة للتلاعب الجيني ب microinjection من الحمض النووي في الأجنة. وتمكن التقدم الذي أحرز مؤخرا في الجينات أدوات تحرير دقيقة مقدمة للطفرات والمتسلسلات في الزرد. المرض النمذجة في الزرد غالباً ما يؤدي إلى تعمل اليرقات والوفاة المبكرة التي يمكن أن يكون تحديا لتفسير إذا كانت الأنماط الوراثية غير معروفة. هذا التحديد المبكر للأنماط الجينية أيضا المطلوبة في التجارب التي تتطلب تجميع عينة، مثل الجينات التعبير أو كتلة دراسات قياس الطيف الكتلي. ومع ذلك، يقتصر فحص واسعة النطاق قد بالطرق التقليدية، التي يتم تنفيذها فقط في الزرد الكبار أو في تشريح الجثة اليرقات في معظم مختبرات. لقد عالجت هذه المشكلة بتكييف أسلوب لعزل الحمض النووي جاهزة لبكر من اليرقات الحية الزرد التي يمكن أن يتحقق في أقرب وقت الإخصاب بعد ح 72 (hpf). هذا الوقت وتقنية فعالة من حيث التكلفة، وتحسن من بروتوكول التنميط منشورة سابقا، يتيح تحديد الأنماط الجينية من خزعات زعنفة مجهرية. بسرعة تجديد الزعانف تتطور اليرقات. ثم الباحثين قادرة على تحديد ورفع الوراثية المطلوبة لمرحلة البلوغ باستخدام هذا الفائق إجراء التنميط القائم على بكر.
Introduction
الزرد (دانيو rerio) هو أحد الكائنات الفقارية المستخدمة على نطاق واسع كنموذج للتحقيق المرض، وكذلك فيما يتعلق بالتجارب الإكلينيكية للفرضيات العلاجية1،،من23. هذه الحيوانات يكون وقت جيل قصيرة وسهلة للتعامل معها، وعرض ارتفاع معدل الإنجاب، منخفضة تكلفة، وقابلة بسهولة للتلاعب الجيني ب microinjection من الحمض النووي في الأجنة4. من خلال التطور المتزايد للرواية المعدلة وراثيا والجينات تحرير تكنولوجيات مثل إصبع الزنك nucleases (زفن)5،6،مثل تل المستجيب Nucleases (تالينس)7، و "تجمع بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة" المتناوب ويكرر (كريسبر)/المرتبطة كريسبر 9 (Cas9) نظام8، الزرد تستعد لتحسين فهم عدة شروط مرضية إلى حد كبير. استخدمت هذه التكنولوجيات لإنشاء المستهدفة بالضربة القاضية في على حد سواء جسدية وتعديل الخلايا germline في الزرد، كفاءة توليد وراثيا للحيوانات8. وتشمل الأمثلة الأخيرة في الأدب التنمية الناجحة للنماذج الوراثية للصرع واضطرابات التمثيل الغذائي في الزرد3،،من910،11،12 .
مع التقدم المحرز في تحرير الجينوم الزرد، أصبح التنميط سريعة وموثوق بها خطوة الحد من معدل لا يمكن إنكاره. تحديد محددة طفرات الحمض النووي المجاورة لموقع الهدف توقع تحرير الجينوم مرحلة أساسية من البروتوكول. تقليديا، عادة ما تكون تقنيات التنميط بالقطع زعنفة الزرد المؤداة في الأحداث أو الكبار فقط. إلا أن الوقت الذي يقضيه الزرد رفع إلى سن البلوغ (> 2 أشهر) إلى حد كبير تأخير التقدم في البحوث. في كثير من الحالات، لا يمكن تحقيق مرحلة البلوغ بسبب التقديم من الجينات الأساسية (مثلاً، في نمذجة المرض) أو مكسب للدالة الطفرات تؤدي إلى آثار ضارة المظهرية. وباﻹضافة إلى ذلك، فحوصات عدة تتطلب تجميع اليرقات، مثلما حدث في استخراج الحمض النووي الريبي أو المستقلب، وهكذا تنطوي على تحديد مسبق للأنماط الجينية، التي يمكن أن تكون صعبة عندما تتوفر تقنيات التنميط فقط وظيفة المخصصة . هذه الأمثلة المذكورة أعلاه تبرز أهمية تقنيات التنميط اليرقات وهي في نفس الوقت الدقيق وتمكين الانتعاش الكامل والتطور الطبيعي لليرقات. التنميط الزرد المرحلة المبكرة لا يظهر حاليا لاستخدامها على نطاق واسع؛ ويتجلى هذا المنشورات الأخيرة لنماذج الأمراض الوراثية اليرقات التي حددت عن طريق التنميط الجثة بدلاً من التنميط قبل تنفيذ التجربة12،،من1314. في هذه الورقة، يرد مقطع زعنفة يرقات استراتيجية تهدف إلى تحسين إجراءات التنميط المحددة سابقا.
