Summary
Zebrafish sono stati usati come organismi modello genetico affidabile nella ricerca biomedica, soprattutto con l'avvento delle tecnologie di modifica del gene. Quando sono previsti fenotipi larvali, identificazione di estrazione ed il genotipo di DNA può essere impegnativo. Qui, descriviamo una procedura efficiente genotipizzazione per larve di zebrafish, coda di ritaglio, più presto 72 h post-fertilizzazione.
Abstract
Zebrafish (Danio rerio) possiedono ortologhi per l'84% dei geni conosciuti per essere associati con malattie umane. Inoltre, questi animali hanno un tempo di generazione breve, sono facili da gestire, visualizzare un alto tasso riproduttivo, basso costo e sono facilmente suscettibili di manipolazioni genetiche di microiniezione di DNA negli embrioni. Gli avanzamenti recenti nel gene strumenti di editing consentono precisa introduzione di mutazioni e transgeni in zebrafish. Malattia di modellazione in zebrafish spesso porta a fenotipi larvali e morte precoce, che può essere difficile da interpretare se genotipi sono sconosciuti. Questa identificazione precoce dei genotipi è anche necessario negli esperimenti che richiedono la messa in comune di campione, come studi di gene expression o massa spettrometria. Tuttavia, vasta selezione genotipica è limitata dai metodi tradizionali, che nella maggior parte dei laboratori vengono eseguite solo su zebrafish adulto o nelle larve post mortem. Abbiamo affrontato questo problema adattando un metodo per l'isolamento di DNA genomic di PCR-pronto da larve di zebrafish live che può essere raggiunta anche prima, come la post-fecondazione 72h (hpf). Questo tempo e tecnica economica, migliorato da un protocollo di genotipizzazione precedentemente pubblicati, permette l'identificazione di genotipi da biopsie di pinna al microscopio. Le pinne rigenerano rapidamente come si sviluppano le larve. I ricercatori sono quindi in grado di selezionare e raccogliere i genotipi desiderati all'età adulta utilizzando questa procedura basata sulla PCR genotyping di alto-rendimento.
Introduction
Il danio zebrato (Danio rerio) è un organismo vertebrato ampiamente utilizzato come modello per le indagini di malattia anche per quanto riguarda il test preclinici di ipotesi terapeutiche1,2,3. Questi animali hanno un tempo di generazione breve, sono facili da gestire, visualizzare un alto tasso riproduttivo, basso costo e sono facilmente suscettibili di manipolazioni genetiche di microiniezione di DNA in embrioni4. Attraverso il crescente sviluppo del romanzo transgenico e gene editing tecnologie quali Zinc-Finger nucleasi (ZFN)5, TAL-come effettore nucleasi (TALENs)6,7e il cluster regolarmente intervallate breve Palindromo si ripete (CRISPR) / CRISPR-collegata 9 (Cas9) sistema8, zebrafish è pronta a migliorare sostanzialmente la comprensione delle diverse condizioni patologiche. Queste tecnologie sono state utilizzate per creare forature mirate in entrambi somatiche e cellule germinali in zebrafish, efficientemente nascimenti geneticamente modificati animali8. Esempi recenti nella letteratura includono lo sviluppo positivo di modelli genetici di epilessia e disturbi metabolici in zebrafish3,9,10,11,12 .
