Summary
I detta protokoll beskriver vi en mikropipett metod för att direkt tillämpa en kontrollerad kraft till kärnan i en levande cell. Denna analys kan förhör av nuclear mekaniska egenskaper i cellen levande, vidhäftande.
Abstract
De mekaniska egenskaperna av kärnan avgör dess svar på mekaniska krafter genereras i celler. Eftersom kärnan är molekylärt kontinuerlig med cytoskelettet, behövs metoder att undersöka dess mekaniska beteende i vidhäftande celler. Här diskuterar vi direkt tvång sonden (DFP) som ett verktyg för att applicera kraft direkt till kärnan i en levande fastsittande cell. Vi lägger en smal mikropipett på nukleära ytan med sug. Mikropipett översätts från kärnan, som orsakar kärnan att deformera och översätta. När återställa styrkan är lika med sugstyrka, kärnan lossnar och slappnar elastiskt. Eftersom sugtrycket är just känd, är kraften på nukleära ytan känd. Denna metod har avslöjat att nano-skala krafter räcker för att deformera och översätta kärnan i vidhäftande celler, och identifierade cytoskeletal element som gör att kärnan att motstå krafter. DFP kan användas att dissekera bidrag av cellulära och nukleära komponenter till nuclear mekaniska egenskaper i levande celler.
Introduction
Sjukdomar såsom cancer innebära ändringar av nukleära form och struktur1,2, som vanligen åtföljs av en 'mjukgörande' av nucleus3,4. Nukleära motståndskraft mot mekanisk deformation karaktäriserats generellt genom att tillämpa en kraft på isolerade atomkärnor5.
Kärnan i celler är molekylärt ansluten till cytoskelettet av Linker av Nucleoskeleton och cytoskelettet (LINC) komplexa6,7,8,9. Som ett resultat, är kärnan mekaniskt integrerad med cytoskelettet och genom cell-underskikt sammanväxningar, extracellulärmatrix. Mekaniskt sondera kärnan inuti vidhäftande celler kan ge insikt i denna mekaniska integration. Metoder att manipulera kärnor i levande celler inkluderar mikropipett aspiration10,11, och atomic force microscopy12,13,14. Vi har nyligen beskrivit en direkt tvång sond (DFP) som gäller mekaniska krafter direkt på kärnan i en levande fastsittande cell15.
Här, beskriver vi förfarandet för ett Mikroskop system som är allmänt tillgänglig i mikroskopi faciliteter att tillämpa en känd, nano-skala mekanisk kraft direkt till kärnan i en fastsittande cell. En femtotip (0,5 µm diameter mikropipett spets) är monterade och anslutna till Mikroskop systemet av ett rör. Spetsen, placerad i en 45° vinkel i förhållande till ytan av kultur skålen, sänks tills anslutning till nukleära ytan. Röret är sedan kopplas bort och öppnade till atmosfären, vilket skapar ett sug undertryck på nukleära yta och förseglar mikropipett spetsen mot kärnkraft ytan. Genom översättning av mikropipett spetsen, är kärnan deformerade och så småningom (beroende på omfattningen av kraft tillämpas), fristående från mikropipett. Här lossnar uppstår när de återställa (motstånd) krafter, som utövas av kärnan och cell, lika sug kraften som tillförs av en mikropipett. Analys kan utföras genom att mäta förskjutningen av kärnan, den längd stammen (ekvation 1), eller området stammen (figur 1A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förbereda celler för avbildning
Obs: Sonden direkt tvång (DFP) kan användas för alla vidhäftande celltyp. Här, används NIH 3T3 mus fibroblaster som modell cell line för detta protokoll.
- Kultur NIH 3T3 fibroblast-celler i Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) kompletteras med 10% givare bovint serum och 1% Penicillin-Streptomycin på en 35 mm glas botten skålen tills önskad konfluens. Upprätthålla celler vid 37 ° C och 5% CO2.
- Var noga med att bestryka alla 35 mm glas botten rätter med 5 µg/mL Fibronektin (eller liknande ECM protein), före sådd NIH 3T3-celler för avbildning.
Obs: Cellerna måste vara helt spritt och vidhäftande på skålen för experimentet. Det finns inte några begränsningar när det gäller konfluens DFP metoden att arbeta.
- Var noga med att bestryka alla 35 mm glas botten rätter med 5 µg/mL Fibronektin (eller liknande ECM protein), före sådd NIH 3T3-celler för avbildning.
- Omedelbart före experimentet, tvätta cellerna två gånger med PBS följt av en enda tvätt med komplett odlingsmedium.
- Tillsätt 3 mL komplett odlingsmedium i skålen med glas i botten.
