Summary
Hier presenteren we een protocol om te visualiseren van fijne structuren van perifere zenuwen door verkrijgen en 1-2 µm secties met toluïdine blauwe vlekken
Abstract
Perifere zenuwen uit te breiden door het hele lichaam, innervating onderzoeken weefsels met motorische of sensorische axonen. Als gevolg van wijdverspreide distributie, zijn perifere zenuwen vaak beschadigd als gevolg van trauma of ziekte. Zoals methoden en strategieën zijn ontwikkeld om te beoordelen van de perifere zenuw verwonding in diermodellen, functie en regeneratie, analyseren van de morphometry van de perifere zenuw geworden een essentiële terminal resultaten meting. Toluïdine blauwe verkleuring van de zenuw cross-secties verkregen uit hars ingesloten zenuw secties is een reproduceerbare methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve evaluaties van de perifere zenuwen, waardoor de visualisatie van morfologie axonen aantal en de mate van myelinisering. Deze techniek, kan zoals bij vele andere histologische methoden, moeilijk zijn om te leren en meester gebruikt standaard geschreven protocollen. De bedoeling van deze publicatie is daarom te accentueren schriftelijke protocollen voor toluïdine blauwe verkleuring van de perifere zenuwen met videografie van de methode, met behulp van de ischiadicus zenuwen geoogst van ratten. In dit protocol, beschrijven we in vivo de fixatie van de perifere zenuwen en de collectie van het weefsel, en na fixatie met 2% osmium tetroxide, inbedding van zenuwen in epoxyhars, en ultramicrotome segmenteren van zenuwen tot 1-2μm dikte. Zenuw secties vervolgens overgebracht naar een glasplaatje en gekleurd met toluïdine blauw, waarna ze zijn kwantitatief als in kwalitatief opzicht beoordeeld. Voorbeelden van de meest voorkomende problemen worden weergegeven, evenals stappen voor deze problemen.
Introduction
Perifere zenuwen uitbreiden door het lichaam, innervating onderzoeken weefsels met motorische of sensorische axonen1 Perifere zenuwen defecten veroorzaakt door medische aandoeningen en trauma vertegenwoordigen een belangrijke openbare gezondheids-zorg en hebben grote economische gevolgen2,3. Ondanks de vooruitgang bij het beoordelen van de resultaten van de perifere zenuw letsel en begrip van de zenuw regeneratie, zijn traditionele methoden zoals zenuw histologie en kleuring technieken essentiële instrumenten om kwalitatief en kwantitatief beoordelen van zenuw-gezondheid Als een terminal resultaten meting in diermodellen of verwijderde menselijk weefsel. Dit is vaak gekoppeld aan elektrofysiologische metingen van perifere zenuwen functie, waar de morphometry onthullen kan waarom functionele zenuw regeneratie deed of zich niet heeft voorgedaan.
Toluïdine blauwe verkleuring van de hars ingesloten perifere zenuwen semi-dunne secties is een gespecialiseerde methode voor imaging-myelinated zenuwvezels, verstrekken van hoge kwaliteit en heldere gedetailleerde beelden van zenuw structuren4,5,6 . Toluïdine blauw is een acidophilic Metachromatische vlek, ontdekt door William Henry Perkin in 18567, en is gebruikt in diverse medische toepassingen8. Toluïdine blauw gebeitste perifere zenuwen secties verkregen zenuw hars-ingebedde segmenten voorziet in duidelijke visualisatie van zenuw structuren. Visualisatie van de myelineschede structuur kan worden verbeterd door het gebruik van osmium tetroxide na fixatie4,9. Osmium-tetroxide is een giftige oxidator en lipide kleefpoeders agent die samenwerkt met de dubbele bindingen in lipiden, wat resulteert in duidelijk gedefinieerde lipide-rijke myeline omhulsels10. Osmium tetroxide is echter giftig, dure, vereist een langere incubatietijd van zenuw segmenten, en niet altijd wordt gebruikt.