في الماضي، تعيش استراتيجيات توظيف الهضم بروتيناز ك للنمط الوراثي الزرد اليرقات أدت إلى متغير بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد) كفاءة15. على الرغم من أن أكثر مؤخرا بنشر تقنية خزعة ذيل مجهرية قدمت نتائج واعدة أكثر16، نحن ومجموعات أخرى لم تكن قادرة على إنتاج عالية الكفاءة واسترداد الحمض النووي أفاد مقدمو البلاغ. نكسة كبيرة للبروتوكول، المذكورة ويلكنسون et al. يمكن أن يكون 16 نقل الأنسجة الذيل إلى أنبوب PCR. نظراً لحجمها المجهري، من الصعب ضمان أن fin التي تم جمعها بشكل صحيح والاستغناء عن طريق بيبيتينج. ولمعالجة هذا العائق، وضعنا بروتوكولا محسنة للتنميط أعدادا كبيرة من اليرقات الزرد العيش مع ما يقرب من 100 ٪ كفاءة9. استخدام ميكروسكالبيل، إزالة غيض من زعنفة الذيل وتوضع على قطعة من ورق الترشيح. ويمكن تصور سهولة قطعة ورق الترشيح التي تحتوي على الأنسجة ووضعها بشكل صحيح في أنبوب PCR. ثم يتم استخراج الحمض النووي الجينوم، تليها [بكر] تضخيم المنطقة من الفائدة للنمط الوراثي العينة. وتشمل مزايا هذا الأسلوب من كفاءة PCR عالية، وانخفاض معدل إيجابية كاذبة ومعدل وفيات منخفض. بالإضافة إلى ذلك، التنميط عدد كبير من الأجنة من الممكن استخدام هذا البروتوكول. يسمح البروتوكول الخاص الموضحة هنا زعنفة-قطع مئات من اليرقات داخل ح 2-3 باستخدام هذا النهج وتحديد الهوية الصحيحة من الأسماك جينوتيبيد والتجدد الذيل في غضون يومين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
إجراءات المواد الحيوانية التي تنطوي عليها، وهي وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان المقدمة من المجلس الكندي "رعاية الحيوان" وجامعة أوتاوا لجان الرعاية الحيوانية.
1-إعداد
- تحضير السطح التشريح بتسجيل غطاء صحن بيتري 9 سم مع شريط اﻷوتوكﻻف عبر سطحه الداخلية. وضعه تحت مجهر ستيريو.
- مكان الإخصاب بعد 3-5 أيام (إدارة الشرطة الاتحادية) الزرد اليرقات في بتري طبق وتخدير في ˜1.5 مم تريكيني في وسائل الإعلام الجنين x E3 1 (كلوريد الصوديوم، 0.17 مم بوكل، 0.33 مم كاكل2، 0.33 مم MgSO4، الرقم الهيدروجيني 7.2 ملم 5).
- قطع نهاية طرف ماصة P1000 مع زوج من مقص أو شفرة حلاقة ليبلغ قطرها 2 مم لاستيعاب 3 يرقة إدارة الشرطة الاتحادية مع حد أدنى من الإجهاد.
2-fin القطع يرقات الزرد
- التقاط يرقة أنيسثيتيزيد استخدام ميكروبيبيتي P1000 تم التعديل ووضع اليرقة الزرد إلى شريط اﻷوتوكﻻف متوضعة على غطاء طبق بيتري.
- إزالة الحل تريكيني الزائدة المحيطة اليرقة استخدام ميكروبيبيتي. يجب أن تكون المنطقة جافة قدر الإمكان للفرع وتلتقط fin بنجاح ولكن لا يزال الرطب لضمان البقاء على قيد الحياة.
- استخدام مشرط الصغرى، قسم fin والذيلية تحت مجهر ستيريو كما هو مبين في الشكل 1، كما هو موضح في ويلكنسون وآخرون16. خلال الشق، تنطبق ضغط الهبوطي مطرد داخل الموقع الفجوة الصباغ زعنفة والذيلية، البعيدة لحد دوران الدم (الشكل 1A). تطبيق ضغط لطيف لتجنب إتلاف في نوتوتشورد.
- تصور fin مقطعة تحت المجهر ووضع قطعة على رأس غيض من شفرة ميكروسكالبيل (الشكل 2A). ضع ميكروسكالبيل التي تحتوي على زعنفة على سطح قطعة صغيرة من ورق الترشيح.
ملاحظة: بسبب وجود الخلايا الصباغية في الأنسجة بحف، تسمح هذه الخطوة التصور زعنفة كبقعة سوداء صغيرة (الشكل 2). - باستخدام مقص وملاقط (الشكل 2)، نقل ورقة تصفية تتضمن fin لصفيحة بكر 96-جيدا، وتحتوي على 25 ميكروليتر من حل هيدروكسيد الصوديوم 50 مم كل بئر (الشكل 2D).
