Summary
Burada güzel yapıları periferik sinir alma ve 1-2 µm bölümlerle toluidin blue boyama görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut
Abstract
Periferik sinirler hedef dokulara motor ya da duyusal aksonlar ile innerve vücut boyunca uzanır. Yaygın dağıtım nedeniyle periferik sinirler sık travma veya hastalık nedeniyle zarar görmüş. Periferik sinir yaralanma hayvan modellerinde, işlev ve rejenerasyon, değerlendirmek için geliştirilmiştir yöntemleri ve stratejileri gibi periferik sinirleri morfometri analiz bir temel terminal sonuç ölçü haline gelmiştir. Toluidin sinir çapraz boyama Mavi bölümler gömülü reçine sinir bölümlerden elde edilen nitel ve nicel değerlendirmeler periferik sinir, görselleştirme akson sayısı Morfoloji ve derecesi etkinleştirme için tekrarlanabilir bir yöntemdir myelination. Bu teknik yöntemlerle birçok diğer histolojik olarak öğrenmek ve standart yazılı protokolleri kullanarak master zor olabilir. Bu yayının amacı bu nedenle toluidin videografisi siyatik sinirleri sıçanlarından emir hasat kullanarak yöntemi ile periferik sinirleri boyama mavi yazılı protokollerde vurgulamak için. Bu protokol için in vivo periferik sinirleri fiksasyon ve doku ve sonrası fiksasyon ile % 2 osmiyum tetroxide, topluluğu tarif epoksi reçine ve ultramicrotome sinir için 1-2μm kalınlık kesit sinirleri katıştırma. Sinir bölümleri bir cam slayt transfer ve sonra onlar nicelik ve nitelik değerlendirilir toluidin blue ile lekeli. En sık görülen sorunlar örnekleri yanı sıra bu sorunları azaltıcı adımlar gösterilmiştir.
Introduction
Periferik sinirler hedef dokulara motor ya da duyusal aksonlar1ile innerve vücut boyunca uzanır. Tarafından tıbbi bozukluklar periferik sinirleri hataları neden ve travma büyük kamu sağlık kaygı temsil ve büyük ekonomik etkileri2,3. Periferik sinir yaralanmaları sonuçlarını değerlendirmek ve sinir rejenerasyon anlama gelişmeler rağmen sinir Histoloji ve teknikleri boyama gibi geleneksel yöntemleri nitelik ve nicelik sinir sağlık değerlendirmek için gerekli araçları vardır. bir terminal sonucu ölçüyü hayvan modelleri veya eksize insan dokusu. Bu kez neden işlevsel sinir rejenerasyon mi ya da olmamış nerede morfometri ortaya çıkarabilir periferik sinir fonksiyonu, elektrofizyolojik ölçümleri ile eşleştirilmiş olan.
Toluidin blue gömülü reçine periferik sinirleri yarı ince bölümlerini boyama myelinated sinir lifleri, yüksek kalite sağlayan görüntüleme için özel bir yöntemdir ve sinir yapıları4,5,6 detaylı görüntülerini temizlemek . Toluidin blue 18567' de, William Henry Perkin tarafından keşfedilen bir acidophilic metakromatik leke ve çeşitli tıbbi uygulamalar8' kullanılır. Toluidin periferik sinirleri mavi lekeli bölümleri reçine gömülü sinir kesimleri elde sinir yapıları net görselleştirme için sağlar. Görselleştirme miyelin kılıf yapısının osmiyum tetroxide sonrası fiksasyon4,9kullanımı ile gelişmiş olabilir. Osmiyum tetroxide starkly tanımlanmış lipid zengini miyelin kılıf10dakika sonra sonuçlanan lipidler, Çift bonolarını ile etkileşimde bulunan bir toksik oksidan ve lipid sabitleştirici ajandır. Ancak, osmiyum tetroxide toksik, pahalı, sinir segmentlerinin uzun bir kuluçka için ve her zaman kullanılmaz.
