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Biochemistry

नाभिक और Cytoskeleton के बीच यांत्रिक एकीकरण को मापने के लिए एक सीधा बल जांच

Published: July 29, 2018 doi: 10.3791/58038
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical Engineering, University of Florida

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम एक micropipette विधि का वर्णन करने के लिए सीधे एक जीवित कोशिका में नाभिक को नियंत्रित बल लागू होते हैं । यह परख परमाणु यांत्रिक गुणों के रहने वाले, अनुयाई सेल में पूछताछ की अनुमति देता है ।

Abstract

नाभिक के यांत्रिक गुणों कोशिकाओं में उत्पन्न यांत्रिक बलों के लिए अपनी प्रतिक्रिया का निर्धारण । क्योंकि नाभिक cytoskeleton के साथ आणविक निरंतर है, विधियों अनुयाई कोशिकाओं में अपने यांत्रिक व्यवहार की जांच करने के लिए आवश्यक हैं । यहां, हम एक उपकरण के रूप में प्रत्यक्ष बल जांच (DFP) पर चर्चा के लिए एक जीवित अनुयाई सेल में सीधे नाभिक को लागू करने के लिए बल । हम सक्शन के साथ परमाणु सतह के लिए एक संकीर्ण micropipette देते हैं । micropipette नाभिक से दूर अनुवाद किया है, जो ख़राब और अनुवाद करने के लिए नाभिक का कारण बनता है । जब बहाल करने के बल चूषण बल के बराबर है, नाभिक अलग और लोचदार आराम । क्योंकि सक्शन दबाव ठीक जाना जाता है, परमाणु सतह पर बल जाना जाता है । इस विधि से पता चला है कि नैनो पैमाने पर बलों ख़राब और अनुयाई कोशिकाओं में नाभिक का अनुवाद करने के लिए पर्याप्त हैं, और cytoskeletal तत्वों है कि नाभिक को ताकतों का विरोध करने के लिए सक्षम की पहचान की । DFP कोशिकाओं में परमाणु यांत्रिक गुणों के लिए सेलुलर और परमाणु घटकों के योगदान को काटना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

इस तरह के कैंसर के रूप में विकृतियों परमाणु आकार और1,2, जो आम तौर पर एक ' नाभिक3,4के ' नरम के साथ कर रहे है संरचना के लिए परिवर्तन शामिल है । यांत्रिक विकृति के लिए परमाणु प्रतिरोध आम तौर पर अलग नाभिक5के लिए एक बल लागू करने के द्वारा विशेषता है ।

कोशिकाओं में नाभिक आणविक रूप से Nucleoskeleton और cytoskeleton (LINC) जटिल6,7,8,9के लिंकर द्वारा cytoskeleton से जुड़ा है । एक परिणाम के रूप में, नाभिक यांत्रिक cytoskeleton के साथ एकीकृत है और, सेल के माध्यम से-बुनियाद आसंजन, extracellular मैट्रिक्स । यांत्रिक अनुयाई कोशिकाओं के अंदर नाभिक की जांच इस यांत्रिक एकीकरण में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । तरीकों नाभिक में हेरफेर करने के लिए जीवित कोशिकाओं micropipette आकांक्षा10,11, और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी12,13,14शामिल हैं । हम हाल ही में एक सीधा बल जांच (DFP) है कि एक जीवित अनुयाई सेल15में नाभिक पर सीधे यांत्रिक बलों लागू होता है वर्णित है ।

यहां, हम एक microinjection प्रणाली है कि सामांयतः एक अनुयाई सेल में नाभिक को एक ज्ञात, नैनो पैमाने पर यांत्रिक शक्ति लागू करने के लिए सूक्ष्म सुविधाओं में उपलब्ध है का उपयोग करने के लिए प्रक्रिया रूपरेखा । एक femtotip (०.५ µm व्यास micropipette टिप) घुड़सवार और एक ट्यूब द्वारा microinjection प्रणाली से जुड़ा है । टिप, एक ४५ ° संस्कृति पकवान की सतह के सापेक्ष कोण पर तैनात, परमाणु सतह से सटे तक कम है । ट्यूब तो काट दिया और वातावरण के लिए खोला है, जो परमाणु सतह पर एक नकारात्मक चूषण दबाव बनाता है और परमाणु सतह के खिलाफ micropipette टिप जवानों । micropipette टिप के अनुवाद के माध्यम से, नाभिक विकृत और अंततः है (लागू बल की भयावहता पर निर्भर करता है), micropipette से अलग । इस टुकड़ी तब होती है जब बहाल (विरोध) बलों, नाभिक और कोशिका द्वारा लागू, चूषण micropipette द्वारा आवेदन बल बराबर । विश्लेषण नाभिक के विस्थापन, लंबाई तनाव (समीकरण 1), या क्षेत्र तनाव (आंकड़ा 1a) को मापने के द्वारा किया जा सकता है ।

