Summary
Zebra balığı güvenilir genetik canlılar arasında gen düzenleme teknolojileri advent ile özellikle Biyomedikal araştırma olarak kullanılmıştır. Larva fenotipleri bekleniyor, DNA ekstraksiyon ve genotip kimlik zor olabilir. Burada, biz bir verimli Genotipleme zebra balığı larva için kuyruk, 72-h sonrası döllenme gibi erken kırpma tarafından açıklayınız.
Abstract
Zebra balığı (Danio rerio) insan hastalıkları ile ilişkili olduğu bilinen genlerin % 84 için orthologues sahip. Buna ek olarak, bu hayvanlar bir kısa oluşturma süresi var, kolay işlemek, yüksek bir üreme oranı, düşük maliyetli, görüntülemek ve embriyo içinde DNA'ın mikroenjeksiyon tarafından genetik manipülasyonlar kolayca mükellef bulunmaktadır. Son gelişmeler düzenleme araçları gen mutasyonlar ve zebra balığı transgenes kesin giriş etkinleştirme. Hastalık içinde zebra balığı kez modelleme larva fenotipleri ve genotip bilinmeyen varsa yorumlamak zor olabilir erken ölüme yol açar. Bu erken genotip Ayrıca tanımlamasıdır örnek havuzu gerektiren deneylerde gerekli, gen ifade veya kütle spektrometresi çalışmaları gibi. Ancak, geniş genotypic tarama çoğu labs sadece yetişkin zebra balığı ya da öldükten sonra larva gerçekleştirilen geleneksel yöntemler ile sınırlıdır. Biz bu sorunu bir yöntem gibi erken 72 h sonrası döllenme (hpf) elde edilebilir canlı zebra balığı larva PCR-hazır genomik DNA izolasyonu için adapte tarafından ele. Bu zaman ve maliyet-etkin tekniği, daha önce yayımlanmış Genotipleme Protokolü geliştirilmiş sağlar genotip mikroskobik fin biyopsi üzerinden tanımlaması. Larvalar geliştirdikçe yüzgeçleri hızlı bir şekilde yeniden. Araştırmacılar daha sonra seçin ve istenen genotip yetişkinliğe bu yüksek-den geçerek PCR tabanlı Genotipleme yordamı kullanarak yetiştirmek edebiliyoruz.
Introduction
Zebra balığı (Danio rerio) yaygın preklinik tedavi hipotezler1,2,3test gelince de hastalık soruşturma için bir model olarak kullanılan omurgalı bir organizma. Bu hayvanlar kısa oluşturma süresi var, kolay işlemek, yüksek bir üreme oranı, düşük maliyetli, görüntülemek ve DNA'ın mikroenjeksiyon embriyo4tarafından genetik manipülasyonlar kolayca mükellef bulunmaktadır. Teknolojik öyle aynı derecede çinko-parmak enzimler (ZFN)5, TAL benzeri efektör enzimler (TALENs)6,7ve kümelenmiş düzenli olarak Interspaced kısa roman transgenik ve gen artan geliştirilmesi yoluyla düzenleme Palindromik yineler (CRISPR) / CRISPR ilişkili 9 (Cas9) sistem8, zebra balığı önemli ölçüde birkaç patolojik koşulları anlayış geliştirmek için hazırlanıyor. Hedeflenen renkleri çakıştırma hem de somatik oluşturmak için kullanılan bu teknolojiler ve verimli bir şekilde genetik olarak duyumsatan zebra balığı, hücrelerde germline hayvanlar8değiştirilebilir. Son literatürde epilepsi ve metabolik bozukluklar genetik modellerini başarılı gelişimi zebra balığı3,9,10,11',12 örnekler .