İşleme ve boyama alternatif yöntemler periferik sinirleri morfoloji görselleştirme için geliştirilmiştir; Boya çözüm periferik sinirleri rejenerasyon 11,12 morfolojik değişiklikleri ölçmek için kullanılan veya parafin, kriyojenik kesit ve epoksi reçine gömülü sinir kesit toluidin blue ile boyama tarafından takip . Bu yöntemler her aksonlar, miyelin kalınlığı, akson çapı ve akson çapı myelinated lif çapı (g-oran) 11,13,14,15 sayısı avantaj ve verim temel veri var .
Birincil reçine-bu iletişim kuralı içinde katıştırma o sinir histolojik özellikleri korunarak reçine sertliği nedeniyle 1-2 mikron kalınlık kesit alma kolaylaştırır ayrımdır. Bu ince kesitler, gömme, parafin elde 4-5 mikron kalınlığı bölümleri aksine periferik sinir bölümlerde axon myelination, g-oranı, olamaz gibi daha doğru bir miktar için izin veren yüksek çözünürlüklü daha kalın kesitler16' dan elde. Kriyojenik kesit 1-2 µm bölümler elde etmek için kullanılan iken, bizim deneyim daha bölümlerde çok sayıda büyük çatlak olmadan elde etmek zor oldu. Kırık tür bölümleri akson sayısı ve myelination yönleri yanlış sayım neden olabilir.
Toluidin blue yanı sıra17boyama yöntemi18 ve Masson'ın trichrome boyama4 boyama bir gümüş de sinir aksonlar göstermek için kullanılabilir. Oysa toluidin blue boyama açık miyelin kılıf görüntü gösterdi ve -ebilmek kolayca Ancak, reçine sıçan medyan sinir bölümlerini katıştırma kullanarak ya Hematoksilen ve eozin veya Masson'ın trichrome gösterdi zayıf miyelin kılıf ve tanınmayan yapıları ile lekeli quantified4yaşında. Bazı sınırlamaları rağmen toluidin gömülü reçine periferik boyama mavi sinir sinir morfolojisi yüksek çözünürlüklü görüntüleri gerekli olduğunda kullanılabilecek değerli bir teknik var.
Reçine katıştırma için birincil dezavantajı bu zaman alan ve parafin ve donmuş gömülü bölümleri teknikleri ile karşılaştırıldığında antijen alma zorluğu nedeniyle aynı doku immunostaining için izin vermez olduğunu. Bu nedenle, reçine-toluidin blue boyama için katıştırma üzerinden işlenir immunostaining için aynı doku kullanmak genellikle mümkün değildir. Her ne kadar değil immünhistokimya isteniyorsa burada, kullanılan reçine katıştırılmış kesitler, glikol metakrilat reçineleri katıştırma kullanımı verir için doku bölümler üzerinde gerçekleştirilecek immünhistokimya; nispeten pahalı19yaşında Bu biraz periferik sinirleri ayrı kesimleri, bazı reçine katıştırma için ve diğerleri için immunostaining içine doğrudan fiksasyon sonra kesim tarafından azaltılabilir.
Toluidin blue reçine boyama işlemi en histopatolojik analizi ile fiksasyon, su kaybı da dahil olmak üzere, gömme, kesit ve20boyama beş aşamada bölünmüştür gibi periferik sinirler, katıştırılmış. Biz burada katıştırılmış sıçan siyatik sinir bölümleri lekeli reçine toluidin elde etmek için mavi yüksek kaliteli görüntüler ile kullanmak için bir iletişim kuralı ve pratik kılavuz sağlamayı amaçlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yetişkin Sprague Dawley rat bu projede kullanılan ve tüm yordamları Wyoming Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi.
1. ameliyat ve Vivo sinir fiksasyon
Not: Tüm malzeme ve cihazları bu protokol için için satıcı bilgileri Malzemeler tablolistelenir.
