Summary
ここで紹介を取得し、青いトルイジン 1-2 μ m のセクションを染色によって末梢神経の微細構造を可視化するためのプロトコル
Abstract
全身の運動や知覚神経軸索と標的組織を支配する末梢神経を拡張します。広範な分布のため末梢神経は、頻繁に外傷や疾患のため破損しています。メソッドと戦略は、動物モデル、機能と再生、末梢神経損傷を評価するために開発されていると末梢神経の形態学的分析重要なターミナルの結果測定になりました。樹脂埋め込み神経セクションからトルイジン ブルー クロス神経の染色切片は末梢神経、神経軸索の形態数と性の可視化を有効にすることの定性的および定量的な評価のための再現可能な方法髄鞘形成。この手法は、他の多くの組織学的方法と同様できます学び、標準的な文書によるプロトコルの使い方をマスターすることは困難。この文書の目的は、トルイジン ブルー坐骨神経ラットから収穫を使用して、メソッドのビデオ撮影と末梢神経の染色の文書によるプロトコルを強調するためにためです。末梢神経生体内固定と組織と四酸化オスミウム 2%、後固定のコレクションを述べるこのプロトコルでは、エポキシ樹脂とウルトラミクロトーム区分 1-2 μ m の厚さに神経の神経の埋め込み。神経節は、スライド ガラスに転送し、トルイジン青、その後彼らは、量的そして質的評価で染色します。これらの問題を軽減するための手順だけでなく、最も一般的な問題の例を示します。
Introduction
全身運動や感覚軸索1ターゲット組織を支配する末梢神経を拡張します。医学的障害によって引き起こされる末梢神経障害と外傷は主要な公衆衛生問題し大きな経済的影響2,の3を持っています。末梢神経損傷の結果を評価し、神経再生の理解の進歩にもかかわらず従来の神経組織や染色技術など、定性的・定量的評価神経の健康に不可欠なツール動物モデルやひと摘出組織のターミナルの結果測定。これはしばしば機能的な神経再生が発生しなかったかなぜ形態が明らかにできる末梢神経機能の電気生理学的測定とペアリングされています。
トルイジン ブルー染色樹脂埋め込まれている末梢神経の半薄いセクションの有髄神経線維、高品質を提供することをイメージングのための特殊なメソッドし、神経構造4,5,6 の詳細な画像をクリア.トルイジン ブルーは 18567でウィリアム ・ ヘンリー ・ パーキンが発見した、好酸性のメタクロマジー汚れをいくつかの医療応用8で使用されています。樹脂包埋神経セグメントから得られるトルイジン ブルー染色末梢神経節神経構造の明確な可視化が可能です。ミエリン鞘構造の可視化は、四酸化オスミウム ポスト固定4,9を使用して拡張できます。四酸化オスミウムは有毒酸化および脂質定着性エージェントの脂質の二重結合と対話する全く定義された脂質が豊富な髄鞘10の結果します。ただし、四酸化オスミウムは毒性、高価、長い神経セグメント, 培養を必要とし、常にされていません。
末梢神経形態の可視化のための処理と染色方法が開発されています。パラフィン、極低温断面とエポキシ樹脂埋め込み神経断面トルイジン ブルーで染色に続くまたはフェニレンジアミン ソリューションは、末梢神経再生11,12 の形態学的変化を定量化に使用されています.これらのメソッドは各軸索、ミエリン厚、軸索の直径、および有髄繊維径 (g 比) 11,13,14,15 軸索直径の数に自分の長所と収量の重要なデータがあります。.