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Protocol

1. इमेजिंग के लिए कोशिकाओं की तैयारी

नोट: प्रत्यक्ष बल जांच (DFP) किसी भी अनुयाई कक्ष प्रकार के लिए उपयोग किया जा सकता है । यहां, NIH 3T3 माउस fibroblasts इस प्रोटोकॉल के लिए मॉडल सेल लाइन के रूप में उपयोग किया जाता है ।

  1. संस्कृति NIH 3T3 fibroblast कोशिकाओं में Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) 10% दाता गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन-Streptomycin एक ३५ मिमी ग्लास नीचे पकवान पर वांछित प्रवाह तक के साथ पूरक । ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर कोशिकाओं को बनाए रखने ।
    1. हो कोट करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी ३५ मिमी ग्लास नीचे व्यंजन 5 µ g/fibronectin के एमएल (या इसी तरह ECM प्रोटीन) के साथ, इमेजिंग के लिए NIH 3T3 कोशिकाओं बोने से पहले ।
      नोट: कोशिकाओं को पूरी तरह से फैल और प्रयोग के लिए पकवान पर अनुयाई होना चाहिए । वहां DFP विधि के लिए काम करने के लिए प्रवाह के मामले में कोई कमी नहीं हैं ।
  2. तुरंत प्रयोग करने से पहले, पूरा विकास माध्यम के साथ एक ही धोने के बाद पंजाबियों के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें ।
  3. गिलास नीचे पकवान के लिए पूर्ण विकास मध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ें ।

2. माइक्रोस्कोपी और छवि अधिग्रहण

नोट: एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (या समकक्ष) micromanipulator के साथ पक्ष बांह के लिए स्थापित, निर्माता की सिफारिशों के अनुसार. माइक्रोस्कोप भी एक पर्यावरण चैंबर के साथ लगाया जाना चाहिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर तापमान बनाए रखने के लिए, और सह2 स्तर पर 5%. माइक्रोस्कोप से जुड़ी एक micromanipulator और microinjector भी जरूरी है । एक तेल विसर्जन 40x/1.3 na या 60x/1.49 na (या समतुल्य उद्देश्य) प्रयोगों के लिए अनुशंसित हैं । माइक्रोस्कोप एक कंपन अलगाव की मेज पर रखा जाना चाहिए ।

Figure 1
चित्रा 1 . परमाणु विकृति और ध्यान केंद्रित माइक्रोस्कोप
A. अधिकतम परमाणु विकृति और परमाणु विकृति की छूट । अधिकतम परमाणु विकृति की गणना करने से पहले, परमाणु आकृतियों के पीछे के किनारों को विकृत नाभिक के अनुवाद के लिए सही करने के लिए पहले से मेल किया गया था । micropipette टिप टुकड़ी के क्षण में नाभिक के आकार खींचने से पहले प्रारंभिक परमाणु आकार पर मढ़ा गया था । दो आकृतियों के बीच के क्षेत्र में अंतर को1Δ के रूप में मापा गया था । अधिकतम परमाणु विरूपण के रूप में परिभाषित किया गया था Δएकमूल परमाणु क्षेत्र से विभाजित1 । इसी तरह, एक दूसरे पैरामीटर, Δएक2, मूल परमाणु आकार पर micropipette टुकड़ी के बाद अंतिम स्थिर राज्य परमाणु आकार ओवरले द्वारा परिभाषित किया जा सकता है । b. विमान एक पर सेल ध्यान केंद्रित करने और फिर micropipette टिप खोजने के लिए विमान बी के लिए फोकल विमान ऊपर ले जाएँ. इमेजिंग के दौरान, micropipette सही (नारंगी तीर की दिशा) में अनुवाद किया गया था । नीलम एट अलसे यह आंकड़ा संशोधित किया गया है । 15. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