Con i progressi compiuti in zebrafish editing genomico, rapida e affidabile la genotipizzazione è diventato un innegabile punto dilimitazione. Identificazione delle specifiche mutazioni del DNA adiacente al luogo di destinazione prevista modifica del genoma è una fase essenziale del protocollo. Tradizionalmente, tecniche di genotipizzazione di ritaglio pinna sono di solito solo eseguita in zebrafish giovanile o adulta. Tuttavia, il tempo speso zebrafish sensibilizzazione all'età adulta (> 2 mesi) ritarda considerevolmente gli avanzamenti nella ricerca. In molti casi, l'età adulta non può essere realizzato a causa il Ko di geni essenziali (ad es., nella modellazione di malattia) o mutazioni con guadagno di funzione che conduce agli effetti nocivi fenotipici. Inoltre, diversi saggi richiedono la messa in comune delle larve, come estrazione RNA o metabolita e coinvolgono così l'identificazione preventiva dei genotipi, che può essere difficile quando sono disponibili solo post hoc, tecniche di genotipizzazione. Questi esempi di cui sopra evidenziano l'importanza delle tecniche di genotipizzazione larvale allo stesso tempo preciso e consentono il recupero completo e normale sviluppo delle larve. Genotipizzazione di zebrafish fase precoce non sembra attualmente essere ampiamente usato; Questo si riflette da recenti pubblicazioni dei modelli di malattia in cui larvali genotipi sono identificati tramite post mortem genotipizzazione anziché genotipizzazione prima dell'esecuzione dell'esperimento12,13,14. In questa carta, una strategia di clip pinna larvale è presentata con l'obiettivo di migliorare le procedure di genotipizzazione precedentemente stabilito.
In passato, strategie che impiegano la digestione della proteinasi K a genotipo live zebrafish larve hanno portato alla variabile della polimerasi reazione a catena (PCR) efficienza15. Anche se più recentemente pubblicato tecnica di biopsia della coda al microscopio fornito più promettenti risultati16, noi e altri gruppi non erano in grado di riprodurre l'alta efficienza e recupero di DNA segnalati dagli autori. Una grave battuta d'arresto del protocollo descritto da Wilkinson et al. 16 potrebbe essere il trasferimento del tessuto coda nella provetta PCR. Grazie alle sue dimensioni microscopiche, è difficile garantire che la pinna è stato correttamente raccolti e dispensata da pipettaggio. Per affrontare questa barriera, abbiamo sviluppato un protocollo migliore per grandi numeri di genotipizzazione di larve di zebrafish live con quasi il 100% di efficienza9. Utilizzando un microscalpel, la punta della coda pinna è rimosso e collocata su un pezzo di carta da filtro. Il pezzo di carta da filtro contenente il tessuto può essere visualizzato prontamente e correttamente inserito in un tubo PCR. Estrazione del DNA genomico viene quindi eseguita, seguita dall'amplificazione di PCR della regione di interesse al genotipo del campione. I vantaggi di questo metodo includono un alta efficienza PCR, un basso tasso di falsi positivi e un tasso di mortalità basso. Inoltre, la genotipizzazione di un gran numero di embrioni è possibile utilizzando questo protocollo. Il protocollo descritto nel presente documento consente pinna-ritaglio di centinaia di larve all'interno di 2-3 h utilizzando questo approccio e la corretta identificazione di pesce genotipizzati e rigenerazione di coda entro due giorni.
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Protocol
Le procedure che coinvolge soggetti animali sono stati approvati e sono conformi alle linee guida di cura degli animali fornite dal Consiglio canadese su Animal Care e Università di Ottawa comitati di cura degli animali.
1. preparazione
- Preparare la superficie di dissezione registrando un coperchio di scatola di Petri di 9 cm con nastro autoclave in tutta la sua superficie interna. Posizionarlo sotto un microscopio stereo.
- Posizionare la post-fecondazione 3-5 giorni (dpf) larve di zebrafish in un Petri dish e anestetizzare in ˜1.5 mM tricaina nei media di 1 x E3 dell'embrione (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, pH 7,2).
- Tagliare l'estremità della punta di una pipetta di P1000 con un paio di forbici o una lama di rasoio per un diametro di 2 mm per accogliere una larva di dpf 3 con minimo sforzo.
2. pinna ritaglio delle larve di Zebrafish
- Pick up una larva anestetizzata utilizzando la micropipetta P1000 modificata e appoggiare la larva di pesce zebra sul nastro autoclave posizionato sul coperchio scatola di Petri.
- Rimuovere la soluzione di tricaina in eccesso che circondano la larva utilizzando una micropipetta. La zona dovrebbe essere asciutta come possibile con successo sezione e ritirare la pinna ma ancora bagnato per assicurare la sopravvivenza.
- Usando un bisturi micro sezione caudale sotto un microscopio stereo come indicato in Figura 1, come descritto in Wilkinson et al.16. Durante l'incisione, applicare una pressione costante all'interno del sito di gap del pigmento della pinna caudale, distale al limite della circolazione sanguigna (Figura 1A). Applicare una leggera pressione per evitare di danneggiare la notocorda.