このプロトコルでは樹脂埋め込む型の主な違いは、神経の組織学的品質を維持しながら樹脂の硬度による 1-2 μ m 厚の断面を得ることが容易です。埋め込み、パラフィンから 4-5 μ m 厚の切片ではなく、これらの薄いセクションを提供できない g 比などの軸索の髄鞘のより正確な定量化を可能にする、高解像度の末梢神経節厚いセクション16から得られます。極低温断面は 1-2 μ m のセクションを取得する使用できますが、多数の大規模な亀裂なしセクションを得ることは困難である私たちの経験をされています。このようなひびの入ったセクションは、髄鞘形成の側面と軸索の数の不正確なカウント可能性があります。
銀染色法18マッソンのヒアリン染色4は、トルイジン ブルー染色17、に加えて神経軸索を表示する使用できます。ただし、対し、トルイジン ブルー染色ミエリン鞘の明確なイメージを示し、簡単にすることができますヘマトキシリンとエオシンまたはマッソンのヒアリン示したかすかなミエリン鞘と認識できない構造ステンド グラス樹脂埋め込みラット正中神経断面を使用定量化された4になります。いくつかの制限にもかかわらずトルイジン ブルー染色樹脂の周辺神経、神経形態の高解像度の画像が必要な場合に使用できる貴重な手法です。
樹脂を埋め込むための主な欠点は、それは時間がかかり、パラフィンおよび凍結する埋め込まれたセクションの技術と比較されたときの抗原検索の難しさのため同じ組織の免疫染色を許可しません。したがって、トルイジン ブルー染色樹脂埋め込みを介して処理される免疫染色の同じ組織を活用することは一般的にはありません。免疫染色が必要な場合、ここで使用樹脂埋め込みのセクション、グリコール メタクリル酸樹脂を埋め込みの使用は、免疫染色組織切片上で実行するが、これは比較的高価な19。これは、固定後に直接別セグメント、樹脂を埋め込むためのいくつかおよび免疫染色の他に末梢神経を切断することによって多少軽減できます。
最も病理組織学的分析で、分けることができます 5 つの段階、固定、脱水を含む、埋め込み、断面、および20を染色、トルイジン ブルー染色樹脂のプロセスは末梢神経を埋め込まれています。トルイジン ブルーを取得する高品質の画像と埋め込みラット坐骨神経染色樹脂を使用してプロトコルおよび実用的な指針を提供するためにここを目指します。
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Protocol
アダルト スプレイグ ラットは、このプロジェクトで使用されていた、すべてのプロシージャは、ワイオミングの大学機関動物のケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 手術と生体内神経固定
注: すべての材料とこのプロトコルで使用される機器のベンダー情報は、材料のテーブルに表示されます。
メモ: In vivo神経固定組織を保持し、死の時間と神経のコレクション間で生じる構造劣化を軽減する使用されます。ティッシュの固定生体内では、灌流がこれへの前駆体では多くの場合組織の神経系組織の準備のための標準的な方法です。配置とその場で固定のため許可されて末梢神経のサイズ。コレクションと組織の劣化の可能性があるため安楽死した後ティッシュの固定はお勧めしません。
- 2-3% イソフルランと誘導の商工会議所に置くことで全身麻酔のラットを準備し、解剖マットの上にうつ伏せに麻酔下のラットを配置、イソフルラン麻酔の鼻の円錐形からの 1-2% で維持します。麻酔の十分な深さを確保するため後部のフィートのペダルの撤退のために動物をテストし、目の眼に触れることによって目で眼瞼反射の有無を確認します。
注: ケタミンの腹腔内投与はイソフルラン吸入方法が一般的に使用されます。 - 坐骨神経、hind limb(s) の毛を剃るし、70% エタノールで剃られた区域をきれいします。メスやハサミで大転子まで膝から後肢に沿って皮膚の 2 ~ 3 cm 切開を行う場所切開の適切な場所を確保するため生殖不能のメスを用いた大腿骨の触診。大腿骨は、ちょうど坐骨神経の最もアクセスしやすいセグメントに近位に位置しています。にもかかわらず、生存非手術、生殖不能の技術を維持します。
- 皮膚切開後、大腿二頭筋の筋と大殿筋の間飛行機を見つけると顕微解剖はさみを使って別の基になる筋膜と下線坐骨神経の 2-3 cm を公開します。坐骨神経の明確なセクションを公開するのにには、(図 1 a) の 2 つの筋肉の間のギャップを広げる収縮筋を使用します。微細鉗子とアイリスのはさみ、慎重に個別の神経周囲の結合組織、神経を切ったり圧縮が大きな世話からです。
- 十分なトランプの固定 (4% のホルムアルデヒド、1.16 g NaH2PO4· の 1 × PBS (リン酸緩衝生理食塩水) で 1% グルタルアルデヒドを追加します。100 mL あたり H2O) に空洞の露出した神経神経をカバーし、10 分間座ってみましょう。必要に応じて、後肢の下場所ガーゼ脚より多く定着剤は、キャビティに追加できますように角度を改善するかどうか。10 分後、定着剤を削除し、この手順を 2 回繰り返します。