Not: Vivo içinde sinir fiksasyon dokuyu korumak ve ölüm saati ve sinirleri topluluğu arasında oluşan yapısal bozulma azaltmak için kullanılır. Vivo doku fiksasyon histoloji, sinir sistemi doku hazırlanması için standart bir uygulama burada perfüzyon kez bu habercisi olmasıdır. Yerleşimi ve boyutu periferik sinirlerin yerinde fiksasyon için izin. Biz toplama ve ötenazi doku yıkımı olasılığı nedeniyle sonra doku fiksasyon önermiyoruz.
- Fare için genel anestezi ile % 2-3 isoflurane, bir indüksiyon odasında koyarak hazırlamak sonra imzalat sıçan yüzükoyun üst kısmında bir diseksiyon mat yerleştirin ve isoflurane anestezik burun konisi üzerinden % 1-2 korumak. Yeterli anestezi derinliği sağlamak için hayvanlar arka ayak pedalı çekilmesi için sınav ve palpebral refleksleri gözleri, yokluğu için göz medial canthus dokunarak kontrol.
Not: Ketamin mayi enjeksiyon inhale isoflurane yaygın olarak kullanılan bir alternatiftir. - Siyatik sinir göstermek için hind limb(s) saç tıraş ve % 70 etanol ile traş alanları temiz. Bir neşter ya da makas ile hind bacak diz daha büyük trochanter kadar birlikte deride 2-3 cm kesi yapmak nereye belgili tanımlık kesme uygun konumunu sağlamak için steril neşter kullanarak femur palpasyonla. Uyluk kemiği sadece proksimal siyatik sinir en kolay bölümüne yer alır. Bu bir hayatta kalma ameliyat olsa bile, steril teknikleri korumak.
- Cilt kesi yaptıktan sonra pazı kemiği kas ve gluteus maksimus kas arasında uçak bulun ve mikrodiseksiyon makas kullanarak temel fasya ayrı ve 2-3 cm, alt çizgi siyatik sinir ortaya çıkarmak. Siyatik sinir net bir bölümünü göstermek için bir Retraktörü iki kas (Şekil 1A) arasındaki boşluğu genişletmek için kullanın. İyi forseps ve Iris makas ile dikkatli bir şekilde bağ dokusu, sıkıştırmak veya sinir kesmek için çok dikkat çekici çevre sinir ayırın.
- Yeterli Trump'ın sabitleştirici (%4 formaldehit, 1 x PBS (fosfat tamponlu tuz) ile NaH2PO4· 1.16 g %1 oxazolidin Ekle H2O 100 mL başına) maruz sinir sinir kapak ve 10 dakika oturup bekleyin içeren kavite içine. Gerekli, hind altında yer gazlı bez daha fazla sabitleştirici boşluğa eklenebilir açı geliştirmek için bacak. 10 dakika sonra sabitleştirici kaldırmak ve bu iki kez daha tekrarlayın.
- Diseksiyon mikroskop kullanarak genişletmek ya da siyatik sinir, çimdik emin ince diseksiyon makası kullanarak her iki taraftan sinir ve hemen Trump'ın sabitleştirici değişen bir hafta için 4 ° C'de içeren 15 mL tüpler sinir bölümlerde koydu sabitleştirici her 48 h.
- Hayvanlar, herhangi bir bölümünü cerrahi işlem sırasında sahipsiz bırakmayın. Sinir çıkarıldıktan sonra rahim ağzı çıkık iken anestezi altında tarafından hayvanlar ötenazi.
2. osmiyum Tetroxide tedavi ve reçine katıştırma
- Fiksasyon sonrası, dikkatle herhangi bir kalan yağ ve bağ dokusu sinir kaldırmak ve sinir bölümler 5 mm uzunluğunda (segmentlere ayrılmış ve etiketli farklı tüplerde sinir) yaklaşık halinde kesmek için keskin bir neşter kullanın. Taze % 2 osmiyum tetroxide Trump'ın sabitleştirici çözümde seyreltilmiş hazırlamak ve bir cam tüp içinde tutun. % 2 osmiyum tetroxide 2 h, plastik tüplerde kısa bu süre için olabilir için sinir segmentlerinde bırakın.
