Summary
I denne protokol beskriver vi en mikropipette metode til direkte anvendelse en kontrolleret kraft til kernen i en levende celle. Denne analyse giver forhør af nukleare mekaniske egenskaber i den levende, vedhængende celle.
Abstract
De mekaniske egenskaber af kernen bestemme sit svar til mekaniske kræfter genereret i celler. Fordi kernen er molekylært løbende med cytoskeleton, metoder er nødvendige for at sonde dens mekaniske opførsel i vedhængende celler. Her diskuterer vi direkte kraft sonde (DFP) som et værktøj til at anvende gældende direkte til kernen i en levende vedhængende celle. Vi tillægger den nukleare overflade med suge en smal mikropipette. Mikropipette er oversat fra kernen, som forårsager kernen til at deformere og oversætte. Når den genoprette kraft er lig med den suge kraft, kernen løsner og slapper elastisk. Fordi den sugetryk er netop kendt, kendt kraft på den nukleare overflade. Denne metode har afsløret at nanoskala styrker er tilstrækkelige til at deformere og oversætte kernen i vedhængende celler, og identificeret cytoskeletal elementer, der gør det muligt nucleus at modstå styrker. DFP kan bruges til at dissekere bidrag af cellulære og nukleare komponenter til nukleare mekaniske egenskaber i levende celler.
Introduction
Patologier såsom kræft indebærer ændringer af nukleare form og struktur1,2, der generelt er ledsaget af en 'opblødning' af kernen3,4. Nukleare resistens over for mekanisk deformation har været generelt karakteriseret ved at anvende en kraft på isolerede kerner5.
Kernen i celler er molekylært tilsluttet cytoskelettet Linker af Nucleoskeleton og Cytoskeleton (Anna) komplekse6,7,8,9. Som et resultat, er kernen mekanisk integreret med cytoskelettet og gennem celle-undergrundens sammenvoksninger, den ekstracellulære matrix. Mekanisk sondering kerne indeni vedhængende celler kan give indsigt i denne mekaniske integration. Metoder til at manipulere kerner i levende celler omfatter mikropipette aspiration10,11, og atomic force mikroskopi12,13,14. Vi beskrev for nylig en direkte kraft sonde (DFP) der gælder mekaniske kræfter direkte på kernen i en levende vedhængende celle15.
Her, skitsere vi proceduren for at bruge en mikroinjektion system, der er almindeligt tilgængelige i mikroskopi faciliteter til at anvende en kendt, nano-skala mekanisk kraft direkte til kernen i en vedhængende celle. En femtotip (0,5 µm diameter mikropipette tip) er monteret og tilsluttet ordningen mikroinjektion af et rør. Tip, placeret i en 45° vinkel i forhold til overfladen af kultur parabol, sænkes indtil støder op til den nukleare overflade. Røret er så frakoblet og åbnet i atmosfæren, som skaber en negativ sugetryk på den nukleare overflade og sæler mikropipette spidsen mod den nukleare overflade. Gennem oversættelse af mikropipette tip, er kernen deforme og til sidst (afhængigt af omfanget af kraft), løsrevet fra mikropipette. Denne udstationering opstår, når de genoprette (modstå) styrker, udøvet af kernen og celle, lig den suge kraft, som mikropipette. Analyse kan udføres ved at måle forskydningen af atomkernen, længde stamme (ligning 1) eller område stamme (figur 1A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberede celler til billedbehandling
Bemærk: Direkte kraft sonde (DFP) kan bruges til enhver vedhængende celletype. Her, bruges NIH 3T3 mus fibroblaster som cellelinie model for denne protokol.
- Kultur NIH 3T3 fibroblastceller i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% donor bovint serum og 1% Penicillin-Streptomycin på 35-mm glas bund fad indtil ønskede confluency. Vedligeholde celler ved 37 ° C og 5% CO2.
- Vær sikker på at belægge alle 35-mm glas bund retter med 5 µg/mL fibronektin (eller lignende ECM proteiner), før såning NIH 3T3 celler til billedbehandling.
Bemærk: Cellerne skal fuldt spredt og vedhængende på parabol for eksperimentet. Der er ikke nogen begrænsninger med hensyn til confluency for DFP metode til at arbejde.
- Vær sikker på at belægge alle 35-mm glas bund retter med 5 µg/mL fibronektin (eller lignende ECM proteiner), før såning NIH 3T3 celler til billedbehandling.
- Umiddelbart før forsøget, cellerne vaskes to gange med PBS efterfulgt af en enkelt vask med komplet vækstmediet.
- Tilføj 3 mL af komplet vækstmediet til bunden glasskål.