- 解剖顕微鏡を用いたストレッチや坐骨神経をつまむことを確かめる細かい解剖はさみを使って両側から神経をカットし、すぐに 1 週間、変更のための 4 ° C でトランプの定着剤を含む 15 mL チューブで神経節を入れて、定着剤ごとの 48 時間。
- 放置しないでください動物手術の任意の部分の間に。神経を除去した後麻酔中頚部転位によって動物を安楽死します。
2 四酸化オスミウム処理と樹脂埋め込み
- 固定の記事、慎重に残りの脂肪や結合組織を神経から削除、鋭いメスを使用して神経をセグメント長さ (神経セグメントを分離し、異なるチューブでラベル付けすることができます): 約 5 mm にカットします。トランプの固定液で希釈した新鮮な 2% オスミウム四酸化を準備し、ガラス管に維持します。この短時間のプラスチック チューブにすることができます 2 時間 2% オスミウム四酸化で神経セグメントを浸します。
注: いくつかのプラスチック製のチューブは、四酸化オスミウム、プラスチック チューブの四酸化オスミウムの長期保存はお勧めできませんので、ソリューションの黒ずみの原因と反応します。 - 培地を埋め込み、エポキシを使用して、最終的な埋め込み式を準備します。
- 性ソリューション (ドデセニルこはく酸; A の混合物) 中の埋め込みエポキシを混合し、NMA ソリューション (methylnadic 無水; 混合物 B) 媒体を埋め込みエポキシをミックスします。A と B、マグネチックスターラーで攪拌して、少なくとも 20 分をミックス、両方の混合物をしましょう。
- 使用直前に A と B の混合物を混ぜるし、DPM 30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) 混合物の総量の 1.5 〜 2.0% の割合アクセラレータを追加します。DPM 30 ソリューションを正確に色は濃く、脆性になるからブロックを防ぐために測定べきであることに注意してください。すべての樹脂化学物質、有毒である;皮膚への接触や吸入を防ぐために余分な世話をします。
- 1.5 mL チューブを使用して、PBS で神経セグメントを洗うし、異なるアセトン/蒸留水の通路で神経セグメントを配置することによって脱水処理を開始: 30%、60%、90%、濃度、各 10 分間、3 回 10 分ずつの 100% アセトンで。 アセトンの代わりに、エタノールを使用ことができます注意してください。
- 樹脂浸透のため 1 部最終埋め込み混合物の混合物で神経セグメントおよび最終埋め込み混合物の 2 つの部分の混合物および 30 分の 1 の部分 100% アセトンの 30 分の 1 の部分 100% アセトンを配置します。、と最後に決勝で神経セグメント場所埋め込み混合物 30 分間。
- シリコーンゴム金型を埋め込み入れて神経セグメント (我々 は深さ 7 mm x 幅 71 mm × 106 mm を使用している; 深さ 3 mm x 幅 6 mm × 長さ 11 mm のブロック)。優しく全体神経セグメントをカバーし、空気の泡を避けるようにして、神経の上に樹脂を追加します。一晩 60 ° C で重合する樹脂と神経セグメントを含む金型をまま。
3. ウルトラミクロトームによる区分
- ガラスのナイフ メーカー (図 1 b) を使用してガラスのナイフの準備およびボート (図 1)、蒸留水に浮かぶ神経節を収集するために使用されているガラスのナイフ。
- ウルトラミクロトーム ホルダーに台形の面を上向きに樹脂が埋め込まれた神経ブロックを配置します。ウルトラミクロトーム スコープを使用すると、任意の余分な樹脂を周囲の神経組織をトリミングし、直面する台形形状のブロックを作ると、かみそりの刃のような単一研がれた刃を使用して、できるだけ神経の表面が縦に近い。四酸化オスミウムによるその暗い染色によって認識されている神経セグメントの縦の表面は浸透しません。
注: 余分な樹脂のトリミングは断面翼性能と後続の手順で切削向上させる樹脂部を減らします。 - ウルトラミクロトームを使用して、明白なガラスのナイフを使用して神経組織の一様断面の表面を公開するための十分な複数の断面を作る。これが終わったら、そのボートは室温で蒸留水を満たしたガラス ナイフに切り替える、薄い部分をカットする 1-2 μ m ウルトラミクロトームを調整します。
- ナイフ グラスボートからフローティング薄片を転送すると、金属製の輪 (図 1) を使用してスライド ガラスに脱イオン水のドロップ。炎の上のセクションを過熱しないように、数秒間数回を渡すことによってセクションを含むスライドを乾燥させます。トルイジンとすぐに乾燥したセクションを青い汚すまたは染色前に数日間常温で保存します。
注: セクションも乾燥できる 60 ° C で 15 分間暖かいプレートを使用します。遅い乾燥プロセスは、滑らかなセクションになります。
4. トルイジン青染色