- إعداد لوحة 96-جيدا مسطحة القاع، ترقيم البئر وفقا للتسمية لصفيحة PCR. بعناية باستخدام ماصة P1000 المعدلة مليئة ميليلتر 200 جديدة وسائط الجنين x E3 1، جمع اليرقة الزرد استخدام ضغط لطيف. الاستغناء عن اليرقة في لوحة زراعة الأنسجة 96، حسنا، بنفس رقم جيدا كلوحة بكر (الشكل 2E).
- تأكد من أن أوراق الترشيح هو أيضا غارقة في الحل (الشكل 2 واو). تنظيف بليد ميكروسكابيل وملاقط بين كل قطع لمنع التلوث عبر طريق غمس أنه في حل EtOH 70%. مسح الشفرة مع الأنسجة/مسح ورقة نظيفة.
- كرر الخطوات من 2.1-2.7 حتى قد تم قص جميع الأجنة.
- تخزين اليرقات في لوحة 96-جيدا عند 28 درجة مئوية حتى قد حددت الأنماط الجينية.
ملاحظة: وسائط الإعلام الجنين لا تحتاج إلى تغيير، حيث يمكن إكمال البروتوكول بسهولة في أقل من يومين. إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من الوقت، يوصي بتغيير وسائط.
3. استخراج الحمض النووي الجينوم
- ختم بلوحة بكر 96-جيدا والعينات في 1,000 س ز لمدة 1 دقيقة للتأكد من أن جميع أوراق التصفية مغمورة ضمن الحل هيدروكسيد الصوديوم للطرد المركزي.
- لتحلل الأنسجة، الحرارة العينات في ثيرموسيكلير عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق متبوعاً بالتبريد إلى 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- إضافة ميكروليتر 6 500 مم تريس-HCl، pH 8.0 لكل عينة. دوامة.
- الطرد المركزي باختصار اللوحة في 1,500 س ز، لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- استخدام 1.5 ميكروليتر من المادة طافية الحمض النووي كل تفاعل PCR.
- إعداد بكر للنمط الوراثي اليرقات، كما هو مبين في الجدول 1-2.
ملاحظة: تم اختبار هذا البروتوكول لاثنين من التطبيقات: متعدد PCR ردود فعل الكشف عن النمط الوراثي باستخدام المواد الهلامية [اغروس]9، وهيتيرودوبليكس ذوبان المقايسة (HMA) الكشف عن الأنماط الجينية باستخدام هلام polyacrylamide التفريد (صفحة)17.
4-البديل استخراج الجينوم استخدام راتنج شيلاتينغ
- إكمال الخطوة 2، 5 عن طريق إضافة ورق الترشيح مع fin قص لوح بكر 96، حسنا، تتضمن ميكروليتر 30% 5 خالب الراتنج (كوبوليمر الستيرين-ديفينيلبينزيني التي تحتوي على أيونات إيمينودياسيتاتي المزدوجة).
ملاحظة: يستخدم هذا النوع من الراتنج عادة لتحلل الأنسجة والتحضير للحمض النووي جاهزة لبكر في طريقة سريعة وفعالة18. - اتبع الخطوات 2.6-2.8 كما هو مبين.
- إغلاق لوحة بكر 96-جيدا وإيجاز الطرد المركزي العينات للتأكد من أن كل عامل تصفية الورق هو مغمورة داخل الراتنج شيلاتينغ.
- لتحلل الأنسجة، الحرارة العينات في ثيرموسيكلير عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تليها التبريد إلى 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: هذه الخطوة يسمح تحلل والربط اللاحقة من حبات راتنج القطبية للمكونات الخلوية بينما تظل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي في الحل. - باختصار الطرد المركزي العينات لبيليه الراتنج الخرز والحصول على الحمض النووي في التعليق.
- اتبع الخطوات 3.5-3.6 لإكمال الإجراء التنميط.
5-تطبيق 1: متعدد PCR متبوعاً بتحليل [اغروس] هلام
- اتباع الجدول 1، إعداد فعل PCR متعدد لتمكين بالتمييز بين طفرات متماثل، heterozygotes ووزن اليرقات. استخدام cycler حرارية 96-جيدا للقيام بردود فعل PCR استخدام الدراجات الشروط الموضحة في الجدول 3.
ملاحظة: ردود فعل PCR يمكن أيضا إجراء في أي الأخرى التقليدية بكر الحراري cycler. يصف هذا المثال بكر الاستراتيجية المستخدمة من قبل بينا, et al. 9 تحديد aldh7a1 WT والإدراج 5-بي بي الآليلات متحولة في نفس رد الفعل متعدد. - تعد من 1% [اغروس] هلام في المخزن المؤقت بورات الصوديوم، ملطخة 1 x GelRed.