- Visualizzare la pinna sezionata al microscopio e posizionare il pezzo sopra la punta della lama microscalpel (Figura 2A). Posizionare il microscalpel contenente la pinna sulla superficie di un piccolo pezzo di carta da filtro.
Nota: A causa della presenza dei melanociti nel tessuto transected, questo passaggio permette la visualizzazione della pinna come un piccolo punto nero (Figura 2B). - Utilizzando le forbici e pinzette (Figura 2), trasferire la carta da filtro contenente la pinna per una piastra PCR a 96 pozzetti, contenente 25 μL di soluzione di NaOH 50 mM per pozzetto (Figura 2D).
- Preparare una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto, numerazione il bene secondo l'etichetta della piastra PCR. Con la pipetta di P1000 modificata riempita con 200 µ l di fresco 1 x E3 media di embrione, raccogliere con cura la larva di pesce zebra con una leggera pressione. Dispensare la larva nella piastra di coltura del tessuto 96 pozzetti, nello stesso numero bene come la piastra PCR (Figura 2E).
- Assicurarsi che la carta da filtro sia ben immersa nella soluzione (Figura 2F). Pulire la lama del microscapel e pinzette tra ciascuno tagliato per evitare la contaminazione incrociata di immersione in soluzione di 70% EtOH. Pulire la lama con tessuto/salvietta di carta pulita.
- Ripetere i passaggi 2.1-2.7 tutti gli embrioni sono stati ritagliati.
- Memorizzare le larve nella piastra a 96 pozzetti a 28 ° C, finché non sono stati identificati i genotipi.
Nota: I media di embrione non ha bisogno di essere cambiato, poiché il protocollo può essere facilmente completato in meno di 2 giorni. Se è necessario più tempo, è consigliato un cambiamento di media.
3. genomic DNA estrazione
- Sigillare la piastra PCR a 96 pozzetti e centrifugare i campioni a 1.000 x g per 1 min per assicurarsi che tutti i giornali di filtro sono sommerse all'interno della soluzione di NaOH.
- Per la lisi del tessuto, riscaldare i campioni in un termociclatore a 95 ° C per 5 min seguita da un raffreddamento a 4 ° C per 10 min.
- Aggiungere 6 μL di 500 mM Tris-HCl, pH 8.0 a ciascun campione. Vortice.
- Centrifugare brevemente la piastra a 1.500 x g, per 5 min a temperatura ambiente.
- Utilizzare 1,5 μL del surnatante del DNA per reazione di PCR.
- Preparare una PCR al genotipo le larve, come illustrato nella tabella 1-2.
Nota: Il presente protocollo è stato testato per due applicazioni: multiplex reazioni di PCR, rivelando il genotipo utilizzando gel di agarosio9e dell'eteroduplex fusione assay (HMA) rivelando i genotipi utilizzando gel di poliacrilammide elettroforesi (pagina)17.
4. alternativa estrazione genomico usando una resina chelante
- Completare il passaggio 2.5 con l'aggiunta di carta da filtro con la pinna ritagliata a una piastra PCR a 96 pozzetti, contenente 30 μL del 5% chelanti resina (copolimero di stirene-divinilbenzene contenenti ioni iminodiacetate accoppiati).
Nota: Questo tipo di resina viene comunemente utilizzato per la preparazione di DNA PCR-pronto in un modo veloce ed efficiente18e lisi del tessuto. - Seguire i passaggi 2.6-2.8 come indicato.
- Sigillare la piastra PCR a 96 pozzetti e centrifugare brevemente i campioni per assicurarsi che tutti i carta da filtro è sommerso all'interno la resina chelante.
- Per la lisi del tessuto, riscaldare i campioni in un termociclatore a 95 ° C per 15 min, seguito da un raffreddamento a 4 ° C per 10 min.
Nota: Questo passaggio permette di lisi e successivo legame di perline resina polar a componenti cellulari mentre DNA e RNA rimangono in soluzione. - Centrifugare brevemente i campioni per pellet le perle di resina e ottenere il DNA nella sospensione.