Not: Bazı plastik tüpler osmiyum osmiyum tetroxide Plastik tüpler uzun süreli depolama tavsiye edilmez bu yüzden bir çözümü, karartma neden tetroxide ile tepki. - Orta kiti gömme bir epoksi kullanarak, son katıştırma formül hazırlayın:
- Orta DDSA çözüm (dodecenylsuccinic anhidrit; karışım A) katıştırma epoksi mix ve orta NMA çözüm (methylnadic anhidrit; karışım B) katıştırma epoksi karışımı. A ve B en az 20 dakika karıştırarak mıknatıslı bir karıştırıcı ile tarafından karıştırın her iki karışımları izin.
- Hemen kullanmadan karışım A ve B mix ve Hızlandırıcı DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) karışımı toplam hacminin 1.5-%2.0 oranındaki. ekleyin DPM-30 çözüm tam blok koyu renkli ve kırılgan olmasını önlemek için ölçülmelidir unutmayın. Tüm reçine kimyasal toksik maddelerdir; Ciltle temas veya inhalasyon önlemek için ekstra dikkat.
- 1.5 mL tüpler kullanarak, yıkama PBS olan sinir kesimi ve farklı aseton/distile su pasajlar sinir kesimleri yerleştirerek dehidratasyon işlemini başlatmak: % 30, % 60, %90, konsantrasyonları 10 dk sonra 10 dakika için 3 kez %100 aseton. Not Bu etanol aseton yerine kullanılabilir.
- 1 yarı final gömme karışımı karışımı sinir segmentlerinde ve 1 Bölüm % 100 aseton 30 dk sonra son katıştırma karışımı 2 bölümden oluşan bir karışım ve 1 Bölüm % 100 aseton 30 dk içinde için reçine infiltrasyon için yer , ve sonunda sinir kesimleri finalde yer katıştırma karışımı 30 dk için.
- Sinir kesimleri silikon kauçuk kalıpları katıştırma koymak (biz 106 mm Uzunluk x 71 mm genişlik x 7 mm derinlik kullandık; blok boyutu 11 mm Uzunluk x 6 mm genişlik x 3 mm derinlik). Yavaşça bütün sinir segmentleri kapsayacak ve hava kabarcıkları yapmaktan kaçınmak emin sinirler üzerine reçine ekleyin. 60 ° C'de gecede polimerize reçine olan sinir kesimi içeren kalıp bırakın.
3. kesit Ultramicrotome tarafından
- Cam bıçak cam bıçak maker (Şekil 1B) kullanarak hazırlamak ve sinir bölümleri distile su üzerinde yüzen toplamak için kullanılan tekneler (Şekil 1 c), bıçaklarla cam yapmak.
- Gömülü reçine sinir blokları ultramicrotome yuvasına trapez yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Ultramicrotome kapsamı kullanarak, herhangi bir fazla reçine sinir dokusu çevreleyen trim ve yamuk şekli yüz blok yapmak ve sinir jilet gibi tek taraflı bir bıçak kullanarak mümkün olduğunca boyuna yüzeyine yakın. Osmiyum tetroxide tarafından karanlık onun boyama tarafından algılanabilmesini sinir segmentin boyuna yüzeye nüfuz değil.
Not: Aşırı reçine kesme kesitli ve bıçak performans ve kesme sonraki adımda geliştirmek için reçine alanı azaltmak. - Ultramicrotome kullanarak, birden çok kesit düzgün kesit yüzeyi düz cam bıçak kullanarak sinir dokusunun ortaya çıkarmak yeterli olun. Bu yapıldıktan sonra tekne kimin oda sıcaklığında distile su ile dolu bir cam bıçak geçin ve ultramicrotome ince kesitler kesmek için 1-2 mikron için ayarlayın.
- Kayan ince kesitler cam bıçak tekne metal döngü (Şekil 1 d) kullanarak cam slayt üzerinde bir damla deiyonize su aktarın. Bölüm bölümleri ısınmasına emin bir kaç saniyeliğine bir alev üzerinde birkaç kez geçirerek içeren slaytlar kuru. Kurutulmuş bölümlerle hemen toluidin mavi leke veya boyama önce birkaç gün boyunca oda sıcaklığında saklayın.