Alternatieve methoden van verwerking en vlekken zijn ontwikkeld voor de visualisatie van de morfologie van de perifere zenuw; Paraffine, cryogene afdelen en epoxy hars-embedded zenuw afdelen gevolgd door kleuring met toluïdine blauw of fenyleendiamine oplossing heeft geweest tweedehands voor het kwantificeren van de morfologische veranderingen van perifere zenuw regeneratie 11,12 . Deze methoden hebben hun voordelen en opbrengst essentiële gegevens over het aantal axonen, myeline dikte, diameter van de axon en axon diameter tot en met myelinated vezel diameter (g-ratio) 11,13,14,15 .
Het primaire onderscheid van de hars inbedding in dit protocol is dat het verkrijgen van 1-2 μm dikte dwarsdoorsneden vanwege de hardheid van de hars vergemakkelijkt met behoud van de histologische kwaliteiten van de zenuw. Deze dunne secties, in tegenstelling tot de 4-5 μm dikte secties verkregen paraffine insluiten, bieden perifere zenuwen secties met een hogere resolutie, waardoor een nauwkeuriger kwantificering van axon myelinisering, zoals de g-ratio, die niet kan worden dikkere secties16verkregen. Terwijl cryogene afdelen kan worden gebruikt voor het verkrijgen van 1-2 µm secties, is het onze ervaring dat het moeilijker te verkrijgen van secties zonder talrijke grote barsten is geweest. Deze gebarsten secties kunnen leiden tot onjuiste telling van het aantal axonen en aspecten van myelinisering.
Naast toluïdine blauw kleuring17, kan een silver kleuring methode18 en Masson van trichrome kleuring4 ook worden gebruikt om te laten zien van de zenuw axonen. Echter, met behulp van hars inbedding van rat mediane zenuw secties gekleurd met haematoxyline en eosine of Masson van trichrome toonde vaag myeline omhulsels en niet-herkende structuren, overwegende dat toluïdine blauw kleuring duidelijk myelineschede beeld toonde en gemakkelijk kan worden gekwantificeerde4. Ondanks enkele beperkingen, toluïdine blauwe verkleuring van de hars ingesloten perifere zenuwen is een waardevolle techniek die kan worden gebruikt wanneer de hoge resolutie opnamen van zenuw morfologie zijn vereist.
Het primaire nadeel voor het insluiten van de hars is dat het is tijdrovend en niet mogelijk is om immunokleuring van het hetzelfde weefsel als gevolg van de moeilijkheid van het antigeen ophalen in vergelijking met paraffine en bevroren ingesloten secties technieken. Het is dus niet in het algemeen kunnen gebruik maken van het zelfde weefsel voor immunokleuring dat wordt verwerkt via hars-insluiting voor toluïdine blauw kleuring. Hoewel niet gebruikt hier, immunohistochemistry is desgewenst in de hars ingesloten secties, het gebruik van glycol methacrylaat harsen te embedding zorgt voor immunohistochemistry op weefselsecties moeten worden uitgevoerd, maar het is relatief duur19. Dit kan enigszins worden verzacht door het snijden van de perifere zenuw in afzonderlijke segmenten, sommige voor het insluiten van hars en anderen voor immunokleuring direct na fixatie.
Het proces van toluïdine blauwe verkleuring van de hars ingesloten perifere zenuwen, zoals met meest histopathologisch analyse, kan worden opgesplitst in vijf fasen, met inbegrip van fixatie, uitdroging, insluiten, afdelen en kleuring van20. Wij willen hier een protocol en praktische leidraad voor het gebruik van hars ingesloten rat nervus ischiadicus secties gekleurd met toluïdine blauw te verwerven hoge kwaliteitsbeelden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Volwassen Sprague-Dawley ratten werden gebruikt in dit project en alle procedures door de University of Wyoming institutionele dierenverzorgers en gebruik Comité zijn goedgekeurd.
1. operatie en In Vivo zenuw fixatie
Opmerking: De leveranciersgegevens voor alle materialen en apparatuur die wordt gebruikt in dit protocol worden opgesomd in de Tabel van materialen.