Zebra balığı genom düzenleme içinde ilerleme ile hızlı ve güvenilir Genotipleme yadsınamaz bir hızı sınırlaması adım haline gelmiştir. Belirli DNA mutasyonları öngörülen genom düzenleme hedef siteye bitişik tanımlaması Protokolü'nün önemli bir aşamadır. Geleneksel olarak, Genotipleme fin kırpma tarafından genellikle sadece içinde gerçekleştirilen çocuk ya da yetişkin zebra balığı tekniklerdir. Ancak, harcanan zaman yetişkinliğe yükselterek zebra balığı (> 2 ay) önemli ölçüde araştırma gelişmeler geciktirir. Birçok durumda, yetişkinlik gerekli genler (Örneğin, hastalık modelleme) veya zararlı fenotipik etkileri için önde gelen işlev kazanç mutasyonlar nakavt nedeniyle elde edilemez. Ayrıca, çeşitli deneyleri larva, RNA veya metaboliti ayıklama gibi havuzu gerektirir ve böylece sadece post hoc Genotipleme teknikleri kullanılabilir olduğunda hangi zor olabilir genotip, önceden tanımlanması dahil. Söz konusu bu örnekler aynı zamanda hassas ve tam kurtarma ve larvalar normal gelişimini olanaklı kılmak larva Genotipleme teknikleri önemini vurgulayın. Erken sahne zebra balığı Genotipleme Şu anda yaygın olarak kullanılan görünmüyor; Bu hastalık modelleri larva genotip Genotipleme çalıştırmadan önce deneme12,13,14yerine öldükten sonra Genotipleme üzerinden tespit edilir son yayınlar yansıtır. Bu yazıda, daha önce kurulan Genotipleme yordamlar geliştirmek amaçlayan bir larva fin küçük strateji sunulur.
Geçmişte, İndinavir K sindirim genotip için istihdam stratejileri larva değişken polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) verimlilik15' e açmıştır zebra balığı yaşamak. Daha son zamanlarda mikroskobik kuyruk biyopsi tekniği daha umut verici sonuçları16sağlanan yayınlanan rağmen biz ve diğer grupları yüksek verimlilik ve yazarlar tarafından bildirilen DNA kurtarma çoğaltmak mümkün değildi. Wilkinson ve ark. tarafından açıklanan Protokolü'nün büyük bir başarısızlık 16 kuyruk doku transferi PCR tüp için olabilir. Mikroskobik onun büyüklüğü nedeniyle, fin düzgün toplanan ve pipetting tarafından reçete emin olmak zordur. Bu bariyer adrese, Genotipleme canlı zebra balığı larvaları yaklaşık % 100 verim9ile çok sayıda için geliştirilmiş bir protokol geliştirdik. Bir microscalpel kullanarak, fin kuyruk ucu kaldırılır ve bir filtre kağıt parçası yerleştirilir. Filtre kağıt dokusu içeren kolayca görselleştirildiği ve doğru bir PCR tüp içine yerleştirilir. Genomik DNA ekstraksiyon ardından, genotip örnek ilgi bölgesinin PCR güçlendirme tarafından takip gerçekleştirilir. Bu yöntemin avantajları, yüksek bir PCR verim, düşük bir yanlış pozitif oranı ve düşük ölüm oranı içerir. Ayrıca, çok sayıda embriyo Genotipleme bu iletişim kuralını kullanan mümkündür. Burada açıklanan protokol fin-kırpma, larva bu yaklaşım ve genotyped balık ve kuyruk rejenerasyon iki gün içinde doğru kimlik kullanarak 2-3 saat içinde yüzlerce sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Maddelerle ilgili hayvan konular onaylanmış olan ve hayvan bakımı kılavuzlarınıza uygun olarak çoğu yordamlar Kanada Konseyi tarafından hayvan bakım ve Ottawa Üniversitesi hayvan bakımı komiteler sağlanan.
1. hazırlık
- Diseksiyon yüzey 9 cm Petri kabına kapak Otoklav Bandı ile iç yüzeyi taping tarafından hazırlamak. Stereo mikroskop altında yerleştirin.
- Yer 3-5 gün sonrası döllenme (dpf) bir Petri zebra balığı larvaları yemek ve ˜1.5 mm Tricaine 1 x E3 embriyo medya (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, pH 7.2) anestezi.
- P1000 pipet ucu makas ya da jilet bir çift ile sonu kapalı 3 dpf larva en az stres ile karşılamak için 2 mm çapında yara bere.
2. zebra balığı larva fin kırpma
- Değiştirilmiş P1000 micropipette kullanarak bir imzalat larva kadar almak ve zebra balığı larva konumlandırılmış Otoklav Bandı üzerine Petri kabına kapağını yerleştirin.
- Bir micropipette kullanarak larva çevreleyen aşırı Tricaine çözüm kaldırın. Alan başarıyla bölüm ve fin kadar almanız mümkün ama hala hayatta kalmasını sağlamak için ıslak kuru olmalıdır.