Not: Bölümler de sıcak bir tabak 60 ° C'de 15 dakikadır kullanarak kurumuş. Yavaş bir kurutma işlemi bölümler pürüzsüz yapar.
4. toluidin Blue boyama
- Toluidin blue çözümünün %1 100 mL deiyonize su, sodyum borat, 2 g çözülerek hazırlamak sonra toluidin mavi 1 g ekleyin ve eriyene kadar karıştırın. Filtre kağıdı kullanarak çözüm filtre (gözenek boyutu: 11 µm) ve çözüm opak bir şişenin içine oda sıcaklığında iki haftaya kadar tutun.
- Bir plastik pipet veya mikro pipettor kullanarak, sinir bölümleri üst toluidin blue çözüm bir damla ekleyin ve 20-30 s için bırakın.
- Yavaşça slaytlar deiyonize su kavanoza daldırma tarafından tüm toluidin blue çözüm aşırı durulama ve bölümler berraklaşana kadar 3 - 4 kez tekrarlayın. Slaytlar en az 15 dk 60 ° c veya gecede oda sıcaklığında kuru ve sonra bölümleri düzenli montaj orta kullanarak bir coverslip ile kapağı. Bağlı slayt hemen incelemek veya oda sıcaklığında saklayın.
- Işık mikroskop altında incelemek. Bir 100 X yağı daldırma lens g-oranları hesaplamak için kullanılan detaylı görüntüler için önerilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reçine periferik sinirleri toluidin ile mavi lekeli bölümleri doğru histolojik veri quantifications için izin gömülü. Yordamı genel bakış (Şekil 2' de) gösterilir. Siyatik sinir bölümleri reçine ortamda gömülü ve toluidin mavi net gösterdi görüntüleri en iyi çözünürlük (Şekil 3) ile lekeli. Sinir hasarı pek çok değişiklik sinir morfolojik yapıları, örneğin, sinir lifi, akson çapı ve miyelin kılıf kalınlığı değişikliklere neden olabilir. Bu yöntem sinir yapısı toplam elyaf çapı (g-oran; axon çapına oranı gibi çeşitli parametreleri ölçüm kolaylaştırır onun doğal formunda koruyabilirsiniz Şekil 4). Çeşitli faktörlere daha az optimal periferik sinirleri bölümler sinir yanlış işlenmesi nedeniyle bölümünde çatlaklar (Şekil 5A) varlığı da dahil olmak üzere yol açabilir. Delikleri de (Şekil 5B) bölümünde yetersiz dehidrasyon nedeniyle oluşabilir. Başka bir olası hata yordamdaki bölümüne transfer cam slayt üzerine aşı döngüler kullanarak çözülebilir bölümleri (Şekil 5C), katlama olduğunu.