- Seguire i passaggi 3.5-3.6 per completare la procedura di genotipizzazione.
5. applicazione 1: Multiplex PCR seguita da analisi del Gel dell'agarosi
- Seguendo la tabella 1, impostare una reazione di PCR multiplex per consentire la discriminazione tra mutanti omozigoti, eterozigoti e larve WT. Utilizzare un termociclatore 96 pozzetti per eseguire le reazioni di PCR utilizzando il ciclismo condizioni descritte nella tabella 3.
Nota: Le reazioni di PCR possono essere eseguite anche in qualsiasi altro cycler termico PCR convenzionale. Questo esempio descrive la strategia PCR utilizzata da Pena, et al. 9 per identificare aldh7a1 WT e gli alleli del mutante 5-bp inserimento nella stessa reazione multiplex. - Preparare un gel di agarosio 1% in tampone borato di sodio, macchiato con 1 x GelRed.
Nota: 20x stock tampone borato di sodio è fatto di 40 mL di NaOH 10 M, 1800 mL di ddH2O, pH regolato a 8.5 con 76 g di acido borico e poi completato a volume finale di 2 L utilizzando ddH2O. - Esegua il gel in tampone borato di sodio 1 x 15 min a 250 V. Per facilitare il processo, se possibile, utilizzare un sistema gel compatibile con pipette multicanale per attivare le funzionalità di throughput superiore riducendo il tempo di caricare i campioni.
- Il gel sotto la luce ultravioletta (UV) per permettere la distinzione dei diversi genotipi dell'immagine.
6. applicazione 2: Eteroduplex saggio di fusione
- Preparare la pagina 12% gel utilizzando la piastra distanziatrice di 1,5 mm e i pettini 15-campioni. Preparare due gel di pagina utilizzando 12,21 mL di ddH2O, 2,52 mL di 10x Tris/Borato/EDTA (TBE), 10 mL di 30% di acrilammide, 250 μL di 10% ammonio persolfato (APS) e 20 μL di tetrametiletilendiammina (TEMED). Utilizzare 1 x TBE buffer (0,089 M Tris-HCl, acido borico 0,089 M e 0,002 M acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)) come tampone di corsa.
- Riscaldare i prodotti di PCR a 94 ° C per 5 min.
- Lasciare raffreddare le provette su ghiaccio o nel termociclatore per 10 min a 4 ° C.
- Caricare 10 µ l per campione PCR e 8 μL di marker di peso molecolare.
- Eseguire la pagina a 150 V in 1 x TBE utilizzando un sistema di elettroforesi verticale per 1 h o fino a quando il marcatore di peso molecolare quasi raggiunge la linea del piede della lastra di vetro.
- Il gel sotto luce UV per permettere la distinzione dei diversi genotipi dell'immagine.
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Representative Results
L'efficienza del protocollo è stato dimostrato dalla genotipizzazione la prole di una croce eterozigoti (aldh7a1+ ot100, qui indicato come aldh7a1+ /-) (Figura 3A- C)9. L'allele del mutante aldh7a1ot100ha un inserimento 5-base pair (bp) nel primo esone codifica del gene aldh7a1 di zebrafish che conduce a frameshift e perdita di funzione a causa di un presto di codone di arresto9. Quattro gli iniettori sono stati utilizzati in una reazione multiplex per ottenere tre bande distintivi per differenziare tra WT, eterozigoti (aldh7a1+ /-) e genotipi omozigoti mutante (aldh7a1- / -) (da Pena, et al. 9): Gen1_FW 5'-ATGATGCAGCGCGTGCTGAC-3', "Gen2_RV": 5' - CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3', "5 nt-ins-specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3' e "WT-specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3'). L'amplificazione di entrambi gli alleli utilizzando i primers Gen1_FW e Gen1_RV ha provocato un amplicone 434-bp. Una banda di 293-bp ha presentato da amplificazione specifica dell'allele del mutante, e una band di 195-bp è stata ottenuta in modo specifico per l'allele WT, come mostrato in Figura 