ملاحظة: يتكون من 40 مل من 10 M هيدروكسيد الصوديوم، 1800 مل ddH2س، 20 x المخزون الاحتياطي بورات الصوديوم الأس الهيدروجيني تعديلها إلى 8.5 مع 76 غ من الماء المقطر وثم الانتهاء إلى الحجم النهائي ل 2 استخدام سين ddH2 - تشغيل الهلام في 1 x بورات الصوديوم العازلة لمدة 15 دقيقة على 250 الخامس. ولتيسير هذه العملية، إذا كان ذلك ممكناً، استخدام نظام جل متوافق مع بيبيتس متعددة القنوات لتمكين قدرات إنتاجية عالية بتقليل وقت تحميل عينات.
- صورة الجل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) للسماح بالتمييز من الأنماط الجينية المختلفة.
6-تطبيق 2: هيتيرودوبليكس ذوبان الإنزيم
- إعداد صفحة 12% الجل باستخدام لوحة مباعدة 1.5 مم وأمشاط 15-عينات. إعداد اثنين الجل الصفحة استخدام مل 12.21 ddH2س، 2.52 مل 10 × تريس/بورات/يدتا (TBE)، 10 مل من الاكريلاميد 30 ٪، 250 ميكروليتر من فوق كبريتات الأمونيوم 10% (الجزائرية) و 20 ميكروليتر من تيتراميثيليثيلينيدياميني (تيميد). استخدام المخزن المؤقت x TBE 1 (0.089 م تريس-HCl، م 0.089 الماء المقطر وحامض الإيثيلين 0.002 M (يدتا)) كتشغيل المخزن المؤقت.
- الحرارة منتجات PCR في 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- تبريد الأنابيب على الجليد أو في ثيرموسيكلير لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
- تحميل 10 ميكروليتر كل عينة PCR و 8 ميكروليتر علامة الوزن الجزيئي.
- قم بتشغيل الصفحة 150 الخامس في 1 x TBE استخدام نظام التفريد رأسي ح 1 أو حتى علامة الوزن الجزيئي تقريبا تصل إلى خط سيرا على الأقدام لصفيحة الزجاج.
- صورة الجل تحت الأشعة فوق البنفسجية للسماح بالتمييز من الأنماط الجينية المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التنميط وكفاءة بروتوكول تجلى ذرية الصليب متخالف (aldh7a1+ ot100، يظهر هنا ك aldh7a1+/--) (الشكل 3 ألف-ج)9. اليل متحولة aldh7a1ot100له إدراج زوج 5-قاعدة (bp) في إكسون الترميز الأول من الجينات aldh7a1 الزرد التي تؤدي إلى فراميشيفت وفقدان لوظيفة نتيجة مبكرة كودون وقف9. واستخدمت كبسولة تفجير أربعة في رد فعل متعدد للحصول على ثلاثة نطاقات مميزة للتفريق بين WT متخالف (aldh7a1+/--) والأنماط الجينية المسخ متماثل (aldh7a1--/--) (من بينا، وآخرون. 9): Gen1_FW 5 '-أتجاتجكاجكجكجتجكتجاك-3'، "Gen2_RV": 5 '-كككتتجاككتكاكاجاجت-3'، "nt-وظائف-specific_FW 5": 5 '-تجتتتكاكجتكاكج-3'، و "WT-specific_RV": 5 '-تكككتجتككتككككاجاك-3'). وأسفرت تضخيم الآليلات على حد سواء باستخدام الإشعال Gen1_FW و Gen1_RV amplicon 434-بي بي. عصابة 293-bp تنشأ عن التضخيم محددة من اليل متحولة، وتم الحصول على عصابة 195-بي بي على وجه التحديد اليل WT, كما هو موضح في الشكل 3 ألف. وقد تم تحليل بعد بكر، 8 ميليلتر من حجم رد فعل كل 20 ميليلتر في جل بورات صوديوم [اغروس]/1%، كما هو موضح في الشكل 3 (ب). تم استرداد كافية من الحمض النووي اليرقات من 98% (n = 576) العينات، أدى إلى ارتفاع معدل كفاءة PCR. استخراج الحمض النووي باستخدام تقنية هيدروكسيد الصوديوم يحصل في المتوسط 4.7 0.5 نانوغرام/ميليلتر من الحمض النووي اليرقات كل عينة اتباع الإجراء خزعة زعنفة، في حجم ~ 30 ميليلتر. ويؤدي استخراج الحمض النووي باستخدام راتنج شيلاتينغ عائد مماثلة، في المتوسط 3.8 0.5 من نانوغرام/ميليلتر من الحمض النووي، كل عينة. هذه الكمية من الحمض النووي التي جمعت من زعنفة اليرقات ترانسيكشنز يولد المجينية الحمض النووي PCR جاهزة ذات نوعية كافية للسماح للتعرف على الأنماط الجينية. يمكن استخدام كل عينة الحمض النووي في ˜30 بكر التضخيم ردود الفعل. يمكن أيضا استخدام منتجات التضخيم الحصول عليها باستخدام كبسولة تفجير Gen1_FW و Gen2_RV لتسلسل الطلبات9، التي نجحت في تحديد إدراج 5-بي بي في طفرات متماثل (aldh7a1--/--) (الرقم 3 ). سانغر التسلسل أنجز عن طريق خدمة خارجية اختبار ما إذا كانت المنتجات PCR مناسبة لهذا التطبيق. وأكدت عينات من الحمض النووي من [اغروس] هلام طفرات متماثل و WTs (n = 3 كل) استخدمت. تطوير19 درجات عالية (> 30) تم الحصول عليها تشير إلى جودة عالية على ما يلي: باستثناء أزواج قاعدة 40 الأولى والأخيرة.