- 100 mL の脱イオン水にホウ酸ナトリウム 2 g を溶解してトルイジン ブルーの 1% 溶液を準備し、トルイジン ブルーの 1 g を加えて溶けるまでかき混ぜます。ろ紙を使用してソリューションをフィルター (細孔サイズ: 11 μ m) 2 週間室温で不透明なボトルのソリューションを維持し、。
- プラスチック ピペットまたはマイクロ pipettor を使用して、神経節の上にトルイジン ブルー溶液の一滴を追加し、20-30 秒のまま。
- 脱イオン水の瓶にスライドがなだらかで余分なすべてのトルイジン ブルー ソリューションを洗い流すし、セクションが明確になるまでに 3-4 回を繰り返します。60 ° c または一晩室温でスライド、少なくとも 15 分を乾燥し、正規取付媒体を用いた coverslip でセクションをカバーします。常温で保存またはすぐにマウントされたスライドを確認します。
- 光学顕微鏡下で調べます。詳細な画像 g 比を計算するために使用には 100 倍油浸漬レンズをお勧めします。
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Representative Results
ガレージには、末梢神経とトルイジン ブルー染色のセクションでは、正確な組織学的データの数量が埋め込まれています。(図 2) には、プロシージャの概要を示します。坐骨神経セクションは、樹脂中に埋め込まれているし、最適解像度 (図 3) とトルイジン ブルー明瞭な画像で染色します。神経の損傷を引き起こす可能性が多くの変化神経の形態学的構造、たとえば、神経線維、軸索直径および髄鞘の太さの変化。このメソッドは、総繊維径 (g 比; 軸索直径の比率などいくつかのパラメーターの測定を容易に自然な形態で神経構造を維持することができます。図 4)。さまざまな要因は亀裂 (図 5 a) の存在をはじめ、神経の不適切な取り扱いのセクションよりも少ない最適な末梢神経節につながることができます。穴はまたセクション (図 5 b) が不足して脱水症が原因で発生します。手順で別の可能性のあるエラーは、スライド ガラス上にセクション トランスファーのため接種ループの使用によって改善することができます (図 5) のセクションの折り畳み式です。
図 1: 手術とセクショニングします。(A)ラット坐骨神経生体内で固定中。(B)ガラス ナイフ メーカー (C)ガラス ナイフ ボートで。(D)転送に使用される金属のループには、スライド ガラス上の脱イオン水のドロップにガラスのナイフから薄い部分が浮かんでいた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: このプロトコルで使用されるメソッドの概略図。(A)ラットを麻酔すると、大人のスプレイグ ドーリーに続いて生体内神経固定(B)と神経コレクション(C)。次の手順は、後固定 2% 四酸化オスミウム(D)と(E)を埋め込み樹脂です。セクションは、 (F)をトリミングし、切片(G) 、ウルトラミクロトームを使用して埋め込まれた神経を樹脂します。最後に、スライド ガラス上のセクションはトルイジンと汚れる神経青(H)であります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ラット坐骨神経の横断とトルイジン ブルー染色します。クリア画像の最適な解像度の異なる倍率 (10 X、20 X、40 X、60 X) の下のセクションを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: ラット坐骨神経の横断とトルイジン ブルー染色します。この高解像度画像 (100 X) は、総繊維径 (g 比) に軸索の直径の比を測定する使用できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: ラット坐骨神経の横断面とトルイジン異なる倍率でブルー染色します。このプロトコルのパフォーマンス中に発生する可能性のある問題のいくつかを示します。(A)および(B)。亀裂や穴それぞれセクションの不適切な処理と、組織が不足して脱水によって引き起こされる神経セクション内の存在。(C)します。 スライドにガラスのナイフからセクションを転送中に起こる可能性がありますのセクションの折りたたみ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
末梢神経損傷と再生の形態学的構造の検査、頻繁に研究13の。このプロトコルでは樹脂製ブロックに埋め込まれ、トルイジン ブルーで染色のラット坐骨神経組織を用いた組織学的データ数量の高品質の画像を取得する手順をについて説明します。この手法は、神経再生を軸索の数、髄鞘形成、浸潤線維組織の存在や健康神経の程度を測定することによって示すことができる神経の形態のイメージを提供します。画像表示区分と無傷の神経の処理、サンプル、同じ手順、材料、傷ついた神経に適用され、神経再生管や組織移植、提供組織の確定は十分な20、 21.