2. mikroskopi og Image erhvervelse
Bemærk: En inverteret fluorescens mikroskop (eller tilsvarende) med micromanipulator installeret side-arm efter fabrikantens anvisninger. Mikroskopet bør også være udstyret med en miljømæssig kammer at opretholde temperaturen ved 37 ° C og CO2 niveau på 5%. Der kræves også en micromanipulator og microinjector knyttet til mikroskop. En olie fordybelse 40 x / 1.3 NA eller 60 x / 1,49 NA (eller tilsvarende mål) anbefales til eksperimenter. Mikroskopet bør være monteret på en vibration isolation tabel.
Figur 1 . Nukleare Deformation og mikroskop med fokus
A. maksimum nukleare deformation og lempelse af nukleare deformation. Før beregning af maksimale nukleare deformation, var tilbage kanterne af de nukleare figurer først faldt sammen for at korrigere for oversættelsen af deformerede kerne. Form af kernen i øjeblikket af mikropipette tip udstationering blev overlejret på de indledende nukleare figur inden du trækker. Forskellen i området mellem de to figurer blev målt som Δen1. Den maksimale nukleare deformation blev defineret som ΔA1 divideret med det oprindelige nukleare område. Tilsvarende, en anden parameter, ΔA2, kan defineres ved at lægge den endelige steady state nukleare figur efter mikropipette udstationering på den oprindelige nukleare figur. B. fokusere celle på plan A og derefter flytte brændplanet op til plan B at finde mikropipette tip. Under imaging, blev mikropipette oversat til højre (retning af orange pil). Dette tal er blevet ændret fra Neelam mfl. 15. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Drej på microinjector pr. producentens protokol.
- Med en nedsænkning olie dropper, anvende en dråbe immersionsolie oven på objektive linse.
- Klemme fadet stramt ind i fadet indehaveren og indlæse fadet indehaveren på scenen.
Bemærk: Cellerne skal opbevares ved 37 ° C og 5% CO2 hele eksperimentet. - Justere højden på det mål at bringe cellerne i fokus (plan A, figur 1B).
- Flytte stadiet mikroskop til at finde en celle af interesse.
- Rotere joystick på micromanipulator at flytte indehaveren med pipette overfoeres til den øverste position. Indlæse 0,5 µm diameter tip mikropipette afpipetteres holderen til.
- For at undgå celle vedhæftning til mikropipette, pre behandle mikropipette tip med 0,3 mg/mL PLL-g-PIND løsning i 1 time ved stuetemperatur. Test for vedhæftning af rørende mikropipette til kernen uden nogen sugetryk, og derefter oversætte mikropipette fra kernen. Manglen vedhæftning kan skimtes fra en komplet mangel på nukleare deformation og oversættelse.
Bemærk: Følg fremstilling forslag at åbne pakken.
- For at undgå celle vedhæftning til mikropipette, pre behandle mikropipette tip med 0,3 mg/mL PLL-g-PIND løsning i 1 time ved stuetemperatur. Test for vedhæftning af rørende mikropipette til kernen uden nogen sugetryk, og derefter oversætte mikropipette fra kernen. Manglen vedhæftning kan skimtes fra en komplet mangel på nukleare deformation og oversættelse.
- Øge det objektive brændplanet ovenfor plan A og toppen af cellen til plan B ved at justere kontrolelementet fine (figur 1B, se trin 2.4).
- Angive micromanipulator til grov kontrol. Langsomt bringe mikropipette ned til plan B ved at se for silhuet af mikropipette, indtil mikropipette kommer fuldt fokus.
- Når mikropipette tip er i fokus, skal du angive micromanipulator til Fine kontrol.
- Lavere mål den ækvatoriale symmetriplan i cellen (plan A, figur 1B) og lavere mikropipette til omkring 15 µm over plan A (figur 1B, stiplet mikropipette).
- Angive kompensation pres (Pc) på microinjector til ønskede tryk; Vent nogle sekunder, presset for at stabilisere.
Bemærk: Optimale pres sæt punkt afhænger både celletype og de specifikke mål for eksperimentet. I de fleste tilfælde, ville 300 hPa være et godt udgangspunkt. - Sikre at mikropipette ikke er tilstoppet ved hjælp af indstillingen Clean på panelet micromanipulator og kontrol for at sikre luftbobler opstå fra mikropipette tip.
- Indsæt spidsen ind i cellen ved gradvis sænkning af mikropipette indtil spidsen er let rører den nukleare overflade.