- Mikro neşter, Bölüm mikroskop stereo Wilkinson ve ark16açıklandığı gibi Şekil 1' de gösterildiği gibi altında kaudal fin kullanarak. Belgili tanımlık kesme sırasında kaudal fin, kan dolaşımını (Şekil 1A) sınırlamak için distal pigment boşluğu sitenin içinde sürekli bir aşağı doğru basınç uygulayın. Notochord zarar görmesini önlemek için hafif basınç uygulayın.
- Mikroskop altında kesitli fin görselleştirmek ve üstünde tepe-in belgili tanımlık uç parçası microscalpel bıçak (Şekil 2A) konumlandırın. Filtre kağıdı küçük bir parça yüzeyinin fin içeren microscalpel yerleştirin.
Not: transected doku melanosit varlığı nedeniyle, bu adımı fin görselleştirme bir küçük siyah nokta (Şekil 2B) olarak sağlar. - Makas ve cımbız (Şekil 2C), transfer 50 mm NaOH çözüm iyi (Şekil 2B) başına 25 μL içeren bir 96-şey PCR plakasına fin içeren filtre kağıdı kullanarak.
- PCR plaka etiket göre iyi numaralandırma bir düz-alt 96-şey plaka hazırlayın. Taze 1 x E3 embriyo medya 200 µL ile dolu değiştirilmiş P1000 pipet kullanarak, dikkatle hafif basınç kullanarak zebra balığı larva toplamak. 96-iyi doku kültürü plaka aynı PCR plaka (Şekil 2E) iyi numara larva dağıtmak.
- Filtre kağıdı de çözüm (2F rakam) sular altında emin olun. Microscapel ve cımbız % 70 alkol çözüm daldırma tarafından çapraz kontaminasyonu önlemek için her kesim arasında bıçak temiz. Bıçak temiz kağıt doku/bezle silin.
- Tüm embriyoların kısaltıldı 2.1-2.7 tamamlayana dek.
- Genotip belirleyinceye kadar larva 96-şey plaka 28 ° C'de depolayın.
Not: Embriyo medya iletişim kuralı kolayca az 2 gün içinde tamamlanabilir beri değiştirilmesi gerekmez. Daha fazla zamana ihtiyacım vardı, bir medya değiştir önerilir.
3. genomik DNA ekstraksiyon
- 96-şey PCR plaka ve örnekleri için tüm filtre kağıtları emin olmak 1 dk 1000 x g de NaOH çözümünüzde batık santrifüj kapatın.
- Doku lizis için 95 ° c 5 min 4 ° C'de 10 dakika için soğutma tarafından takip için bir thermocycler örneklerinde ısı.
- 500 mm Tris-HCl, her örnek için 8,0 pH 6 μL ekleyin. Girdap.
- Kısaca, oda sıcaklığında 5 min için 1.500 x g plaka santrifüj kapasitesi.
- Bir DNA süpernatant PCR reaksiyon başına 1,5 μL kullanın.
- Genotip için PCR larvalar, Tablo 1-2' de gösterildiği gibi hazırlayın.
Not: Bu protokol iki uygulamaları için test edildi: multiplex özel jelleri9ve polyacrylamide jel elektroforez (sayfa)17kullanarak genotip ortaya tahlil (HMA) erime heteroduplex kullanarak genotip ortaya PCR reaksiyonları.
4. alternatif genomik ayıklama şelat bir reçine kullanarak
- Filtre kağıdı ile bölünerek fin bir 96-şey PCR plakasına ekleyerek tam adım 2.5 reçine (eşli iminodiacetate iyonları içeren stiren-divinylbenzene kopolimer) şelat % 5'lik 30 μL içeren.
Not: Bu tür reçine bir doku lizis ve PCR-hazır DNA bir hızlı ve verimli bir şekilde18' hazırlanması için yaygın olarak kullanılır. - 2.6-2.8 belirtildiği gibi adımları.
- 96-şey PCR plaka mühür ve kısaca tüm filtre kağıdı içinde bağlayıcı reçine sular altında emin olmak için örnekler santrifüj kapasitesi.
- Doku lizis için bir thermocycler 4 ° C'de 10 dakika için soğutma tarafından takip 15dk için 95 ° C'de örneklerinde ısı.
Not: Bu adımı DNA ve RNA çözümde kalırken lizis ve kutup reçine boncuk hücresel bileşenleri için sonraki bağlantısını sağlar. - Kısaca reçine boncuk cips ve süspansiyon DNA'da edinmek için örnekler santrifüj kapasitesi.
- 3.5-3.6 Genotipleme yordamı tamamlamak için adımları izleyin.