  1. निर्माता के प्रोटोकॉल के प्रति microinjector चालू करें ।
  2. एक विसर्जन तेल ड्रॉपर का उपयोग करना, उद्देश्य लेंस के शीर्ष पर विसर्जन तेल की एक बूंद लागू होते हैं ।
  3. डिश धारक में कसकर पकवान दबाना और मंच पर पकवान धारक लोड ।
    नोट: कोशिकाओं ३७ ° c और 5% सह प्रयोग में2 % पर बनाए रखा जाना चाहिए ।
  4. लक्ष्य की ऊंचाई समायोजित (विमान एक, आंकड़ा 1b) ध्यान में कोशिकाओं को लाने के लिए ।
  5. ब्याज की एक सेल खोजने के लिए माइक्रोस्कोप मंच हटो ।
  6. प्लास्टिक धारक को शीर्ष स्थान पर ले जाने के लिए micromanipulator पर जॉयस्टिक घुमाएं । प्लास्टिक धारक पर ०.५ µm व्यास टिप micropipette लोड ।
    1. micropipette के लिए सेल आसंजन से बचने के लिए, पूर्व उपचार के साथ micropipette टिप ०.३ मिलीग्राम/एमएल पीएलएल-जी-खूंटी समाधान के लिए 1 ज कमरे के तापमान पर । किसी भी चूषण दबाव के बिना नाभिक के लिए micropipette को छूने से आसंजन के लिए परीक्षण, और फिर micropipette नाभिक से दूर अनुवाद । आसंजन के अभाव परमाणु विरूपण और अनुवाद की एक पूरी कमी से विचार किया जा सकता है ।
      नोट: कृपया पैकेज को खोलने के लिए निर्माण सुझावों का पालन करें ।
  7. विमान के ऊपर उद्देश्य फोकल विमान एक और ठीक नियंत्रण (आंकड़ा 1b, २.४ कदम देखें) का समायोजन करके विमान बी के लिए सेल के ऊपर उठाएं ।
  8. micromanipulator को मोटे नियंत्रण पर सेट करें । धीरे micropipette micropipette के सिल्हूट के लिए देख कर विमान बी के लिए नीचे लाने के लिए, जब तक micropipette ध्यान में पूरी तरह से आता है ।
  9. एक बार micropipette टिप ध्यान में है, ठीक नियंत्रण के लिए micromanipulator सेट ।
  10. सेल के इक्वेटोरियल विमान (विमान एक, आंकड़ा 1b) के उद्देश्य को कम और लगभग 15 µm विमान के ऊपर एक (आंकड़ा 1b, micropipette धराशायी) के लिए micropipette कम ।
  11. वांछित दाब को microinjector पर क्षतिपूर्ति दाब (पीसी) सेट करना; दबाव को स्थिर करने के लिए कई सेकंड रुको ।
    नोट: इष्टतम दबाव सेट बिंदु दोनों सेल प्रकार और प्रयोग के विशिष्ट लक्ष्यों पर निर्भर करता है । ज्यादातर मामलों के लिए, ३०० hPa एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु होगा ।
  12. सुनिश्चित करें कि micropipette micromanipulator पैनल पर साफ सेटिंग का उपयोग कर और यकीन है कि हवा बुलबुले micropipette टिप से उभरने बनाने के लिए जाँच से भरा नहीं है ।
  13. टिप को हल्के से नाभिकीय सतह को छू जाने तक micropipette को धीरे से कम करके कक्ष में युक्ति डालें ।
    नोट: जब micropipette कम, micropipette टिप के सिल्हूट स्पष्ट हो जाएगा के रूप में यह ध्यान में आता है । micropipette से पहले नाभिक को छूता है, उद्देश्य ध्यान बढ़ाने और नाभिक के साथ micropipette टिप संरेखित (वही x-y समंवय, उच्च z-विमान) । (विमान एक, आंकड़ा 1b) नाभिक के इक्वेटोरियल विमान के लिए वापस फोकस वापसी और धीरे-micropipette टिप कम ।
  14. microinjection प्रणाली से दबाव-आपूर्ति ट्यूब को तोड कर micropipette टिप और नाभिकीय झिल्ली के बीच एक सील बनाएं, जिससे वायुमंडल में micropipette ट्यूब का अंत खुल जाए । यह कदम परमाणु सतह पर पीसी के बराबर नकारात्मक दबाव पैदा करता है ।
  15. सूक्ष्मदर्शी छवि संग्रह सॉफ्टवेयर के साथ छवियों का अधिग्रहण । छवि संग्रह सॉफ़्टवेयर में एक avi-प्राप्ति (वीडियो) या nd-प्राप्ति (छवियां) सेट करें ।
    नोट: किसी भी इमेजिंग सॉफ्टवेयर प्राप्त करने के लिए, एक कम समय अंतराल के साथ वास्तविक समय वीडियो इमेजिंग या समय चूक छवि अधिग्रहण की स्थापना की ।
  16. इसी फ्लोरोसेंट इमेजिंग चैनल को टॉगल (यानी, GFP, आरएफपी, आदि) और इमेजिंग शुरू करते हैं ।
  17. micropipette टिप सेल के शरीर से दूर अनुवाद (सही करने के लिए, आंकड़ा 1b) जब तक नाभिक micropipette से अलग करता है ।
    नोट: सकारात्मक एक्स दिशा के साथ टिप खींचो (देखने के क्षेत्र में सही करने के लिए) । पुलिंग दर क्रमादेशित किया जा सकता है और कंप्यूटर या जॉयस्टिक द्वारा नियंत्रित मैंयुअल रूप से ले जाया जा सकता है । हम खींच दर और परमाणु विकृति15 के बीच कोई संबंध नहीं मिला है के लिए एक मुख्य रूप से लोचदार प्रतिक्रिया बल सुझाव ।