Opmerking: In vivo de fixatie van de zenuw wordt gebruikt voor het behouden van het weefsel en structurele degradatie dat tussen het moment van overlijden en verzameling van de zenuwen plaatsvinden kan te verminderen. In vivo weefsel fixatie is een standaardprocedure voor bereiding van weefsel van het zenuwstelsel voor histologie, waar perfusie is vaak een voorloper van dit. De plaatsing en grootte van perifere zenuwen toegestaan voor in situ fixatie. We raden niet collectie en fixatie van weefsel na euthanasie te wijten aan de mogelijkheid van de aantasting van het weefsel.
- Narcose de rat voorbereiden door deze te plaatsen in een inductie-kamer met 2-3% Isofluraan, dan plaatst u de narcose rat in de vatbaar positie op de bovenkant van een dissectie mat en onderhouden op 1-2% van Isofluraan via verdoving neus. Om ervoor te zorgen voldoende diepte van anesthesie, proefdieren voor het intrekken van de pedaal op de achtervoeten en controleren op de afwezigheid van ooglidreflex reflexen aan de ogen door het aanraken van de mediale canthus van het oog.
Opmerking: Intraperitoneale injectie van ketamine is een veelgebruikte alternatief voor geïnhaleerde Isofluraan. - Om te bloot van de nervus ischiadicus, scheren van het haar van de hind limb(s) en reinig de geschoren gebieden met 70% ethanol. Met een scalpel of schaar, maak een incisie van 2-3 cm in de huid langs de hind-limb vanaf de knie tot de grotere trochanter, waar palpatie van het dijbeen met behulp van de steriel scalpel om ervoor te zorgen de juiste locatie van de incisie. Het dijbeen is gelegen net proximale tot het meest toegankelijke segment van de nervus ischiadicus. Hoewel dit een niet-survival chirurgie is, handhaven steriele technieken.
- Na het maken van de huid incisie, zoek het vliegtuig tussen de musculus biceps femoris en de Musculus gluteus maximus, en met behulp van microdissection schaar scheiden van de onderliggende fascia en 2-3 cm van de onderstreping ischiadicus zenuw bloot. Om een duidelijke sectie van de nervus ischiadicus worden blootgesteld, gebruikt u een oprolmechanisme uit te breiden van de kloof tussen de twee spieren (figuur 1A). Met fijne pincet en iris schaar, zorgvuldig de zenuw van het omringende bindweefsel, met grote zorg niet te comprimeren of de zenuw te scheiden.
- Voeg voldoende Trump de fixeer (4% formaldehyde, Glutaaraldehyde van 1% in 1 x PBS (phosphate buffered saline) met 1.16 g van NaH2PO4· H2O per 100 mL) in de holte met de blootgestelde zenuw betrekking hebben op de zenuwen te laten zitten voor 10 minuten. Als nodig, plaats gaas onder het achterste been om de hoek, zodat meer fixeerspray kan worden toegevoegd in de holte. Verwijder de fixeerspray na 10 min en herhaal deze stap twee meer tijden.
- Met behulp van een ontleden Microscoop, de zenuw aan beide zijden met behulp van fijn dissectie schaar, om ervoor te zorgen niet te rekken of knijpen van de nervus ischiadicus, knippen en zetten direct de zenuw secties in 15 mL tubes met de Trump fixeerspray bij 4 ° C gedurende één week, veranderen de elke 48 h-fixeerspray.
- Laat geen dieren zonder toezicht tijdens een deel van de chirurgische ingreep. Na verwijdering van de zenuw, euthanaseren dieren door cervicale dislocatie terwijl onder verdoving.
2. Osmium Tetroxide behandeling en hars inbedding
- Post van fixatie, zorgvuldig verwijderen van alle resterende vet en bindweefsel van de zenuw en gebruik een scherpe scalpel te snijden van de zenuw in segmenten ongeveer 5 mm lengte (zenuw segmenten kunnen worden gescheiden en voorzien in verschillende buizen). Bereiden van verse 2% osmium tetroxide verdund in de Trump kleefpoeders oplossing en houden in een glazen buis. Onderdompelen zenuw segmenten in 2% osmium tetroxide voor 2 h, die in plastic buizen voor deze korte periode van tijd worden kan.