5. uygulama 1: Özel jel analiz tarafından takip Multiplex PCR
- Tablo 1, takip homozigoz mutantlar, heterozygotes ve WT larva arasında ayrımcılık sağlamak için çok katmanlı bir PCR reaksiyonu ayarlayın. 96-iyi termal cycler Tablo 3' te açıklanan Bisiklet koşullarını kullanarak PCR reaksiyonları gerçekleştirmek için kullanın.
Not: PCR reaksiyonları da herhangi bir diğer geleneksel PCR termal cycler içinde gerçekleştirilir. Bu örnek Pena, et al. kullanılan PCR strateji açıklar aldh7a1 WT ve 5-bp ekleme mutant gen aynı multiplex tepki olarak tanımlamak için, 9 . - % 1'özel jel 1 ile lekeli sodyum borat arabellekte hazırlamak x GelRed.
Not: 76 g Borik asit ile 8.5 için ayarlanabilir ve sonra GKD2O. kullanarak 2 L son birim için tamamlandı pH 10 M NaOH, GKD2O, 1800 mL, 40 mL sodyum borat arabellek hisse senedi x 20 yapılan - V 250 15dk için 1 x sodyum borat arabellekte jel çalıştırın. Sürecini kolaylaştırmak için mümkünse, örnekleri yükleme süresi azaltarak daha yüksek üretilen iş yetenekleri etkinleştirmek için çok kanallı pipets ile uyumlu bir jel sistemi kullanın.
- Jel farklı genotip ayrımcılık izin vermek için ultraviyole (UV) ışık altında görüntü.
6. uygulama 2: Tahlil erime Heteroduplex
- SAYFA %12 jelleri 1.5 mm spacer plaka ve 15-örnekleri tarak kullanarak hazırlayın. İki sayfa jelleri 12.21 mL GKD2O, 10 x Tris/bor/EDTA (TBE), 10 mL % 30 akrilamid, 250 μL 2.52 mL % 10 amonyum Persülfat (APS) kullanarak hazırlamak ve tetramethylethylenediamine (TEMED) 20 μL. 1 x TBE arabellek kullanın (0.089 M Tris-HCl, 0.089 M Borik asit ve 0.002 M ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA)) arabellek çalışan olarak.
- PCR ürünleri 5 min için 94 ° C'de ısı.
- Tüpler buz veya thermocycler 4 ° C'de 10 dakika serin
- PCR örnek başına 10 μL ve molekül ağırlığı işaretleyicinin 8 μL yük.
- 150 V 1 x TBE molekül ağırlığı işaret kadar veya 1 h için neredeyse bir dikey elektroforez sistemi kullanarak ayak hattının cam levha ulaşır. sayfayı çalıştırın.
- Jel farklı genotip ayrımcılık izin vermek için UV ışık altında görüntü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Taht verimliliğini Genotipleme tarafından gösterilmiştir Heterozigoz bir çapraz dölü (aldh7a1+ / ot100, burada aldh7a1+/-gösterilen) ()Şekil 3A- C)9. Aldh7a1ot100mutant Gen 5-baz çifti (bp) ekleme ilk kodlama exon frameshift ve fonksiyon kaybı nedeniyle erken bir stop kodonu9yol açar zebra balığı aldh7a1 gen vardır. Dört astar WT, heterozigoz (aldh7a1+ /-) ve (aldh7a1- / -) homozigoz mutant genotip arasında ayırt etmek için üç farklı grup elde etmek için çok katmanlı bir tepki olarak kullanılmıştır (Pena, üzerinden ve ark. 9): Gen1_FW 5'-ATGATGCAGCGCGTGCTGAC-3', "Gen2_RV": 5' - CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3', "5 nt-ins-specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3' ve "WT-specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3'). Gen1_FW ve Gen1_RV primerler kullanılarak her iki gen amplifikasyon 434-bp amplicon içinde sonuçlandı. 