Şekil 1: ameliyat ve kesit. (A) fare siyatik sinir içinde vivo fiksasyon sırasında. (B) cam bıçak maker (C) cam bıçak tekne ile. (D) Metal döngüler aktarmak için kullanılan bir damlasına cam bıçak cam slayt deiyonize su bölümleri ince satışa çıkardı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Bu protokol için kullanılan yönteminin şematik. (A) yetişkin Sprague Dawley rat anestezi, in vivo sinir fiksasyon (B) ve sinir koleksiyonu tarafından (C)takip etti. Sonrası fiksasyon ile % 2 osmiyum tetroxide (D) ve (E)katıştırma reçine sonraki adımdır. Bölümleri vardır (F) kesildikten sonra ve kesitli (G) bir ultramicrotome kullanarak katıştırılmış sinir reçine. Son olarak, sinir cam slayt bölümlerde toluidin ile lekeli mavi (H). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 3: bir fare siyatik sinir enine bölümünü toluidin ile mavi lekeli. En iyi çözünürlük ile net görüntünün farklı büyüklüklerde (10 X, 20 X, 40 X ve 60 X) öğesinin altındaki bölümlerde gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: enine bir sıçan siyatik sinir bölümünü toluidin ile mavi lekeli. Bu yüksek çözünürlüklü görüntü (100 X) akson çapı toplam elyaf çapı (g-oran) için oranını ölçmek için kullanılabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: enine bir sıçan siyatik sinir bölümlerini toluidin ile farklı büyüklüklerde altında mavi lekeli. Bu iletişim kuralı performansını sırasında karşılaşılan sorunların da gösterilir. (A) ve (B). Çatlak ve delikler sırasıyla Bölüm yanlış işlenmesi ve dokusunun yetersiz dehidrasyon neden sinir bölümün içine varlığı. (C). Katlanır bölümleri bölümleri cam bıçak slayda aktarma sırasında ortaya çıkabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Periferik sinir hasarı ve rejenerasyon morfolojik yapılarının imtihanlarını çalışma13sık konularıdır. Bu protokol için reçine bloklar halinde gömülü ve toluidin blue ile lekeli sıçan siyatik sinir dokusu kullanarak histolojik veri quantifications için yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için gereken adımları açıklar. Bu tekniğin sinir morfoloji içinde sinir rejenerasyon akson sayısı, myelination, infiltrative fibrotik doku varlığı ve sağlığı sinirler ölçerek sayısal bir görüntü sağlar. Yeterli20kesit resimleri göster ve işleme zarar görmemiş sinir doku o fiksasyonu gibi örnekler, aynı adımları ve malzemeler için yaralı sinirleri tabidir ve sinirler kanallarını veya doku greft, yeniden sağlanan iken, 21.
İletişim kuralının tüm adımları gerekli olmakla birlikte, bazı adımlar kalitesiz bölümleri veya görüntüleri daha yüksektir. Yetersiz doku dehidratasyon sinir bölümler (Şekil 5B) delikler açabilir. Bir mantıklı açıklaması reçine ile su immiscibility bu ve aşırı su doku doku sızmak reçine engeller. Bu nedenle, yeterli zaman ve mutlak aseton kullanımını sağlayan uygun dehidratasyon adım sağlamak için önemlidir. Bu protokol için aseton kullanılmış olmasına rağmen etanol de kullanılabilir. Doku etanol dehidratasyon ve reçine katıştırma arasında bir geçiş olarak hizmet verecek propilen oksit ile tedavi gerekir bu yüzden birçok reçineler, ancak, etanol ile reaktif değildir.
Bölümleri zayıflık nedeniyle sinir bölümleri cam bıçak cam slayt aktarma büyük bir özenle (Şekil 5C) yapılmalıdır. 1-2 mikron bölümler çok kırılgan ve uygunsuz transfer bölümünün kırmak bölüm neden olabilir. Bölüm bölüm orta kısmında bir iğneyle aldı, bölümü kendi kendine katlanır eğilimli ve sık sık slayda transfer edildiğinde açılmak zor olacak. Farklı araçları iğneler ve döngüler, dahil olmak üzere cam slayt bölüm aktarmak için kullanılabilir ve her hangi sonuçlar en iyi transferi verecektir belirlemek belirli bir kullanıcı için test edilmelidir. Bizim için tüm bölüm büyük ölçüde kapsayacak bir döngü kullanarak ne zaman mikroskop slayt (Şekil 1 d) cam bıçak aktarılan bölümlerini katlama azaltılmış.
Genel olarak, sinirleri uygun taşıma çatlaklar sinir bölümleri (Şekil 5A) sinir basısına neden olabilir önemlidir. Sinir doku sıkıştırma hayvan, fiksasyon, dehidratasyon ve reçine katıştırma pozlama süreçlerinin sinir segmentlerinde transferi sırasında ortaya çıkabilir. Sinir doku sıkıştırma önlemek için sinir kesimleri tarafından iyi forseps aktarılması gerektiğini ve segment bir ucunu ideal olarak sadece epineurial tabaka tarafından tüm sinir etkilenmez böylece üzerine aldı. Çatlaklar ve sinir bölümlerdeki satırları (bıçak izleri) varlığı da donuk veya overused cam bıçak nedeniyle oluşabilir. En uygun kesit garantilemek için taze cam bıçak yapma ve her 25-30, kesikler, Eğer bir kanal içinde kaplı sinir aracılığıyla kesit daha az cam bıçak değiştirme öneririz.