Opmerking: Sommige plastic buizen reageren met osmium tetroxide, veroorzaakt een verdonkering van de oplossing, zodat langdurige opslag van osmium tetroxide in plastic buizen wordt niet aanbevolen. - Met behulp van een epoxy middellange kit te embedding, bereiden de uiteindelijke insluiten formule:
- Meng de epoxy insluiten medium met DDSA-oplossing (dodecenylsuccinic anhydride (en); mengsel A) en meng de epoxy insluiten medium met NMA oplossing (methylnadic anhydride (en), mengsel B). Laat beide mengsels A en B ten minste 20 min. mix door roeren met een magneetroerder.
- Onmiddellijk vóór gebruik, meng mengsel A en B en het toevoegen van de versneller DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) in het aandeel van 1,5 tot 2,0% van het totale volume van het mengsel. Er rekening mee dat de DPM-30-oplossing juist om te voorkomen dat het blok donker van kleur en breekbaar moet worden gemeten. Alle hars chemische stoffen zijn giftig; Neem extra zorg om te voorkomen dat contact met de huid of bij inademing.
- Met behulp van 1,5 mL buizen, wassen zenuw segmenten met PBS en start het proces van uitdroging door het plaatsen van de zenuw segmenten in verschillende aceton/gedistilleerd water passages: 30%, 60%, 90%, concentraties voor elke 10 min, dan in 100% aceton 3 keer voor elke 10 min. Merk op dat ethanol gebruikt kan worden in de plaats van aceton.
- Voor hars infiltratie, plaatst u de zenuw segmenten in een mengsel van 1 deel van het definitieve insluiten mengsel en 1 deel 100% aceton voor 30 min., daarna in een mengsel van 2 delen van het definitieve insluiten mengsel en 1 deel 100% aceton voor 30 min , en ten slotte de zenuw in de finale segmenten plaats insluiten mengsel gedurende 30 minuten.
- De zenuw segmenten gestoken silicone rubber molds te embedding (we hebben gebruik gemaakt van 106 mm lengte x 71 mm breedte x 7 mm diepte; blokkeren grootte 11 mm lengte x 6 mm breed x 3 mm diep). Zachtjes toevoegen de hars op de top van de zenuwen, ervoor zorgend om dekking van de hele zenuw segmenten en luchtbellen voorkomen. Laat de mal met zenuw segmenten met de hars te polymeriseren bij 60 ° C's nachts.
3. afdelen door Ultramicrotome
- Bereiden van glas messen met een glas mes maker (figuur 1B) en glas messen met boten (Figuur 1 c), die worden gebruikt voor het verzamelen van de zenuw secties drijvend op het gedestilleerd water.
- Plaats de hars ingesloten zenuw blokken in de ultramicrotome houder met de trapeziumvormige zijde naar boven. Gebruik het toepassingsgebied van de ultramicrotome, trim eventuele overtollige hars rondom het zenuwweefsel, en het blok een trapezium vorm gezicht en zo dicht bij de longitudinale oppervlak van de zenuw mogelijk met behulp van een single-edged mes, zoals een scheermesje. Niet doordringen in de lengterichting oppervlak van het zenuw-segment, die herkenbaar is door zijn donkere vlekken door osmium tetroxide.
Opmerking: Trimmen van overtollige hars vermindert het gebied van hars worden gesegmenteerd en verbetering van de prestaties van de blade en snijden in opeenvolgende stappen. - Met behulp van de ultramicrotome, maken meerdere kruissecties voldoende om een uniforme doorsnede oppervlakte van het zenuwweefsel gebruikend een mes plain glas bloot te stellen. Zodra dit is gedaan, ga naar een glas mes waarvan boot is gevuld met gedestilleerd water op kamertemperatuur en aanpassen van de ultramicrotome tot 1-2 μm te snijden van dunne secties.
- Overbrengen in zwevende dunne secties van de glazen mes boot een druppel gedeïoniseerd water op glasplaatje met behulp van metalen lus (Figuur 1 d). Dia's met secties door meerdere malen boven een vuur voor een paar seconden, om ervoor te zorgen niet te oververhitten van de secties te drogen. Gedroogde secties onmiddellijk met toluïdine blauwe vlekken of bewaren bij kamertemperatuur voor enkele dagen voor de kleuring.