Bemærk: Når sænke mikropipette, silhuet af mikropipette tip vil blive klart, som det kommer i fokus. Før mikropipette rører kernen, øge den objektive fokus og tilpasse mikropipette tip med kernen (samme x-y-koordinat, højere z-plan). Vende fokus tilbage til det ækvatoriale flyet af kernen (plan A, figur 1B) og gradvist lavere mikropipette tip. - Oprette en forsegling mellem mikropipette tip og Kernemembranen ved at afbryde pres-forsyning rør fra mikroinjektion system, dermed åbning i slutningen af mikropipette tube til atmosfæren. Dette trin opretter et undertryk lig med Pc på den nukleare overflade.
- Erhverve billeder med mikroskoper billede collection software. Oprette en avi-erhvervelse (video) eller nd-erhvervelse (billeder) i billede collection software.
Bemærk: For enhver tænkelig erhverve software, konfigurere real-time video imaging eller time-lapse billede erhvervelser med et kort tidsinterval. - Skifte til den tilsvarende fluorescerende imaging kanal (dvs. normal god landbrugspraksis, RFP, etc.) og begynde billeddannelse.
- Oversætte mikropipette tip fra kroppen af celle (til højre, figur 1B) indtil kernen frigøres fra mikropipette.
Bemærk: Træk tip langs den positive x-retning (til højre i synsfelt). Den trække sats kan programmeres og styres af computeren eller joysticket kan flyttes manuelt. Vi har ikke fundet nogen sammenhæng mellem den trække sats og nukleare deformation15 tyder på et primært elastisk svar at tvinge.
3. dataanalyse
- Udføre billedanalyse med nogen grundlæggende billedbehandling software til rådighed. Omfanget af nukleare deformation kan kvantificeres ved enten længde stamme (Ɛ) eller område stamme (figur 1A). Kvantificere længde stamme ved hjælp af ligningen 1, hvor L og L0 repræsenterer længder af kernen ved maksimal deformation og udgangsposition, henholdsvis.
(Ligning 1)
(Ligning 1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2A viser tvinger af en NIH 3T3 mus fibroblast kerne. Som mikropipette tip er oversat til højre, kernen deformerer og til sidst løsner fra mikropipette tip. Længde stamme af kernen er set at øge med stigende suge kraft (figur 2B). Den forreste kant af kernen (mikropipette trække kanten) danner en nuklear fremspring og bagkanten er fordrevet fra sin oprindelige position. Længden af fremspring er meget større end bagkanten deplacement (figur 2 c), hvilket tyder på en tæt integration mellem kernen og de omkringliggende cytoplasma. Tidsskalaer er forkortelse for afslapning af den nukleare forreste kant (< 1 s), og den nukleare bagkant (< 2 s) (figur 2D).
Figur 2 . Karakterisering af den nukleare Deformation
Deformation og fordrivelse af kernen i en levende, vedhængende celle af DFP. En NIH 3T3 fibroblast kerne blev trukket med 6 nN kraft. Billederne viser figuren nukleare på det angivne tidspunkt. Skalalinjen: 5 µm B. nukleare deformation var kvantificeres ved længde stamme. Den nukleare deformation steg med anvendt styrker. Fejllinjer angive standard fejl af middelværdien (SEM); n > 6. C. deplacement på forkant er større end forskydningen på bagkanten. D. den længde stamme afslapning er meget hurtigere end bagkant afslapning. P < 0,05; fejllinjer angive SEM; n = 10. Dette tal er blevet ændret fra Neelam mfl. 15. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Vi har brugt DFP metode til at bestemme, hvordan cytoskeletal styrker bidrage til nukleare modstand mod deformation i cellen. Mens der fandtes ingen væsentlige forskelle i nukleare deformation eller oversættelse efter F-actin (ved cytochalasin-D) eller mikrotubulus forstyrrelser (af nocodazole), resulterede at reducere vimentin udtryk gennem siRNA-baserede knockdown i betydeligt større nukleare oversættelse og deformation (figur 3). Dette tyder på, at vimentin mellemliggende filamenter i fibroblaster er cytoskeletal hovedelementet at hjælpe kernen modstå lokale kraft.