3. डेटा विश्लेषण

  1. किसी भी मूल छवि प्रसंस्करण उपलब्ध सॉफ्टवेयर के साथ छवि विश्लेषण करते हैं । परमाणु विकृति की हद तक या तो लंबाई तनाव (Ɛ) या क्षेत्र तनाव (आंकड़ा 1a) द्वारा quantified जा सकता है । लंबाई 1 समीकरण का उपयोग कर, जहां एल और एल0 अधिकतम विकृति और प्रारंभिक स्थिति में नाभिक की लंबाई, क्रमशः प्रतिनिधित्व करता है ।
    Equation 1(समीकरण 1)

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Representative Results

चित्रा 2a एक NIH 3T3 माउस fibroblast नाभिक के बल से पता चलता है । के रूप में micropipette टिप सही करने के लिए अनुवाद किया है, नाभिक विकृतियों और अंततः micropipette टिप से अलग । नाभिक की लंबाई तनाव बढ़ती चूषण बल (चित्रा बी) के साथ वृद्धि करने के लिए देखा जाता है । नाभिक के सामने बढ़त (micropipette खींच बढ़त) एक परमाणु दखलंदाजी रूपों और पीछे बढ़त अपनी मूल स्थिति से विस्थापित है । दखलंदाजी की लंबाई ज्यादा है ट्रेलिंग एज विस्थापन (चित्रा 2c), नाभिक और आसपास के कोशिका द्रव्य के बीच एक तंग एकीकरण का सुझाव से अधिक है । समय तराजू परमाणु मोर्चा बढ़त की छूट के लिए कम कर रहे है (< 1 s), और परमाणु बैक एज (< 2 s) (चित्रा 2d) ।

Figure 2
चित्रा 2 . परमाणु विरूपण के लक्षण वर्णन
विकृति और एक जीवित में नाभिक के विस्थापन, DFP द्वारा अनुयाई सेल । एक NIH 3T3 fibroblast नाभिक 6 एनएन बल के साथ खींचा गया था । चित्र संकेत समय पर परमाणु आकार दिखा । स्केल बार: 5 µm B. नाभिकीय विकृति लंबाई तनाव से quantified थी । परमाणु विरूपण लागू बलों के साथ वृद्धि हुई है । त्रुटि पट्टियां माध्य (SEM) के मानक त्रुटि इंगित करती हैं; n > 6. C. अग्रणी बढ़त पर विस्थापन के पीछे बढ़त पर विस्थापन से बड़ा है । D. लंबाई तनाव छूट बहुत तेजी से वापस बढ़त छूट की तुलना में है । *P < ०.०५; त्रुटि पट्टियों का संकेत SEM; n = 10. नीलम एट अलसे यह आंकड़ा संशोधित किया गया है । 15. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