プロトコルのすべてのステップが不可欠な中、これらの手順の一部は質の悪いセクションまたは画像につながる可能性が高い。不十分な組織脱水は神経セクション (図 5 b) の穴につながる可能性があります。1 つの可能な説明は、水と樹脂の不混和現象と組織に余分な水分が組織を浸潤から樹脂を防ぐことができます。したがって、十分な時間と絶対アセトンの使用を許可する適切な脱水ステップを確保するため不可欠です。我々 はこのプロトコルでアセトンを使用するが、エタノールも使えます。多くの樹脂、しかしは、エタノールと反応組織は、エタノールの脱水と樹脂埋め込みの遷移として酸化プロピレンと扱われなければなりません。
セクションのため、ガラスのナイフからスライド ガラスに神経節を転送するべき細心 (図 5)。1-2 μ m のセクションは非常に壊れやすい、セクションの不適切な転送を破るセクションがします。セクションはセクションの中央部分に針で拾ったが、セクションは折り重なる自体になりやすいです、スライドへの転送時に展開することは困難があります。スライド ガラス、針、ループを含むセクションの転送のためのさまざまなツールを使用できます、それぞれ最高の転送結果が得られませんを決定する特定のユーザーをテストします。我々 の目的は、大きく全体のセクションを包含できるループを使って顕微鏡スライド (図 1) にガラスのナイフから転送された場合、セクションの折りたたみ削減できます。
一般に、神経の適切な処理は神経セクション (図 5 a) で発生するひび割れを引き起こす可能性があるため、神経の圧縮に不可欠です。神経組織の圧迫は、動物、固定、脱水、および樹脂を埋め込むことで露出の過程で神経セグメントの転送中に発生します。神経組織の圧迫を避けるためには、神経セグメント微細鉗子で転送する必要があります、ピックアップをセグメントの一端理想的に維層だけで全体の神経には影響はありませんので。亀裂と神経節 (ナイフをマーク) の存在が鈍いまたは使い古されたガラスのナイフのためもあります。最適な断面を保証、新鮮なガラスのナイフを作るとすべての 25-30 カット、コンジットを固めていた神経を切断少ないガラス ナイフを変更することをお勧めします。
樹脂は、比較的高価なことができますが不十分であるときに縦の神経節は必須であり、ウルトラミクロトームとガラスのナイフ メーカーなど高価なツールを必要とすることができます。これらの制限にもかかわらずトルイジン ブルー染色樹脂の周辺神経セクションは末梢神経形態4、5の断面の可視化のためのゴールド スタンダードにみなされます。縦断はまた軸索の継続性やランヴィエの絞などの末梢神経の重要な機能を明らかにすることができますが免疫組織化学で役に立ちます。このような場合は、差動同じ神経の 2 つのセクションを処理する一般的な方法は、トルイジンの青断面、縦断的免疫組織化学の他。末梢神経の外傷や傷害の増加が認と神経形態学的構造を評価するための良い方法のニーズのためこのメソッドは、神経の損傷と再生の組織学的データを得るために必要不可欠なツールとして適用する続行できます。
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Disclosures
著者は、利害の対立があるないことを宣言します。
Acknowledgments
著者は、彼らの助けと動物の世話の援助のケリー ロバロ、ヘイデンは True、Wupu Osimanjiang、スバーシュ Dhunghana ブッシュマン ラボのメンバーのためのワイオミングの大学のジェンキンス顕微鏡施設明見中学校みたいと思います。このパブリケーションによってできた制度開発賞 (アイデア) から国立科学研究所の一般医療補助金 # 2P20GM103432 [健康の国民の協会の。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline | Gibco | 14200-075 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Acros Organics | 205950010 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-013-25 | |
| Epoxy Embedding Medium Kit | Sigma-Aldrich | 45359 | |
| Sodium Hydroxide Solution | Sigma-Aldrich | 72068 | To adjust Trump's fixative pH |
| Acetone | Fisher Chemical | 170942 | |
| Osmium Tetroxide Solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| VWR Micro Slides, Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545102 | |
| Pelco Embedding Cast | Fisher Scientific | NC9671811 | |
| Glass Knife Maker | RMC Products | GKM-2 | |
| Ultramicrotome | RMC Products | MT-XL | |
| 15 mL Conical Tube | Falcon | ISO 9001 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 4 mL Glass Vial | Sigma-Aldrich | 854190 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | For trimming resin block |
| Perfect Loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | For picking up thin resin sections |
| Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 100 Watt Oven | Millipore | 6350115 | |
| Whatman Filter Paper | Sigma-Aldrich | WHA10010155 | |
| 3 mL plastic pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | |
| Micro-surgical Kit | World precision instruments | ||
| Olympus fluorescence microscope | Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80 |
References
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