293-bp grup mutant gen belirli amplifikasyon ortaya çıktı ve bir 195-bp Grup özellikle WT gen için Şekil 3Aiçinde gösterildiği gibi elde edildi. PCR, her 20 µL tepki biriminin 8 µL takip % 1'özel / sodyum borat jel üzerinde Şekil 3B' gösterildiği gibi analiz edildi. Yeterli larva DNA yeniden elde etmek--dan % 98'i (n = 576) örneklerin bir yüksek PCR verimlilik oranı kaynaklanan. NaOH tekniği kullanarak DNA ekstraksiyon ortalama 4,7 0,5 ng/µL ~ 30 µL birimindeki fin biyopsi prosedürü izleyerek örnek başına larva DNA alır. DNA ekstraksiyon bağlayıcı reçine kullanarak benzer bir verim, ortalama 3.8 0,5 ng/µL DNA'ın örnek başına sonuçlanır. Bu miktar larva fin transections toplanan DNA PCR-hazır genomik DNA yeterli kalitede genotip tanımlanması için izin vermek için oluşturur. Her DNA örneği ˜30 PCR güçlendirme reaksiyonlar içinde kullanılabilir. Gen1_FW ve Gen2_RV primerler kullanılarak elde edilen amplifikasyon ürünler de başarıyla 5-bp ekleme (aldh7a1- / -) (Şekil 3 c homozigoz mutantlar olarak tanımlanan sıralama uygulamaları için9, kullanılabilir ). Sanger sıralama PCR ürünleri bu uygulama için uygun olsaydı test etmek için harici bir hizmet üzerinden gerçekleştirilen. Özel-jel DNA örnekleri doğruladı homozigoz mutantlar ve WTs (n = 3 her) kullanılmıştır. Yüksek Phred19 puan (> 30) ilk ve son 40 baz çifti haricinde yüksek kaliteli okuma gösteren elde edilmiştir.
Daha sonra bu protokol yapıldı genotip için çeşitli diğer zebra balığı mutasyon analiz erime heteroduplex tarafından kullanılan. Plpbp gen (Şekil 4A-D) her plpbpot101 ve plpbpot102 mutant gen frameshift ve erken kodonu yol açar. Plpbptanımlamak için-null zebra balığı larva, iki astar mutasyon sitesi de dahil olmak üzere ilk kodlama exon yükseltmek için kullanılmıştır (plpbp-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 've plpbp-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3'). WT hayvanlar plpbp parçasında amplifikasyon 272-bp amplicon (homoduplex) oluşur. 268-bp bir parçası ve bu plpbpot102 (5bp-ikame, 2-bp silme alleli, Şekil 4 d), plpbpot101 (4-bp silme alleli, Şekil 4 c) elde edilen amplicon oluşur 270-bp, Şekil 4A-Bgörüldüğü gibi. Denatürasyon ve tavlama sonra PCR parçaları Heterozigoz hayvanlardan heteroduplex ve homoduplex DNA17içerir. Homoduplex ve heteroduplex şeritler kolayca ayrılabilen ve polyacrylamide jel elektroforez (sayfa) kullanarak görüntülenir. Kusurlu mutasyonlar oluşumu nedeniyle TAV tarafından neden uyumlu ve uyumsuz DNA dizilerini arasında açık bir açının heteroduplex DNA homoduplex DNA17daha önemli ölçüde daha yavaş bir hızda geçirmek için neden. Farklı geçiş desen ayrı mutasyonlar tarafından üretilmektedir. Heterozigoz genotip (plpbp+ / ot101, plpbp+ / ot102) bu nedenle heteroduplex DNA parçalarının yanı sıra bileşik Heterozigoz (plpbpot101/ot102) (Şekil görüntülemek 4A-B). Kesin Genotipleme benzersiz bir sayfa desen her genotip için elde edilir ve farklı Heterozigoz mutasyonlar görselleştirildiği tahlil erime bir heteroduplex tarafından (Şekil 4A-B) elde edilen. Homozigoz mutantlar homoduplex desen sayfa jel görüntüleme ve bu nedenle WTs için ayırt edilemez. Bu genotip ayırt etmek için başka yuvarlak-in sayfa jel analizleri WT allelleri belirlenmesi için örnekleri ile başka bir yerde17açıklandığı gibi karışık olması gerek hangi PCR ürünleri içinde gerçekleştirilmelidir.
Yaklaşık yüzde 90'ını (88/98) WT ve Heterozigoz embriyo başarıyla yetişkinliğe kaldırdı (> 2 ay). Aldh7a1 ve plpbp erken bir ölüm fenotip görüntülemek işlev kaybı mutantlar olarak, tedavi edilmeyen hayvanlar yetişkinliğe kaldırdı. Ancak, tüm kalan WT ve Heterozigoz yetişkinlerin genotip larva fin kırpma sonuçları, genotip larva fin biyopsi yordamı kullanarak tanımlanması için % 100 doğruluk oranı belirten aynıydı.