وكان هذا البروتوكول في وقت لاحق يستخدمها هيتيرودوبليكس ذوبان التحليل إلى التركيب الوراثي مختلف الطفرات الزرد الأخرى. الآليلات متحولة بلبببot101 و بلبببot102 بلببب الجينات (الشكل 4 أ-د) كل يؤدي إلى فراميشيفت وكودون التوقف المبكر. بغية تحديد بلببب-استخدمت اليرقات الزرد فارغة، كبسولة تفجير اثنين لتضخيم إكسون الترميز الأول بما في ذلك موقع الطفرة (بلببب--و 5 '-جكاكتكتجكتاتجتجاجا-3' و آر بلببب 5 '-أجكتجتكاكتكاتكككتكجت-3'). ويؤدي التضخيم الجزء بلببب في وزن الحيوانات amplicon 272-بي بي (هومودوبليكس). أمبليكون التي تم الحصول عليها من بلبببot101 (الحذف 4-بي بي اليل، الرقم 4) يتكون من جزء من 268-بي بي ومن بلبببot102 (5bp-الاستبدال، والحذف 2-بي بي اليل، الرقم 4) 270-بريتيش بتروليوم، كما هو مبين في الشكل 4 أ-ب. بعد تمسخ والصلب، سيتضمن الشظايا بكر من الحيوانات متخالف الحمض النووي هيتيرودوبليكس وهومودوبليكس17. يمكن فصلها بسهولة عصابات هومودوبليكس وهيتيرودوبليكس وتصور استخدام التفريد جل polyacrylamide (صفحة). تسبب وجود زاوية مفتوحة بين المطابقة وغير المطابقة من خيوط الحمض النووي الناجم عن الصلب ناقصة بسبب حدوث الطفرات هيتيرودوبليكس الحمض النووي لترحيل بوتيرة أبطأ إلى حد كبير من الحمض النووي هومودوبليكس17. أنماط الهجرة متميزة تنتجها الطفرات المتميزة. الأنماط الجينية متخالف (بلببب+ ot101، بلببب+ ot102) أن ذلك عرض شظايا من الحمض النووي هيتيرودوبليكس، فضلا عن مجمع متخالف (بلبببot101/ot102) (الشكل 4A-ب). التنميط دقيقة يتم الحصول عليها بهذه هيتيرودوبليكس ذوبان المقايسة كما يتم الحصول على نمط صفحة فريدة من نوعها لكل الوراثي ويمكن تصور الطفرات متخالف متميزة (الشكل 4 أ-ب). أن عرض نمط هومودوبليكس في جل صفحة طفرات متماثل وبالتالي يكون تمييزه إلى WTs. للتمييز بين هذه الأنواع الوراثية، ينبغي إجراء جولة أخرى من الصفحة جل التحليلات في المنتجات التي بكر من وزن الآليلات الحاجة إلى أن تكون مختلطة مع العينات لدراستها، كما هو موضح في مكان آخر من17.
حوالي 90% (88/98) WT والأجنة متخالف أثيرت بنجاح إلى سن البلوغ (> 2 أشهر). كما aldh7a1 و بلببب من طفرات الخسارة من الدالة التي يتم عرضها النمط الظاهري موت مبكر، لا يمكن طرحه الحيوانات غير المعالجة إلى سن البلوغ. ومع ذلك، الوراثية WT جميع الباقين على قيد الحياة والكبار متخالف كانت مطابقة لنتائج القطع زعنفة اليرقات، التي تشير إلى نسبة دقة 100% للتعرف على الأنماط الجينية باستخدام الإجراء خزعة زعنفة اليرقات.