Opmerking: Secties kunnen ook worden gedroogd met behulp van een schotelverwarmer bij 60 ° C gedurende 15 minuten. Een langzaam droogproces maakt de secties glad.
4. toluïdine blauw kleuring
- Bereid 1%-oplossing van toluïdine blauw door ontbinding van 2 g natriumboraat in 100 mL gedeïoniseerd water, dan Voeg 1 g toluïdine blauw en roer tot het is opgelost. Filtreer de oplossing met behulp van filtreerpapier (porie grootte: 11 µm) en bewaar de oplossing in een ondoorzichtige fles op kamertemperatuur voor maximaal twee weken.
- Met behulp van een plastic pipet of micro Pipet, voeg een druppel toluïdine blauwe oplossing op de top van de secties van de zenuw en laat gedurende 20-30 s.
- Spoel alle toluïdine blauwe oplossing overtollige door zachtjes dompelen de dia's in gedeïoniseerd water kruik en herhaal 3 - 4 keer tot secties duidelijk zijn. De dia's ten minste 15 minuten bij 60 ° C, of 's nachts bij kamertemperatuur drogen en bedek dan de secties met een dekglaasje aan met behulp van reguliere montage medium. De gekoppelde dia's onmiddellijk onderzoeken of bewaren bij kamertemperatuur.
- Onderzoeken onder een lichte Microscoop. Een 100 X olie-immersie objectief wordt aanbevolen voor gedetailleerde beelden gebruikt voor het berekenen van de g-ratio's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hars ingesloten perifere zenuw secties gekleurd met toluïdine blauwe toestaan voor nauwkeurige histologische ondermeer. Een overzicht van de procedure blijkt uit (Figuur 2). Ischiadicus zenuwen secties ingesloten in hars medium en gekleurd met toluïdine blauwe toonde duidelijke beelden met optimale resolutie (3 cijfers). Schade aan de zenuwen kan leiden tot veel veranderingen in zenuw morfologische structuren, bijvoorbeeld, veranderingen in de vezels van de zenuw, axon diameter en dikte van de myelineschede. Deze methode kan behouden zenuw structuur in zijn natuurlijke vorm, dat het meten van diverse parameters zoals de verhouding van de diameter van de axon aan de totale vezel diameter (de g-verhouding vergemakkelijkt; Figuur 4). Een verscheidenheid van factoren kan leiden tot minder dan optimale perifere zenuwen secties met inbegrip van de aanwezigheid van scheuren (figuur 5A) in de sectie toe te schrijven aan ongepaste behandeling van de zenuw. Gaten kunnen ook optreden in de sectie (figuur 5B) als gevolg van onvoldoende uitdroging. Een andere mogelijke fouten in de procedure is vouwen van de secties (figuur 5C), die met behulp van inoculating lussen voor de overdracht van de sectie op het glasplaatje kunnen worden verholpen.