Şekil 1. Larva fin klip. (A). Sigara kopmuş larva fin adlı üç gün sonrası döllenme (dpf). Hat transeksiyon pigment boşluğu içinde bulunan, site temsil eder. Siyah ok ucu kaudal kan dolaşımını sınırını gösterir. (B). Larva aşağıda fin 3 dpf kırpma prosedür. (C). larva zebra balığı yüzgeci büyütme 5 dpf adlı. Fin yenilenme blastemal bir oluşum--dan sadece 2 gün sonrası fin transeksiyon görülmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Yordam larva fin kırpma için. (A). larvalar teyp yerleştirilir ve fazla embriyo medya kaldırılır. Mikroskop altında fin pigment gap bölgesi Şekil 1A' gösterildiği gibi kopuk. Bir microscalpel kullanarak, fin toplanır ve filtre kağıdı yerleştirilen yüzey sadece dokunarak (B) ve kolayca siyah bir nokta görüntülenir. Filtre fin içeren kağıt tutun ve istenilen bölge (C) çevreleyen küçük bir kare şeklinde bir kesik. Filtre kağıdı fin 96 iyi plaka (D) bir kuyunun içine içeren küçük parça yerleştirin. Karşılık gelen larva bir düz dipli 96-şey tabak içinde 200 µL embriyo medya (E) in de buna karşılık gelen içine yerleştirilmelidir. Filtre kağıdı parça lizis çözüm (F) sular altında. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Larva fin biyopsi aldh7a1 Heterozigoz çapraz Genotipleme. (A). Beklenen sonuç nerede WT ve aldh7a1ot100 allelleri amplifikasyon 434-bp amplicon içinde sonuçlanır. 293-bp grup mutant gen (aldh7a1ot100, 5-bp ekleme) amplifikasyon doğar ve 195-bp grubu için WT alleli elde edilir. (B). örnek PCR güçlendirme aldh7a1 larva fin doku üzerinden. 1 kb molekül ağırlığı işaret 7 şeritte gösterilir. Dar sokak 1-6 her tek fin biyopsi temsil eder. PCR sonuçları tanımlamak aldh7a1- / - (aldh7a1ot100/ot100) genotip (lane 1), aldh7a1+/- Heterozigoz genotip (aldh7a1+ / ot100) (şerit 3, 4 ve 5) ve WT ( aldh7a1+/ +) genotip (şerit 2 ve 6). (C). sıralı WT ve 5-bp ekleme mutasyon konumunu gösteren aldh7a1ot100 alleli arasında uyum. Bu rakam Pena ve ark. , tamamlayıcı Şekil 5 uyarlanmıştır 9 genetik Society of America verilen izinle. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Plpbp bileşik Heterozigoz (2 bp silme /4 bp)--dan silmek larva fin biyopsi Genotipleme. (A). Beklenen sonuç nerede WT alleli amplifikasyon 272-bp amplicon içinde sonuçlandı. 4-bp silme alleli (plpbpot101) ve 2-bp silme alleli (plpbpot102) ile 5-bp ikame 268-bp ve 270-bp amplicon uzunlukları sırasıyla üretmek. Bir heteroduplex arasında WT alleli ve mutant gen Heterozigoz genotip (plpbp+ /) içinde oluşturulmuş. Gen eşleşmeyebilir nedeniyle bir heteroduplex oluşumu retardasyon WT homoduplex karşılaştırıldığında jel içinde grubun neden olur. (B). PCR güçlendirme gelen yavruları larva fin kupürleri kaynaklanan bir plpbp+ / ot101x plpbp+ / ot102 çapraz. 1 kb molekül ağırlığı marker 1 şeride gösterilir. Lanes 2-10 her tek fin biyopsi temsil eder. PCR sonuçları tanımlamak mutant genotip (plpbp-boş bileşik Heterozigoz plpbpot101/ot102, yolları 2, 4 ve 8), heterozigoz genotip (şerit 3, 6, 7, 9 ve 10) ve WT genotip (lane 5). (C). sıralı WT ve 4-bp silme mutasyon konumunu gösteren plpbpot101 alleli arasında uyum. (D). sıralı WT ve plpbpot102 Gen 2-bp silme ve 5-bp ikame konumunu (kalın) gösterilen arasında uyum. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Bileşenleri | 20 μl tepki | 100 tepkiler | Son konsantrasyonlu |
| Nükleaz ücretsiz H2O | 7,45 μL | 745 μL | |
| Git-Taq 2 x (Promega, M7122) | 10 μL | 1000 μL | 1 x |
| astar Gen1_FW | 0,25 μL | 25 μL | 0,125 MİKRON |
| astar 5 nt-ins-specific_FW | 0.3 μL | 30 μL | 0,15 MİKRON |
| Astar Gen2_RV | 0,25 μL | 25 μL | 0,125 MİKRON |
| Astar WT-specific_RV | 0,25 μL | 25 μL | 0,125 MİKRON |
| DNA | 1,5 μL | -- |
Tablo 1. Multiplex için kullanılan PCR reaksiyon koşulları aldh7a1 alleli bu protokol. Kullanılan astar aşağıdaki gibidir: Gen1_FW 5' - ATGATGCAGCGCGTGCTGAC - 3', "Gen2_RV": 5' - CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3', "5 nt-ins-specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3' ve "WT-specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3'. Astar hisse senetleri 10 µM vardı.