हम DFP विधि का इस्तेमाल किया है कि कैसे cytoskeletal बलों को कोशिका में विकृति के लिए परमाणु प्रतिरोध के लिए योगदान निर्धारित करते हैं । जबकि परमाणु विरूपण या अनुवाद में कोई महत्वपूर्ण अंतर पाया गया एफ के बाद actin (cytochalasin द्वारा डी) या microtubule व्यवधान (nocodazole द्वारा), vimentin के माध्यम से सिरना अभिव्यक्ति को कम करने आधारित पछाड़ना के परिणामस्वरूप काफी अधिक से अधिक नाभिकीय अनुवाद और विरूपण (चित्रा 3) । यह पता चलता है कि fibroblasts में vimentin मध्यवर्ती रेशा मुख्य cytoskeletal तत्व है कि मदद नाभिक स्थानीय बल का विरोध कर रहे हैं ।

Figure 3
चित्रा 3 . परमाणु विकृति के फ्लोरोसेंट छवियां
DFP परमाणु विकृति को cytoskeletal बलों के योगदान को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । नाभिक SYTO ५९ डाई के साथ दाग था । फ्लोरोसेंट छवियां (लाल, छद्म रंग) और बाद में नाभिक के ओवरले दिखाने के बाद (हरी, छद्म रंग) संकेत शर्त पर । CTRL, नियंत्रण कक्ष; CYTO-डी, cytochalasin के साथ इलाज कोशिकाओं-d; एनओसी, कोशिकाओं nocodazole के साथ इलाज; SCRAM, कोशिकाओं तले सिरना के साथ transfected; विम सिरना, सिरना लक्ष्यीकरण vimentin के साथ transfected कोशिकाओं । नीलम एट अलसे यह आंकड़ा संशोधित किया गया है । 15. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

cytoskeleton के साथ नाभिक के यांत्रिक एकीकरण को मापने इस तरह के micropipette आकांक्षा16के रूप में सबसे मौजूदा तरीकों, के लिए एक चुनौती है, क्योंकि वे या तो पृथक नाभिक की आवश्यकता होती है (जहां नाभिक cytoskeleton से जोड़ा है) या निलंबित कोशिकाओं में नाभिक (जहां extracellular बलों, कर्षण बलों के रूप में, अनुपस्थित रहे हैं) । बल नाभिक के लिए लागू किया गया है एक झिल्ली17,18करने के लिए अनुयाई कोशिकाओं को द्विअक्षीय तनाव लागू करने; हालांकि, इस तकनीक तथ्य यह है कि नाभिक पर बल अज्ञात है द्वारा सीमित है । परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) जांच बरकरार कोशिकाओं में नाभिक को इंडेंट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है; ये लाभ है कि वे नाभिक के यांत्रिक गुणों को प्रकट करते हुए यह cytoskeleton के साथ एकीकृत है प्रदान करते हैं । निस्र्पक नाभिक के लिए vivo तकनीकों में मौजूदा जोड़ने के लिए12,13,14, हम एक सरल और मजबूत विधि के लिए एक जीवित अनुयाई सेल में नाभिकीय जांच यांत्रिक जबकि यह रहता है विकसित किया है आसपास के cytoskeleton को एकीकृत । इस तकनीक की एक प्रमुख विशेषता यह है कि नाभिक पर बल ठीक से जाना जाता है और नियंत्रित किया जाता है ।

DFP को लागू करने से, हम अनुमान है कि नैनो ंयूटन पैमाने बलों ख़राब और रहने में नाभिक का अनुवाद करने के लिए पर्याप्त हैं, अनुयाई कोशिकाओं । इसके अलावा, विभिंन cytoskeletal तत्वों के योगदान के व्यवस्थित अध्ययन के माध्यम से, हमने पाया है कि vimentin आधारित मध्यवर्ती रेशा सेलुलर cytoskeleton के प्राथमिक घटक है सेल में नाभिक stiffening के लिए जिंमेदार 15.