3A. Dopo la PCR, 8 µ l di ogni 20 µ l di reazione è stata analizzata su un gel di borato di sodio agarosio 1%, come mostrato nella Figura 3B. DNA sufficiente larvale è stato recuperato dal 98% (n = 576) dei campioni, conseguente a un alto tasso di efficienza PCR. Estrazione del DNA usando la tecnica di NaOH ottiene in media 4,7 0,5 ng / µ l di DNA larvale per esempio seguendo la procedura di biopsia di pinna, in ~ 30 µ l di volume. Estrazione del DNA usando resina chelante si traduce in una resa simile, in media 3,8 0,5 ng / µ l di DNA per campione. Questa quantità di DNA raccolto da transections larvale pinna genera DNA genomic di PCR-pronto di qualità sufficiente per consentire l'identificazione di genotipi. Ciascun campione di DNA può essere utilizzato nelle reazioni di amplificazione di PCR ˜30. I prodotti di amplificazione ottenuti utilizzando primers Gen1_FW e Gen2_RV possono essere utilizzati anche per sequenziamento applicazioni9, che correttamente identificato l'inserimento 5-bp nei mutanti omozigoti (aldh7a1- / -) (Figura 3 ). Sanger sequenziamento è stato effettuato tramite un servizio esterno per verificare se i prodotti PCR erano adatti per questa applicazione. Campioni di DNA da gel di agarosio confermato mutanti omozigoti e WTs (n = 3 ciascuno) sono stati usati. Punteggi19 Phred (> 30) sono stati ottenuti che indica letture di alta qualità, fatta eccezione per il primo e l'ultimo 40 paia di basi.
Questo protocollo è stato successivamente utilizzato per genotipo varie altre mutazioni di zebrafish di fusione l'analisi dell'eteroduplex. Gli alleli del mutante plpbpot101 e plpbpot102 del plpbp gene (Figura 4A-D) ogni portano a un frameshift e primi codone di arresto. Al fine di identificare plpbp-larve di zebrafish null, due iniettori sono state utilizzate per amplificare il primo esone codifica tra cui il sito di mutazione (plpbp-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 'e plpbp-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3'). L'amplificazione del frammento plpbp negli animali WT si traduce in un amplicone 272-bp (omoduplex). Gli ampliconi ottenuti da plpbpot101 (allele 4-omissione, Figura 4) è costituito da un frammento di 268-bp e quello di plpbpot102 (5bp-sostituzione, allele 2-omissione, Figura 4), 270-bp, come si vede nella Figura 4A-B. Dopo denaturazione e ricottura, i frammenti PCR da animali eterozigoti conterrebbe DNA eteroduplex e omoduplex17. Omoduplex e dell'eteroduplex bande possono essere facilmente separate e visualizzati mediante elettroforesi in gel di poliacrilamide (pagina). La presenza di un angolo aperto tra abbinati e malassortiti filamenti di DNA causato da ricottura imperfetta a causa dalla presenza di mutazioni causano l'eteroduplex DNA per eseguire la migrazione a un ritmo molto più lento rispetto omoduplex DNA17. Modelli di migrazione distinte sono prodotte da mutazioni distinte. I genotipi eterozigoti (plpbp+ ot101, plpbp+ ot102) sarebbe pertanto visualizzare frammenti di DNA eteroduplex, come pure il composto eterozigote (plpbpot101/ot102) (Figura 4a-B). Genotipizzazione precisa è ottenuta da questa eteroduplex fusione saggio come un unico modello di pagina è ottenuto per ciascun genotipo e distinte mutazioni eterozigoti possono essere visualizzate (fig. 4A-B). Mutanti omozigoti sarebbero visualizzare un modello omoduplex nel gel pagina e pertanto essere indistinguibili a WTs. Per distinguere questi genotipi, un altro giro di analisi gel pagina deve essere eseguito in quali prodotti PCR da WT alleli necessità di essere miscelato con i campioni da studiare, come descritto altrove17.