Figuur 1: chirurgie en segmenteren. (A) Rat nervus ischiadicus tijdens in vivo fixatie. (B) glas mes maker (C) glas messen met een boot. (D) Metalen lussen gebruikt voor de overdracht dreef dunne secties van de messen van glas tot een daling van gedeïoniseerd water op glasplaatje. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: schematische van de methode die wordt gebruikt in dit protocol. (A) volwassen Sprague-Dawley ratten is verdoofd, gevolgd door in vivo zenuw fixatie (B) en zenuw collectie (C). De volgende stap is na fixatie met 2% osmium tetroxide (D) en hars inbedding (E). Hars ingesloten zenuw secties zijn dan geknipt (F) en verdeelde (G) met behulp van een ultramicrotome. Ten slotte, zenuw secties op glasplaatje zijn gekleurd met toluïdine blue (H). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: transversale gedeelte van een rat ischiadicus zenuw gekleurd met toluïdine blauw. Ziet u de secties onder verschillende vergrotingen (10 X, 20 X 40 X en 60 X) voor duidelijk beeld met optimale resolutie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: transversale gedeelte van een rat ischiadicus zenuw gekleurd met toluïdine blauw. Deze hoge resolutie afbeelding (100 X) kan worden gebruikt voor het meten van de verhouding van de diameter van de axon aan de totale vezel diameter (de g-ratio). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Transverse secties van een rat ischiadicus zenuw gekleurd met toluïdine blauwe onder verschillende vergrotingen. Aresome van de problemen die tijdens de uitvoering van dit protocol optreden kunnen komt te staan. (A) en (B). De aanwezigheid van scheuren en gaten in de sectie van de zenuw veroorzaakt door ongepaste behandeling van de sectie en onvoldoende uitdroging van het weefsel, respectievelijk. (C). Folding van de secties, die tijdens het overbrengen van de secties van de messen van glas naar de dia kan gebeuren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Examens van de morfologische structuur van het perifere zenuw verwonding en regeneratie zijn frequente onderwerpen van studie13. In dit protocol beschrijven we de stappen voor het verkrijgen van hoge kwaliteitsbeelden voor histologische ondermeer met behulp van rat nervus ischiadicus weefsel ingebed in hars blokken en met toluïdine blauw gekleurd. Deze techniek geeft een beeld van de morfologie van de zenuw waarin de zenuw regeneratie kan worden gekwantificeerd door het meten van het aantal axonen, mate van myelinisering, aanwezigheid van infiltratieve fibrotische weefsel en de zenuwen van de gezondheid. Terwijl de beelden afdelen tonen en verwerking van ongedeerd zenuwen als monsters, dezelfde stappen en materialen zijn van toepassing op benadeelde zenuwen en zenuwen geregenereerd met leidingen of weefsel transplantaten, op voorwaarde dat fixatie van het weefsel is voldoende20, 21.
Terwijl alle stappen van het protocol essentieel zijn, zijn enkele van deze stappen meer waarschijnlijk leiden tot slechte kwaliteit secties of afbeeldingen. Onvoldoende weefsel uitdroging kan leiden tot gaten in de secties van de zenuw (figuur 5B). Een mogelijke verklaring is de immiscibility van hars met water, en teveel water in het weefsel hars voorkomt infiltreert in het weefsel. Daarom is het essentieel om de juiste uitdroging stap waardoor voldoende tijd en het gebruik van absolute aceton. Hoewel wij aceton in dit protocol gebruikt, kan het zijn dat ook ethanol worden gebruikt. Vele harsen, echter, zijn niet reactief met ethanol, zodat het weefsel moet worden behandeld met propyleenoxide om te dienen als een overgang tussen de ethanol uitdroging en hars inbedding.
Vanwege de dunheid van de secties, moet overdracht van zenuw secties van het glas mes naar het glasplaatje gebeuren met grote zorg (figuur 5C). 1-2 μm secties zijn zeer kwetsbaar en onjuiste overdracht van de sectie kan ervoor zorgen dat de sectie te breken. Als de sectie is opgepikt in het centrale gedeelte van de sectie met een naald, de sectie is gevoelig voor het vouwen zichzelf en vaak moeilijk te ontvouwen als overgedragen naar de dia zal zijn. Verschillende instrumenten kunnen worden gebruikt voor de overdracht van de sectie naar het glasplaatje, met inbegrip van naalden en loops, en elk moet worden getest voor de specifieke gebruiker om te bepalen welke de beste overdracht resultaten zal opleveren. Voor onze doeleinden verminderd met behulp van een lus die de gehele sectie sterk omvatten kon de vouwen van de secties wanneer zij werden overgedragen van het glas mes naar het microscoopglaasje (Figuur 1 d).
In het algemeen, is correcte afhandeling van de zenuwen essentieel omdat compressie van de zenuwen leiden scheuren tot kan optreden in secties van de zenuw (figuur 5A). Zenuw weefsel compressie kan gebeuren tijdens de overdracht van zenuw segmenten in de processen van blootstelling in het dier, fixatie, uitdroging en hars inbedding. Om te voorkomen dat de zenuw weefsel compressie, zenuw segmenten moeten worden overgebracht door fijne pincet en pakte op één uiteinde van het segment ideaal door gewoon de epineurial laag, zodat de hele zenuw zal niet worden beïnvloed. De aanwezigheid van scheuren en lijnen (mes marks) in de secties van de zenuw kan ook optreden als gevolg van saai of overused glas messen. Om te garanderen optimale afdelen, raden we maken van vers glas messen en wijzigen van het glas mes elke 25-30 snijdt, minder als segmenteren via zenuw ingekapseld binnen een geleider.