Reçineler, nispeten pahalı olabilir boyuna sinir bölümleri gereklidir ve bir ultramicrotome ve cam bıçak makinesi gibi pahalı araçlar gerektirebilir yetersizdir. Bu sınırlamaları rağmen toluidin gömülü reçine periferik boyama mavi sinir bölümleri hala kesitleri periferik sinirleri morfometri4,5görselleştirme için altın standart kabul edilir. Boyuna kesitler de periferik sinirler, aksonlar süreklilik ve düğümleri of Ranvier, gibi önemli özellikleri ortaya çıkarabilir ama immünhistokimya ile en çok yararlıdır. Bu differentially aynı sinir iki bölümden işlemek için genel bir uygulamadır bu gibi durumlarda, toluidin için mavi kesitleri ve diğer boyuna immünhistokimya için. Periferik sinir travma ve yaralanma artan olaylar ve sinir morfolojik yapılarının değerlendirilmesi daha iyi bir yolu ihtiyaçlarını nedeniyle, bu yöntem, sinir hasarı ve rejenerasyon histolojik veri elde etmek için gerekli bir araç gibi uygulanmak üzere devam edebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar hiçbir çıkar çatışması var bildirin.
Acknowledgments
Yazarlar naklinden Jenkins mikroskobu tesisinde Wyoming Üniversitesi için onların yardım ve üyeleri Bushmen lab, Kelly Roballo, Hayden doğru Wupu Osimanjiang ve harun Dhunghana, hayvan bakımı yardım için istiyorum. Bu yayın bir Kurumsal Geliştirme Ödülü (fikir) üzerinden ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Grant # 2P20GM103432 altında mümkün yapıldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline | Gibco | 14200-075 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Acros Organics | 205950010 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-013-25 | |
| Epoxy Embedding Medium Kit | Sigma-Aldrich | 45359 | |
| Sodium Hydroxide Solution | Sigma-Aldrich | 72068 | To adjust Trump's fixative pH |
| Acetone | Fisher Chemical | 170942 | |
| Osmium Tetroxide Solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| VWR Micro Slides, Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545102 | |
| Pelco Embedding Cast | Fisher Scientific | NC9671811 | |
| Glass Knife Maker | RMC Products | GKM-2 | |
| Ultramicrotome | RMC Products | MT-XL | |
| 15 mL Conical Tube | Falcon | ISO 9001 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 4 mL Glass Vial | Sigma-Aldrich | 854190 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | For trimming resin block |
| Perfect Loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | For picking up thin resin sections |
| Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 100 Watt Oven | Millipore | 6350115 | |
| Whatman Filter Paper | Sigma-Aldrich | WHA10010155 | |
| 3 mL plastic pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | |
| Micro-surgical Kit | World precision instruments | ||
| Olympus fluorescence microscope | Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80 |
References
- Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us. Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).
- Grinsell, D., Keating, C. P. Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).
- Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair. Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).
- Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation. Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques. International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach. Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).
- Sridharan, G., Shankar, A. A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).
- Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. Toluidine blue and Lugol's iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy. Journal of Oral Pathology & Medicine. 21, 160-163 (1992).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).
- Dykstra, M. J. A manual of applied techniques for biological electron microscopy. , Plenum. New York. 257 (1993).
- Vleggeert-Lankamp, C. L. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review. Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).
- Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve. Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).
- Castro, J., Negredo, P., Avendaño, C. Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode. Brain research. , 65-77 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques. International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).
- Bozkurt, A., Lassner, F., O'Dey, D., Deumens, R., Böcker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves. Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).
- Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists. Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).
- Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration. Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).
- Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve. Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).
- Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections. Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).
- Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: A literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).
- Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety. Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).
- Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).