رقم 1. مقطع زعنفة اليرقات. (أ)-عدم قطع الزعانف اليرقات في ثلاثة أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية). الخط الذي يمثل موقع ترانسيكشن، تقع داخل الفجوة الصباغ. رأس السهم الأسود يوضح الحد الأقصى لدوران الدم والذيلية. (ب)-بعد يرقة زعنفة القطع الداخلي في إدارة الشرطة الاتحادية 3. (ج)-نمو الزعنفة الزرد اليرقات في 5 إدارة الشرطة الاتحادية. ويلاحظ التجديد زعنفة من تشكيل بلاستيمال ترانسيكشن زعنفة بعد يومين فقط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. الداخلي للقطع زعنفة اليرقات. (أ)-توضع اليرقات على الشريط وهو إزالة الوسائط الأجنة الزائدة. تحت المجهر، fin هي بحف في منطقة فجوة الصباغ كما هو مبين في الشكل 1 ألف. استخدام ميكروسكالبيل، fin التي تم جمعها وتوضع على ورقة تصفية السطحي ببساطة عن طريق اللمس (ب)، ويمكن تصور سهولة كبقعة سوداء. عقد قطعة ورق الترشيح التي تتضمن fin وقطع مربع صغير المحيطة بالمنطقة المطلوب (ج). ضع قطعة صغيرة من ورقة تصفية تتضمن fin في بئر صفيحة جيدا 96 (د). ينبغي أن توضع اليرقة المقابلة في المقابل جيدا من لوحة مسطحة القاع 96-جيدا في 200 ميليلتر وسائط الجنين (ه). ينبغي غمر قطعة ورق الترشيح في حل تحلل (F). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. الوراثي للصليب aldh7a1 متخالف من خزعات زعنفة اليرقات. (A). النتيجة المتوقعة حيث يؤدي تضخيم الآليلات WT و aldh7a1ot100 أمبليكون 434-بي بي. عصابة 293-bp ينبع من تضخيم اليل المسخ (aldh7a1ot100، الإدراج 5-بي بي)، وهو الحصول على عصابة 195-بي بي اليل WT. (ب)-مثال من [بكر] تضخيم من أنسجة زعنفة اليرقات aldh7a1 . ويرد في حارة 7 علامة وزن الجزيئي 1 كيلو بايت. 1-6 كل الممرات تمثل خزعة زعنفة واحدة. تحديد نتائج PCR aldh7a1-/- (aldh7a1ot100/ot100) الوراثية (لين 1)، aldh7a1+/- الأنماط الجينية متخالف (aldh7a1+ ot100) (الممرات 3 و 4 و 5) و WT ( aldh7a1+ +) الأنماط الجينية (الممرات 2 و 6). (ج)-المواءمة بين WT متسلسلة واليل aldh7a1ot100 عرض موقف الطفرة الإدراج 5-بي بي. هذا الرقم هو مقتبس من 5 الرقم الإضافي من بينا et al. 9 مع الإذن الممنوح من "المجتمع علم الوراثة في أمريكا". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. التنميط بلببب مجمع متخالف (2 bp الحذف 4 bp الحذف) من خزعات زعنفة اليرقات. (A). النتيجة المتوقعة حيث أسفر تضخيم اليل WT amplicon 272-بي بي. اليل الحذف 4-بي بي (بلبببot101) واستبدال 5-بي بي مع الحذف 2-بي بي اليل (بلبببot102) إنتاج أطوال amplicon 268 bp و 270-بي بي على التوالي. هو شكلت هيتيرودوبليكس بين اليل WT واليل طافرة في النمط وراثي متخالف (بلببب+/-). تشكيل هيتيرودوبليكس سبب غير متطابقة الآليلات سوف يسبب التخلف العقلي للفرقة داخل الجل مقارنة هومودوبليكس WT. (ب). [بكر] تضخيم الناجمة عن قصاصات زعنفة اليرقات ذرية بلببب+ ot101x plpbp+ ot102 الصليب. ويرد في حارة 1 علامة وزن الجزيئي 1 كيلو بايت. 2-10 كل الممرات تمثل خزعة زعنفة واحدة. نتائج PCR تحديد الأنماط الجينية المسخ (بلببب-متخالف مركب فارغة بلبببot101/ot102، والممرات 2 و 4 و 8)، الأنماط الجينية متخالف (الممرات 3، 6، 7، 9 و 10) ووزن الأنماط الجينية (لين 5). (ج)-المواءمة بين WT متسلسلة واليل بلبببot101 عرض موقف طفرة الحذف 4-بي بي. (د)-المواءمة بين WT متسلسلة واليل بلبببot102 عرض موقف الحذف 2-بي بي واستبدال 5-بي بي (غامق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| المكونات | رد 20 ميكروليتر | 100 من ردود الفعل | الأسفلت النهائي |
| خالية من نوكلاس ح2س | ميكروليتر 7.45 | ميكروليتر 745 | |
| الذهاب-تق 2 x (Promega، M7122) | 10 ميكروليتر | 1000 ميكروليتر | س 1 |
| التمهيدي Gen1_FW | ميكروليتر 0.25 | 25 ميكروليتر | ميكرومترات 0.125 |
| التمهيدي 5 nt-وظائف-specific_FW | ميكروليتر 0.3 | ميكروليتر 30 | 0.15 ميكرو |
| Gen2_RV التمهيدي | ميكروليتر 0.25 | 25 ميكروليتر | ميكرومترات 0.125 |
| التمهيدي WT-specific_RV | ميكروليتر 0.25 | 25 ميكروليتر | ميكرومترات 0.125 |
| الحمض النووي | 1.5 ميكروليتر | -- |
الجدول 1. شروط multiplex PCR يستخدم لرد فعل aldh7a1 اليل في هذا البروتوكول. الإشعال المستخدمة كما يلي: Gen1_FW 5 '-أتجاتجكاجكجكجتجكتجاك-3"،"Gen2_RV": 5 '-كككتتجاككتكاكاجاجت-3'،"nt-وظائف-specific_FW 5": 5 '-تجتتتكاكجتكاكج-3'، و"WT-specific_RV": 5 '-تكككتجتككتككككاجاك-3'. وكانت مخزونات التمهيدي 10 ميكرون.