| Bileşenleri | 13 μl tepki | 100 tepkiler | Son konsantrasyonlu |
| H2O | 3.25 μL | 325 μL | |
| Git-Taq 2 x (Promega, M7122) | 6.25 μL | 625 μL | 1 x |
| astar FW | 1 μL | 100 μL | 0,77 MİKRON |
| Astar RV | 1 μL | 100 μL | 0,77 MİKRON |
| DNA | 1,5 μL | -- |
Tablo 2. Reaksiyon koşulları için kullanılan PCR plpbp Bu protokolündeki alleli. PLPBP-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 kullanılan ileri astar olduğunu 've Ters, PLPBP-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3'. Astar hisse senetleri 10 µM vardı.
| Döngüsü adım | Temp. | Zaman | Döngüleri |
| İlk denatürasyon | 95 ° C | 3 dk. | 1 |
| Denaturing | 95 ° C | 30 sn | 36 |
| Tavlama * | ° C X | 30 sn | |
| Uzantısı | 72 ° C | 20 sn/kb | |
| Son uzantısı | 72 ° C | 5 dk | 1 |
| 4 ° C | basılı tutun |
Tablo 3. Bu protokol için kullanılan PCR koşulları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son mutasyonlar ve zebra balığı transgenes tam olarak tanıtmak istihdam düzenleme araçları Gene yıl5,6,7,8. Zebra balığı içinde modelleme hastalığı gerçekleştirirken, erken larva veya Juvenil fenotipleri9,12,13,14kez gözlenir. Burada sunulan Protokolü PCR-hazır DNA çekme--dan küçük zebra balığı larva kuyruk biyopsileri, larva 3 dpf genç Genotipleme etkinleştirme açıklar. Özellikle post hoc Genotipleme mümkün9olmadığında genotip erken kimlik çeşitli laboratuvar uygulamaları için önemli değildir. Genotip erken bir yaşından itibaren bilmek de hayatta kalma çalışmaları ve mutantlar fenotipik Analizi kolaylaştırır. Bu iletişim kuralı da vade belirli genotip larvaları yükseltmek için özellikle yararlı olur. Larva Genotipleme henüz yaygın olarak zebra balığı laboratuarlarda dünya çapında kullanılmaz ve bu iletişim kuralı bu tekniğin yayılması kolaylaştırmayı hedefliyor. Transected palet işleme sırasında bu yöntemin kullanılması güven DNA varlığı içinde örnek olarak sağlar; fin biyopsi filtre kağıt işleme süreci boyunca koyu bir leke olarak kolayca görselleştirildiği. Bu Wilkinson ve ark. tarafından yayınlanan Protokolü'nün önemli bir gelişme gösterir 16.