Figur 3 . Fluorescerende billeder af den nukleare Deformation
DFP blev brugt til at bestemme bidrag af cytoskeletal styrker til nukleare deformation. Kernen var plettet med SYTO 59 farvestof. Fluorescerende billeder viser overlejring af kernen før (rød, pseudo-farve) og efter (grøn, pseudo-farve) på den angivne betingelse. CTRL, kontrol celler; CYTO-D, celler behandles med cytochalasin-D; NOC, celler behandles med nocodazole; SKRID, celler transfekteret med røræg siRNA; Vim siRNA, celler transfekteret med siRNA målretning vimentin. Dette tal er blevet ændret fra Neelam mfl. 15. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Måling den mekaniske integration af kernen med cytoskelettet er en udfordring for de fleste nuværende metoder, såsom mikropipette aspiration16, fordi de kræver enten isolerede kerner (hvor kernen er afkoblet fra cytoskelettet) eller kerner i suspenderede celler (hvor ekstracellulære kræfter, som trækkraft styrker, er fraværende). Kraft er blevet anvendt til kernen ved at anvende biaksiale stamme celler tilhænger at en membran17,18; dog, denne teknik er begrænset af, at kraften på kernen er ukendt. Atomic force mikroskopi (AFM) sonder har været brugt til at indrykke kernen i intakt celler; disse tilbud den fordel, at de afslører de mekaniske egenskaber af kernen mens det er integreret med cytoskeleton. Hvis du vil tilføje til eksisterende i vivo teknikker til kendetegner kerne12,13,14, har vi udviklet en enkel og robust metode til mekanisk sonde kernen i en levende vedhængende celle, mens det stadig er integreret at de omkringliggende cytoskelet. Et centralt element i denne teknik er at styrke på kernen netop er kendt og kontrolleret.
Ved at anvende DFP, anslår vi, at nano-newton skala styrker er tilstrækkelige til at deformere og oversætte kernen i levende, vedhængende celler. Derudover gennem systematiske undersøgelser af bidrag fra forskellige cytoskeletal elementer, har vi fundet, at vimentin-baseret mellemliggende filamenter er den primære del af cellulære cytoskelettet ansvarlig for stiv kernen i cellen 15.
Nogle forbehold gælder med disse eksperimenter. Det er vigtigt regelmæssigt at kontrollere mikropipette tip til tilstopning eller brud under eksperimenter, som begge tilstopning af mikropipette eller fraktur af spidsen ville medføre ukendt ændringer sugetryk anvendt på cellen. For at kontrollere, hvis mikropipette er tilstoppet, skal du bruge indstillingen Clean på manipulatoren at lægge maksimalt pres og tjekke for luftbobler emerging fra mikropipette tip. Hvis mikropipette tip er brudt eller brækkede, erstatte mikropipette før du begynder den næste eksperiment. Det er også vigtigt at bekræfte, at den nukleare stamme varierer med kraft, og er nul på nul kraft (Se Neelam et al. 15). Hvis dette ikke observeres i eksperimenter, så er det muligt, at ikke-specifikke vedhæftning mellem mikropipette tip og den nukleare overflade (trods behandling med PLL-PIND) kan være ansvarlige for nukleare deformation. En anden begrænsning af teknik er, at indsættelsen af mikropipette ind i cellen, selv kan forårsage nogle lokale forstyrrelser af cytoskeletal strukturer.
Det er nyttigt at teste for korrelationer mellem omfanget af nukleare deformation/oversættelse og belastningsgraden. En mangel på sammenhæng ville indebære en primært elastisk modstand. Dette er, hvad vi har fundet til at være tilfældet for fibroblast kerner15. Mens kraften på kernen er kendt, tillader metoden ikke beregning af parametre som de unge modulus. Vi har primært brugte det til at dissekere bidrag af cellulære strukturer til modstand mod nukleare deformation og oversættelse i cellen. Mens vi har rapporteret todimensionale nukleare figurer15,19, kan det være nyttigt at kvantificere kernen under kraft fuld tredimensionel form.
Sugetryk i mikropipette er kendt, men det er større end den faktiske tryk, nukleare overflade due til at flyde vand gennem porerne10. Vi har dog vist, at resistens over for flow gennem de nukleare porer er meget større gennem mikropipette (jf. supplerende oplysninger til beregninger i Neelam et al. 15) for rimelig membran permeabiliteter og mikropipette dimensioner. Pres på den ydre membran overflade bør derfor lig med sugetryk trods eksistensen af flow.
Afslutningsvis tillader DFP bruger hen til kvantificere den mekaniske svar af den integrerede kerne-cytoskeleton i en vedhængende celle til en kendt og kontrolleret kraft. Denne metode kan bruges til at dissekere bidrag af molekylære komponenter i kernen og cytoplasmaet til de mekaniske opførsel af kernen i cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH R01 EB014869.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FluoroDish | WPI | FD35 | |
| SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
| Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
| InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
| FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
| Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
| Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
| Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
| Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
| Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |
References
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
- Bank, E. M., Gruenbaum, Y. The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship. Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).
- Lammerding, J., et al. Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics. Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).
- Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures. Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).
- Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins. Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).
- Tapley, E. C., Starr, D. A. Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).
- Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
- Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency. Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).
- Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope. Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).
- Pagliara, S., et al. Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency. Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).
- Liu, H., et al. In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy. ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).
- Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy. Physical Biology. 10 (6), 065002 (2013).
- Neelam, S., et al. Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).
- Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
- Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation. Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).
- Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells. Methods. 94, 27-32 (2016).