| المكونات | رد فعل ميكروليتر 13 | 100 من ردود الفعل | الأسفلت النهائي |
| ح2س | ميكروليتر 3.25 | 325 ميكروليتر | |
| الذهاب-تق 2 x (Promega، M7122) | ميكروليتر 6.25 | 625 ميكروليتر | س 1 |
| التمهيدي مهاجم | 1 ميكروليتر | 100 ميكروليتر | ميكرومترات 0.77 |
| التمهيدي RV | 1 ميكروليتر | 100 ميكروليتر | ميكرومترات 0.77 |
| الحمض النووي | 1.5 ميكروليتر | -- |
الجدول 2. شروط PCR يستخدم لرد فعل بلببب اليل في هذا البروتوكول- التمهيدي إلى الأمام المستخدمة كانت بلببب إف 5 '-جكاكتكتجكتاتجتجاجا-3' وعكس، بلببب-R 5 '-أجكتجتكاكتكاتكككتكجت-3'. وكانت مخزونات التمهيدي 10 ميكرون.
| دورة خطوة | درجة الحرارة. | الوقت | دورات |
| تمسخ الأولى | 95 درجة مئوية | 3 دقيقة | 1 |
| يشوه | 95 درجة مئوية | 30 ثانية | 36 |
| الصلب * | × درجة مئوية | 30 ثانية | |
| ملحق | 72 درجة مئوية | 20 ثانية/كيلو بايت | |
| التمديد النهائي | 72 درجة مئوية | 5 دقيقة | 1 |
| 4 درجة مئوية | عقد |
الجدول 3. بكر الشروط المستخدمة في هذا البروتوكول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الجينات قد استخدمت أدوات التحرير التحديد استحداث الطفرات والمتسلسلات في الزرد على مدى سنوات5،6،،من78. تعمل اليرقات أو الأحداث المبكرة عند أداء مرض النمذجة في الزرد، كثيرا ما يلاحظ9،12،،من1314. ويصف البروتوكول المعروضة هنا استخراج الحمض النووي جاهزة لبكر من خزعات الذيل اليرقات الصغيرة الزرد، تمكين التنميط يرقات صغيرات 3 إدارة الشرطة الاتحادية. التعرف المبكر على الأنماط الجينية حاسم بالنسبة للعديد من التطبيقات المختبرية، خصوصا عندما وظيفة المخصص التنميط ليست ممكنة9. معرفة الأنماط الجينية من سن مبكرة يسهل أيضا بقاء دراسات وتحليلات المظهرية من طفرات. هذا البروتوكول أيضا مفيدة بشكل خاص لتربية اليرقات من الأنماط الجينية المحددة للاستحقاق. التنميط اليرقات لم لم يستخدم على نطاق واسع في مختبرات الزرد عبر العالم، ويهدف هذا البروتوكول تسهيل نشر هذه التقنية. أثناء معالجة الزعانف بحف، استخدام هذا الأسلوب يوفر الثقة فيما يتعلق بوجود الحمض النووي داخل العينة؛ يمكن تصور خزعة زعنفة سهولة كبقعة مظلمة على ورق الترشيح طوال عملية مناولة. وهذا يمثل تحسنا هاما من البروتوكول نشرتها ويلكنسون et al. 16.