Protokol içinde birkaç önemli adımlar kaliteli sonuçlar elde etmek için doğru bir şekilde izlenmesi gerekir. Her şeyden önce larva fin transeksiyon kanama önlemek için kan dolaşımını sınırlamak için distal pigment boşluğu içinde bulunması gerekir. Bu larvalar yaşama fin biyopsi sırasında sağlar. Ayrıca, fin, yerleşimini işaretleme filtre kağıt üzerinde siyah bir nokta NaOH çözümde filtre kağıdı yerleştirmeden önce uyulmalıdır. Bu fin doku (ve bu nedenle, DNA) varlığı her örnek iyi sağlar. Filtre kağıdı da hücre lizis ve başarılı DNA ekstraksiyon güvence altına almak için NaOH çözüm içinde dalmış olmalı. Sadece taranmış larva kullanıldı gibi bu Protokolü 3 dpf daha genç yaş için test edildi değil. Genotip genç embriyolar için (kuluçkaya < 3 dpf) koryon kaldırma-cekti var olmak gerekli. O yetersiz PCR güçlendirme oluşması durumunda, standart PCR optimizasyon stratejileri (astar konsantrasyon değişen, sıcaklık ve/veya DNA toplama tavlama uygulananÖrneğin, ) olması. Her ne kadar yeterli DNA PCR reaksiyonları ( aldh7a1 ve plpbp Genotipleme örnekler için gösterildiği gibi) çeşitli başarıyla gerçekleştirmek için elde edilir, bu fin kırpma yordamı uygulamadan elde edilen DNA konsantrasyonu küçük (~ 5 ng/µL başına örnek) ve böylece, DNA toplama PCR reaksiyon artan amplifikasyon büyük başarı için izin verebilir.
Bu iletişim kuralı ile çıkarılan larva fin DNA birkaç amplifikasyon reaksiyonlar için doğru kimlik larva zebra balığı genotip ve bir yüksek-den geçerek şekilde izin kullanılabilir. SAYFA jelleri tahlil erime bir heteroduplex farklı mutasyon17tanımlamak için kullanılabilir. Verilen bu DNA'ın ~ 30 μL örnek elde edilir ve ~ 1-1.5 μL DNA PCR reaksiyon kullanılır, yaklaşık 30 PCR reaksiyonları ayıklanan örnek çalıştırabilirsiniz. PCR ürünleri de Sanger sıralama uygulamaları için uygundur; okuma sayısı yüksek kalite elde, doğru iþleminizin onayýný WT ve aldh7a1için homozigoz mutant serilerini izin. Larva zebra balığı çıkarma genomik DNA araştırma birçok uygulama vardır. Bu iletişim kuralı geliştirmek için özgün hedefi etkili yetişkinliğe aldh7a19belirli mutasyonların nedeniyle ulaşamıyorum genotip larva oldu. Ayrıca, bu iletişim kuralını genotip ayrılığı ve epilepsi ilişkili fenotipleri özellikle de aldh7a1- / - balık larva sahne ileriye yönelik9gözlenmesi etkin. Her genotip RNA çekme ya da metaboliti ayıklama gibi yaklaşımlar larva havuzu doğru yordam9kırpma bu larva fin kullanarak Genotipleme sonra çalıştırılabilir. Sonuç olarak, eğitim kısa bir süre sonra düzenli olarak günde fin klipleri yüzlerce gerçekleştirmek için sadece minimal ve ucuz reaktifler, gerektiren bu basit ve zaman etkili iletişim kuralı, deneyimli bir dedektif kullanabilirsiniz. Bu Protokolü'nün kullanılmasına Pena ve ark. tarafından açıklanan araştırma mümkün kılan ve umarım daha geniş zebra balığı toplum için benzer bir amaca hizmet edecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Yazarlar nadir hastalık modelleri ve mekanizması (RDMM) ağ (in arayan Sağlık Kanada Enstitüleri araştırma (CIHR) ve genom Kanada tarafından finanse edilir) teşekkür etmek istiyorum. CK UROP burs ödülü (University of Ottawa) tarafından desteklenir. DLJ Vanier Kanada Yüksek Lisans Burs tarafından desteklenir. IAP, arayan Sağlık Kanada Enstitüleri araştırma (CIHR) doktora sonrası bursu ödülü tarafından desteklenir. Yazarlar genetik Society of izin verme için America tamamlayıcı Şekil 5 Pena, üzerinden bir uyarlaması kullanılacak ve bu protokol yayımlamak için teşekkür ederiz ve ark.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Stewart, A. M., Kalueff, A. V. Developing better and more valid animal models of brain disorders. Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).
- Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: legacies and new directions. Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
- Bedell, V. M., et al. In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Pena, I. A., et al. Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency. Genetics. 207, 1501-1518 (2017).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, 2410 (2013).
- Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135, 249-260 (2015).
- Scheldeman, C., et al. Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).
- Zabinyakov, N., et al. Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology. PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).
- Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), (2016).
- Kawakami, K., Hopkins, N.
- Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
- Zhu, X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 4, 6420 (2014).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).
- Ewing, B., Green, P. Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 8, 175-185 (1998).