Harsen kunnen relatief duur, zijn ontoereikend wanneer longitudinale zenuw secties vereist zijn, en dure gereedschappen zoals een ultramicrotome en een glas mes maker kunnen vereisen. Ondanks deze beperkingen, toluïdine blauwe verkleuring van de hars ingesloten perifere zenuw secties wordt nog steeds beschouwd als de gouden standaard voor visualisatie van kruissecties van perifere zenuwen morphometry4,5. Longitudinale secties kunnen onthullen ook belangrijke kenmerken van perifere zenuwen, zoals axonale continuïteit en knopen van Ranvier, maar is vooral handig met immunohistochemie. In dergelijke gevallen is het de algemene praktijk voor het differentieel verwerken van twee secties van de dezelfde zenuw, blue één voor toluïdine kruissecties en anderzijds voor longitudinale immunohistochemistry. Als gevolg van verhoogde weerslag van perifere zenuwen trauma en verwondingen en de behoeften aan een betere manier van beoordelen van zenuw morfologische structuren, kan deze methode verder worden toegepast als een essentieel instrument om het krijgen van histologische van schade aan de zenuwen en regeneratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen conflicten van interesse hebben.
Acknowledgments
De auteurs wil thankthe Jenkins microscopie faciliteit bij de Universiteit van Wyoming voor hun hulp, en de leden van de Bushman lab, Kelly Roballo, Hayden waarheidsgetrouw, Wupu Osimanjiang en Subash Dhunghana, voor hulp bij de verzorging van de dieren. Deze publicatie werd mogelijk gemaakt door een institutionele Development Award (idee) van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder Grant # 2P20GM103432.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline | Gibco | 14200-075 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Acros Organics | 205950010 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-013-25 | |
| Epoxy Embedding Medium Kit | Sigma-Aldrich | 45359 | |
| Sodium Hydroxide Solution | Sigma-Aldrich | 72068 | To adjust Trump's fixative pH |
| Acetone | Fisher Chemical | 170942 | |
| Osmium Tetroxide Solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| VWR Micro Slides, Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545102 | |
| Pelco Embedding Cast | Fisher Scientific | NC9671811 | |
| Glass Knife Maker | RMC Products | GKM-2 | |
| Ultramicrotome | RMC Products | MT-XL | |
| 15 mL Conical Tube | Falcon | ISO 9001 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 4 mL Glass Vial | Sigma-Aldrich | 854190 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | For trimming resin block |
| Perfect Loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | For picking up thin resin sections |
| Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 100 Watt Oven | Millipore | 6350115 | |
| Whatman Filter Paper | Sigma-Aldrich | WHA10010155 | |
| 3 mL plastic pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | |
| Micro-surgical Kit | World precision instruments | ||
| Olympus fluorescence microscope | Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80 |
References
- Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us. Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).
- Grinsell, D., Keating, C. P. Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).
- Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair. Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).
- Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation. Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques. International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach. Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).
- Sridharan, G., Shankar, A. A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).
- Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. Toluidine blue and Lugol's iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy. Journal of Oral Pathology & Medicine. 21, 160-163 (1992).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).
- Dykstra, M. J. A manual of applied techniques for biological electron microscopy. , Plenum. New York. 257 (1993).
- Vleggeert-Lankamp, C. L. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review. Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).
- Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve. Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).
- Castro, J., Negredo, P., Avendaño, C. Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode. Brain research. , 65-77 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques. International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).
- Bozkurt, A., Lassner, F., O'Dey, D., Deumens, R., Böcker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves. Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).
- Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists. Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).
- Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration. Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).
- Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve. Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).
- Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections. Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).
- Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: A literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).
- Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety. Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).
- Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).