يجب اتباع عدة خطوات حاسمة ضمن البروتوكول بشكل صحيح للحصول على نتائج عالية الجودة. أولاً وقبل كل شيء، يجب أن تحدث ترانسيكشن زعنفة اليرقات داخل الفجوة الصباغ، البعيدة لحد دوران الدم، لتجنب النزيف. وهذا يضمن بقاء اليرقات خلال خزعة fin. وعلاوة على ذلك، يجب مراعاة نقطة سوداء على ورقة تصفية، وسم موضع fin، قبل وضع ورق الترشيح في حل هيدروكسيد الصوديوم. وهذا يؤكد وجود أنسجة زعنفة (ومن ثم الحمض النووي) في كل عينة جيدا. يجب أن تكون مغمورة ورق الترشيح أيضا ضمن حل هيدروكسيد الصوديوم لضمان تحلل الخلية واستخراج الحمض النووي الناجحة. تم اختبار هذا البروتوكول لا للصغار الذين تتراوح أعمارهم من 3 إدارة الشرطة الاتحادية كما استخدمت فقط مظلل اليرقات. للأجنة الوراثي الأصغر سنا (لم يفقس < 3 إدارة الشرطة الاتحادية) يلزم إزالة المشيمة. في حالة حدوث هذا التضخيم PCR غير كافية، ينبغي أن تكون استراتيجيات التحسين PCR القياسية المطبقة (مثلاً، يتراوح تركيز التمهيدي، والصلب درجة الحرارة، و/أو تركيز الحمض النووي). على الرغم من أن يتم استخراج الحمض النووي كافية لأداء بنجاح عدة أنواع من ردود الفعل بكر (كما هو موضح لأمثلة التنميط aldh7a1 وبلببب )، تركيز الحمض النووي التي تم الحصول عليها بعد هذا الإجراء القطع زعنفة صغيرة (~ 5 نانوغرام/ميليلتر للواحد عينة) وهكذا، زيادة تركيز الحمض في تفاعل PCR قد تسمح لمزيد من النجاح للتضخيم.
زعنفة اليرقات الحمض النووي المستخرج مع هذا البروتوكول يمكن استخدامها لتضخيم العديد من ردود الفعل، مما يتيح تحديد دقيق للأنماط الجينية الزرد اليرقات وبطريقة الفائق. يمكن استخدام هيتيرودوبليكس ذوبان المقايسة في الهلام صفحة تحديد الطفرات مختلفة17. نظراً لأن ميكروليتر ~ 30 من الحمض النووي يتم الحصول على كل عينة، ويستخدم ميكروليتر ~ 1-1.5 من الحمض النووي لتفاعل PCR، يمكن تشغيل حوالي 30 بكر ردود العينة المستخرجة. منتجات PCR أيضا مناسبة للتطبيقات سانغر التسلسل؛ تم الحصول على الجودة العالية للقراءات، السماح لتأكيد دقة WT وتسلسلات متحولة متماثل ل aldh7a1. استخراج الحمض النووي من الزرد اليرقات له العديد من التطبيقات في مجال البحوث. وكان الهدف الأصلي لوضع هذا البروتوكول إلى فعالية اليرقات الوراثي لا يمكن أن تصل إلى مرحلة البلوغ بسبب طفرات معينة في aldh7a19. وبالإضافة إلى ذلك، تمكين هذا البروتوكول الفصل بين الأنماط الجينية، ومراقبة مرتبطة بالصرع تعمل على وجه التحديد في aldh7a1الأسماك-/- من مرحلة اليرقات فصاعدا9. تجميع يرقات لكل النمط الوراثي للنهج مثل استخراج الحمض النووي الريبي أو استخراج المستقلب يمكن بدقة تنفيذها بعد الوراثي باستخدام هذا زعنفة اليرقات القطع الداخلي9. وفي الختام، بعد فترة قصيرة من التدريب، محقق ذوي خبرة يمكن استخدام هذا البروتوكول بسيطة وفعالة من حيث الوقت، تتطلب فقط من الكواشف ضئيلة وغير مكلفة، لأداء مئات قصاصات زعنفة يوميا بشكل روتيني. مكن استخدام هذا البروتوكول البحوث وصف بينا et al. وسوف نأمل أن تخدم غرضاً مماثلة للمجتمع الزرد الأوسع نطاقا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
المؤلف يود أن يشكر نماذج الأمراض النادرة والشبكة الآلية (ردمم) (تموله المعاهد الكندية للبحوث الصحية (استوفوا) وكندا الجينوم). كورونا تشيكية معتمد من قبل على جائزة منحة أوروب (جامعة أوتاوا). دلج تدعمه "منحة Vanier كندا العليا". ويدعم الأكاديميات بمنح زمالات ما بعد الدكتوراه في معاهد كندية لبحوث صحية (استوفوا). يشكر المؤلفون في "علم الوراثة الجمعية الأمريكية" لمنح الإذن لنشر هذا البروتوكول واستخدام لتكيف من 5 الرقم الإضافي من بينا، وآخرون.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Stewart, A. M., Kalueff, A. V. Developing better and more valid animal models of brain disorders. Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).
- Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: legacies and new directions. Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
- Bedell, V. M., et al. In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Pena, I. A., et al. Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency. Genetics. 207, 1501-1518 (2017).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, 2410 (2013).
- Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135, 249-260 (2015).
- Scheldeman, C., et al. Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).
- Zabinyakov, N., et al. Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology. PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).
- Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), (2016).
- Kawakami, K., Hopkins, N. Rapid identification of transgenic zebrafish. Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).
- Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
- Zhu, X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 4, 6420 (2014).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).
- Ewing, B., Green, P. Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 8, 175-185 (1998).