Circa il 90% (88/98) di WT ed embrioni eterozigoti con successo sono state sollevate all'età adulta (> 2 mesi). Come aldh7a1 e plpbp sono mutanti di perdita-de-funzione che visualizzano un fenotipo di morte precoce, animali non trattati potrebbero non essere generati all'età adulta. Tuttavia, i genotipi di WT tutti sopravvissuti e adulti eterozigoti erano identici a risultati di ritaglio larvale pinna, che indica un tasso di precisione del 100% per l'identificazione di genotipi utilizzando la procedura di biopsia di pinna larvale.
Figura 1. Clip di pinna larvale. (A). Non-reciso larvale pinna al momento della post-fecondazione tre giorni (dpf). La linea rappresenta il sito del transection, che si trova all'interno il divario di pigmento. La punta della freccia nera dimostra il limite della circolazione sanguigna caudale. (B). segue Larva pinna procedura di ritaglio in 3 dpf. (C). zebrafish larvale pinna ricrescita alle 5 dpf. Rigenerazione di pinna da una formazione blastematosa è osservata solo il transection 2 giorni post-pinna. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Procedura per il ritaglio di pinna larvale. (A). le larve sono collocate sul nastro e supporto di embrioni in eccesso viene rimosso. Sotto il microscopio, la pinna è attraversata alla regione del divario del pigmento come mostrato in Figura 1A. Utilizzando un microscalpel, la pinna è raccolte e collocata su una carta da filtro in superficie semplicemente toccandolo (B) e può essere facilmente visualizzato come una macchia nera. Tenere il pezzo di carta da filtro contenente la pinna e tagliare un piccolo quadrato che circondano la regione desiderata (C). Posto il piccolo pezzo di carta da filtro contenente la pinna in un pozzetto di una piastra ben 96 (D). La larva corrispondente deve trovarsi nella corrispondente bene di una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto a 200 µ l di media dell'embrione (E). Il pezzo di carta da filtro dovrebbe essere immerso nella soluzione di lisi (F). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 3. Genotipizzazione di aldh7a1 Croce eterozigotico da biopsie di pinna larvale. (A). Risultato previsto dove amplificazione degli alleli sia WT e aldh7a1ot100 si traduce in un amplicone 434-bp. Una banda di 293-bp nasce da amplificazione dell'allele del mutante (aldh7a1ot100, inserimento 5-bp), e una band di 195-bp è ottenuta per l'allele WT. (B). l'amplificazione di esempio di PCR da tessuti larvali pinna aldh7a1 . In corsia 7 viene visualizzato un marcatore di peso molecolare 1 kb. 1-6 corsie rappresentano una biopsia pinna singola. Risultati di PCR identificano aldh7a1- / - (aldh7a1ot100/ot100) genotipi (lane 1), aldh7a1+ /- genotipi eterozigoti (aldh7a1+ ot100) (corsie 3, 4 e 5) e (WT aldh7a1+ +) genotipi (corsie 2 e 6). (C). l'allineamento tra il WT sequenziata e allele aldh7a1ot100 indicante la posizione della mutazione 5-bp inserimento. Questa figura è stata adattata dal supplementare 5 figura Pena et al. 9 con l'autorizzazione della genetica Society of America. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 4. Genotipizzazione del plpbp composto (2 bp eliminazione 4 bp omissione eterozigotica) da biopsie di pinna larvale. (A). Risultato previsto dove amplificazione dell'allele WT ha provocato un amplicone 272-bp. L'allele 4-omissione (plpbpot101) e la sostituzione di 5-bp con allele 2-omissione (plpbpot102) producono lunghezze di amplicon di 268-bp e 270-bp rispettivamente. Un eteroduplex si forma tra un allele WT e l'allele del mutante in un genotipo eterozigotico (plpbp+ /-). Formazione di un eteroduplex a causa di alleli di disadattamento causerà il ritardo della banda all'interno il gel rispetto alla omoduplex WT. (B). l'amplificazione di PCR derivanti da ritagli di pinna larvale della prole di un plpbp+ ot101x plpbp+ ot102 croce. Nel vicolo 1 viene visualizzato un marcatore di peso molecolare di 1 kb. 2-10 corsie rappresentano una biopsia pinna singola. Risultati di PCR identificano genotipi mutanti (plpbp-null eterozigoti composti plpbpot101/ot102, corsie 2, 4 e 8), genotipi eterozigoti (corsie 3, 6, 7, 9 e 10) e genotipi WT (vicolo 5). (C). allineamento tra sequenziata WT e allele plpbpot101 indicante la posizione della mutazione 4-omissione. (D). allineamento tra sequenziata WT e allele plpbpot102 indicante la posizione dell'omissione di 2 punti di ebollizione e la sostituzione di 5-bp (in grassetto). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Componenti | Reazione di 20 µ l | 100 reazioni | Finale conc. |
| Nuclease-free H2O | 7,45 ΜL | 745 ΜL | |
| Go-Taq 2 x (Promega, M7122) | 10 ΜL | DA 1000 ΜL | 1 x |
| Primer Gen1_FW | 0.25 ΜL | 25 ΜL | 0,125 ΜM |
| Primer 5 nt-ins-specific_FW | 0.3 ΜL | 30 ΜL | 0.15 ΜM |
| Primer Gen2_RV | 0.25 ΜL | 25 ΜL | 0,125 ΜM |
| Primer WT-specific_RV | 0.25 ΜL | 25 ΜL | 0,125 ΜM |
| DNA | 1,5 ΜL | -- |
Tabella 1. Condizioni di reazione per multiplex PCR utilizzata per la aldh7a1 allele in questo protocollo. I primers utilizzati sono i seguenti: Gen1_FW 5' - ATGATGCAGCGCGTGCTGAC - 3', "Gen2_RV": 5' - CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3', "5 nt-ins-specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3' e "WT-specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3'. Primer scorte erano 10 µM.
| Componenti | Reazione di 13 μl | 100 reazioni | Finale conc. |
| H2O | 3.25 ΜL | 325 ΜL | |
| Go-Taq 2 x (Promega, M7122) | 6.25 ΜL | 625 ΜL | 1 x |
| Primer FW | 1 ΜL | 100 ΜL | 0,77 ΜM |
| Primer per camper | 1 ΜL | 100 ΜL | 0,77 ΜM |
| DNA | 1,5 ΜL | -- |
Tabella 2. Condizioni di reazione per PCR utilizzato per plpbp allele in questo protocollo. Il primer forward utilizzato era PLPBP-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 'e l'inverso, PLPBP-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3'. Primer scorte erano 10 µM.
| Passaggio di ciclo | Temp. | Tempo | Cicli |
| Denaturazione iniziale | 95 ° C | 3 min | 1 |
| Denaturare | 95 ° C | 30 sec | 36 |
| Ricottura * | X ° C | 30 sec | |
| Estensione | 72 ° C | 20 sec/kb | |
| Estensione finale | 72 ° C | 5 min | 1 |
| 4 ° C | tenere premuto |
Tabella 3. Condizioni di PCR utilizzate nel presente protocollo.
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Discussion
Gene strumenti di editing sono state impiegate per introdurre precisamente mutazioni e transgeni in zebrafish negli ultimi anni5,6,7,8. Durante la malattia di modellazione in zebrafish, primi fenotipi larvali o giovanili sono spesso osservati9,12,13,14. Il protocollo presentato qui descrive l'estrazione del DNA PCR-pronto da biopsie di zebrafish piccola coda larvale, abilitazione genotipizzazione delle larve giovani come dpf 3. Identificazione precoce dei genotipi è fondamentale per diverse applicazioni di laboratorio, soprattutto quando la genotipizzazione di post hoc, non è possibile9. Conoscendo i genotipi dalla più tenera età facilita anche studi di sopravvivenza e analisi fenotipica dei mutanti. Questo protocollo è inoltre particolarmente utile per l'allevamento di larve di genotipi specifici alla maturità. Genotipizzazione larvale non è ancora ampiamente usata nei laboratori di zebrafish in tutto il mondo e questo protocollo ha lo scopo di agevolare la diffusione di questa tecnica. Durante la manipolazione delle pinne transected, l'uso di questo metodo fornisce la fiducia per quanto riguarda la presenza di DNA all'interno del campione; la biopsia di pinna può essere visualizzata prontamente come una macchia scura su carta da filtro durante tutto il processo di gestione. Questo rappresenta un miglioramento importante del protocollo pubblicato da Wilkinson et al. 16.