कुछ निरंतर इन प्रयोगों के साथ लागू होते हैं । यह नियमित रूप से प्रयोगों के दौरान कॉलेस्ट्रॉल या टूटना के लिए micropipette टिप की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है, दोनों कॉलेस्ट्रॉल के रूप में micropipette या टिप के फ्रैक्चर कोशिका पर लागू चूषण दबाव में अज्ञात परिवर्तन का कारण होगा । अगर micropipette भरा हुआ है की जांच करने के लिए, जोड़तोड़ पर साफ सेटिंग का उपयोग करने के लिए अधिकतम दबाव और हवा micropipette टिप से उभर बुलबुले के लिए जांच करें । यदि micropipette टिप भंग या खंडित है, तो अगला प्रयोग आरंभ करने से पहले micropipette को प्रतिस्थापित करें । इसके अलावा, यह पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है कि परमाणु तनाव बल के साथ बदलता है, और शूंय बल पर शूंय है (नीलम एट अल देखें । 15). यदि यह प्रयोग में नहीं मनाया जाता है, तो यह संभव है कि micropipette टिप और परमाणु सतह के बीच गैर विशिष्ट आसंजन (पीएलएल-खूंटी के साथ उपचार के बावजूद) परमाणु विकृति के लिए जिंमेदार हो सकता है । तकनीक की एक और सीमा है कि सेल में ही micropipette की प्रविष्टि cytoskeletal संरचनाओं के कुछ स्थानीय व्यवधान पैदा कर सकता है ।

यह परमाणु विरूपण की हद/अनुवाद और लदान दर के बीच सहसंबंध के लिए परीक्षण करने के लिए उपयोगी है । सहसंबंध का अभाव एक मुख्य रूप से लोचदार प्रतिरोध मतलब होगा । दरअसल, यह है कि हम क्या fibroblast नाभिक15के लिए मामला हो पाया है । जबकि नाभिक पर बल जाना जाता है, विधि युवा के मापांक तरह मापदंडों की गणना की अनुमति नहीं है । हमने इसका उपयोग मुख्य रूप से सेलुलर संरचनाओं के योगदान को काटना करने के लिए किया है ताकि कोशिका में परमाणु विकृति और अनुवाद का विरोध हो सके । जब हम दो आयामी परमाणु आकार15,19की रिपोर्ट है, यह शक्ति के तहत नाभिक के पूर्ण तीन आयामी आकार यों तो उपयोगी हो सकता है ।

micropipette में सक्शन दबाव जाना जाता है, लेकिन यह वास्तविक दबाव के माध्यम से पानी के प्रवाह के कारण परमाणु सतह के लिए लागू की तुलना में बड़ा है pores10। हालांकि, हमें पता चला है कि प्रतिरोध करने के लिए परमाणु pores के माध्यम से प्रवाह बहुत micropipette के माध्यम से बड़ा है (नीलम एट अल में गणना के लिए जानकारी का समर्थन देख । 15) उचित झिल्ली permeabilities और micropipette आयामों के लिए । इसलिए, बाहरी झिल्ली की सतह पर दबाव के प्रवाह के अस्तित्व के बावजूद चूषण दबाव के बराबर होना चाहिए ।

अंत में, DFP एक ज्ञात और नियंत्रित बल के लिए एक अनुयाई कोशिका में एकीकृत नाभिक-cytoskeleton के यांत्रिक प्रतिक्रिया यों को बढ़ाता है उपयोगकर्ता की अनुमति देता है । इस विधि के नाभिक में आणविक घटकों के योगदान काटना और कोशिका द्रव्य में नाभिक के यांत्रिक व्यवहार करने के लिए सेल के भीतर किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को NIH R01 EB014869 ने सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FluoroDish WPI FD35
SYTO 59 ThermoFisher Scientific S11341
Femtotips  Eppendorf 930000043
InjectMan NI2 Eppendorf NA discontinued, current equivalent model: InjectMan 4
FemtoJet Eppendorf NA Current model FemtoJet 4i
Plan Fluor oil immersion 40x Nikon NA
Apo TIRF oil immersion 60x Nikon NA
Donor Bovine Serum (DBS) ThermoFisher Scientific 16030074 NIH 3T3 serum
Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) Mediatech cellgro MT10013CVRF NIH 3T3 medium
Penicillin-Streptomycin  Mediatech MT30004CIRF NIH 3T3 medium supplement
Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing Nikon 77007 Immersion oil for objective lens 

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Zhang, Q., Tamashunas, A. C., Lele, T. P. A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton. J. Vis. Exp. (137), e58038, doi:10.3791/58038 (2018).

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