Diversi passaggi critici all'interno del protocollo devono essere seguite correttamente per ottenere risultati di qualità. Innanzitutto, il transection della pinna larvale deve avvenire entro il divario di pigmento, distale al limite della circolazione sanguigna, per evitare il sanguinamento. Questo garantisce la sopravvivenza delle larve durante la biopsia di pinna. Inoltre, un punto nero sulla carta da filtro, marcatura il posizionamento della pinna, deve essere osservato prima di mettere la carta da filtro della soluzione di NaOH. Questo assicura la presenza di tessuto pinna (e di conseguenza, DNA) in ogni pozzetto del campione. Il filtro di carta deve essere immerso anche all'interno della soluzione di NaOH per garantire successo DNA estrazione e lisi cellulare. Questo protocollo non è stato testato per età più giovane rispetto a 3 dpf come solo le larve covate sono state usate. Agli embrioni più giovani genotipo (unhatched < 3 dpf) rimozione di corion sarebbe necessaria. Nel caso in cui si verifica tale insufficiente amplificazione di PCR, strategie di ottimizzazione di PCR standard dovrebbero essere applicata (ad esempio, variando la concentrazione di primer, ricottura temperatura e/o la concentrazione del DNA). Anche se sufficiente DNA viene estratto per eseguire correttamente i diversi tipi di reazioni di PCR (come indicato per gli esempi di genotipizzazione di aldh7a1 e plpbp ), la concentrazione di DNA ottenuto seguendo questa procedura di ritaglio della pinna è piccola (~ 5 ng / µ l esempio) e quindi, aumentando la concentrazione di DNA nella reazione di PCR può permettere per un successo maggiore di amplificazione.
Il DNA di pinna larvale Estratto con questo protocollo può essere usato per parecchie reazioni di amplificazione, permettendo accurata identificazione di genotipi di zebrafish larvale e in un modo ad alta velocità. Un eteroduplex fusione dosaggio in pagina gel può essere utilizzato per identificare mutazioni differenti17. Dato che ~ 30 μL di DNA è ottenuta per campione, e ~ 1-1.5 μL di DNA è utilizzato per ogni reazione di PCR, circa 30 reazioni di PCR possono essere eseguite a campione estratto. I prodotti PCR sono adatti anche per applicazioni di sequenziamento Sanger; alta qualità di letture sono stati ottenuti, consentendo di accurato conferma di WT e sequenze mutanti omozigoti per aldh7a1. Estrazione di DNA genomico da zebrafish larvale ha molte applicazioni nella ricerca. L'obiettivo originale per lo sviluppo di questo protocollo era per efficacemente le larve di genotipo che non riescono a raggiungere l'età adulta a causa di mutazioni specifiche nel aldh7a19. Inoltre, questo protocollo attivato la segregazione dei genotipi e l'osservazione dei fenotipi di epilessia associata specificamente nel aldh7a1- / - pesce dal successivo stadio larvale9. La messa in comune delle larve di ciascun genotipo per approcci come estrazione del RNA o metabolita estrazione può essere eseguito con precisione dopo genotipizzazione utilizzando questa pinna larvale procedura9di ritaglio. In conclusione, dopo un breve periodo di addestramento, un investigatore esperto possa utilizzare questo protocollo semplice e rapido, che richiedono solo reagenti minimi e poco costosi, per eseguire regolarmente centinaia di clip di pinna al giorno. L'uso di questo protocollo reso possibile la ricerca descritta da Pena et al. e speriamo che servirà uno scopo simile per la più ampia comunità di Zebrafish.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare i rari modelli di malattia e meccanismo (RDMM) rete (finanziato da istituti canadesi di ricerca di salute (CIHR) e Genome Canada). CK è supportato da un premio di studio UROP (Università di Ottawa). DLJ è supportato da una borsa di studio di laurea Canada Vanier. IAP è supportato da un premio di postdoctoral fellowship istituti canadesi di ricerca di salute (CIHR). Gli autori ringraziano la genetica Society of America per la concessione dell'autorizzazione per pubblicare questo protocollo e utilizzare un adattamento della figura 5 supplementare da Pena, et al.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
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