2. mikroskopi och bild förvärv
Obs: En inverterad fluorescens Mikroskop (eller motsvarande) med micromanipulator installerad i side arm, enligt tillverkarens rekommendationer. Mikroskopet bör också utrustas med en klimatkammare att hålla temperaturen vid 37 ° C och CO2 -nivå på 5%. Det krävs också en micromanipulator och microinjector bifogas mikroskopet. En olja nedsänkning 40 x / 1.3 NA eller 60 x / 1,49 NA (eller motsvarande mål) rekommenderas för experiment. Mikroskopet ska monteras på ett bord för isolering av vibrationer.
Figur 1 . Nukleära Deformation och Mikroskop med fokus
A. maximal nukleära deformation och uppmjukning av nukleära deformation. Innan du beräknar maximal nukleära deformation, var tillbaka kanterna på nukleära formerna först sammanföll för att korrigera för översättning av deformerade nucleus. Form av kärnan i ögonblicket då mikropipett tip avlossning var överlastad på den första nuclear formen innan du drar. Skillnaden i området mellan de två formerna var mätt som Δen1. Maximala nukleära deformation definierades som ΔA1 dividerat med det ursprungliga nukleära området. Likaså en andra parameter, ΔA2, kan definieras genom överliggande slutliga steady-state nukleära formen efter mikropipett lösgörande på nukleära ursprungsformen. B. fokus cellen på plan A och sedan flytta fokalplanet upp till plan B att hitta mikropipett spetsen. Under imaging översattes mikropipett till höger (riktningen av orange pil). Denna siffra har ändrats från Neelam et al. 15. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
- Slå på microinjector per tillverkarens protokollet.
- Använder en nedsänkning olja dropper, tillämpa en enda droppe av nedsänkning olja ovanpå objektivet.
- Klämma skålen tätt i skålen hållaren och ladda den dish hållaren på scenen.
Obs: Cellerna skall hållas vid 37 ° C och 5% CO2 hela experimentet. - Justera höjden på målet att cellerna i fokus (plan A, figur 1B).
- Flytta Mikroskop scenen för att hitta en cell av intresse.
- Rotera joysticken på micromanipulator att flytta hållaren för Pipettera till toppositionen. Fyll på 0,5 µm diameter tip mikropipett på Pipettera innehavaren.
- För att undvika celladhesion till mikropipett, förbehandla mikropipett spetsen med 0,3 mg/mL till 1 h lösning på PLL-g-PEG vid rumstemperatur. Testa för vidhäftning genom att röra mikropipett till kärnan utan någon undertryck, och sedan översätta mikropipett från kärnan. Avsaknad av vidhäftning kan urskiljas från en total avsaknad av nukleära deformation och översättning.
Obs: Följ tillverkning förslag att öppna paketet.
- För att undvika celladhesion till mikropipett, förbehandla mikropipett spetsen med 0,3 mg/mL till 1 h lösning på PLL-g-PEG vid rumstemperatur. Testa för vidhäftning genom att röra mikropipett till kärnan utan någon undertryck, och sedan översätta mikropipett från kärnan. Avsaknad av vidhäftning kan urskiljas från en total avsaknad av nukleära deformation och översättning.
- Höja objektiva fokalplanet ovan plan A och toppen av cellen till plan B genom att justera den fina kontrollen (figur 1B, se steg 2,4).
- Ange micromanipulator till grov kontroll. Långsamt föra mikropipett ner till plan B genom att titta på för silhuetten av en mikropipett, tills mikropipett kommer helt i fokus.
- När mikropipett spetsen är i fokus, ange micromanipulator till fin kontroll.
- Lägre i syfte att det ekvatoriella-hyvlar av cellen (plan A, figur 1B) och sänka mikropipett till cirka 15 µm ovanför plan A (figur 1B, streckad mikropipett).
- Ställ in kompensation trycket (Pc) på microinjector till önskat tryck; vänta några sekunder för att trycket skall stabiliseras.
Obs: Börvärdet för optimalt tryck beror på både celltyp och de specifika målen för experimentet. I de flesta fall skulle 300 hPa vara en bra utgångspunkt. - Se till att mikropipett inte är igensatta med hjälp av inställningen rena på panelen micromanipulator och kontrollerar att luftbubblor ur mikropipett spetsen.
- Sätt spetsen i cellen genom att gradvis sänka mikropipett tills spetsen är lätt rörande nukleära ytan.
Obs: När du sänker mikropipett, silhuetten av mikropipett spetsen blir klart som det kommer i fokus. Innan mikropipett berör kärnan, höja objektiva fokus och justera mikropipett toppen med nucleus (samma x-y-koordinat, högre z-plan). Tillbaka fokus till det ekvatoriella-hyvlar av kärnan (plan A, figur 1B) och gradvis sänka mikropipett spetsen. - Skapa en tätning mellan mikropipett spets och det nukleära membranet genom att koppla bort tryckluftsmatning röret från Mikroskop systemet och därigenom öppna slutet av mikropipett röret till atmosfären. Detta steg skapar ett undertryck lika med Pc på nukleära yta.
- Hämta bilder med den Mikroskop bild samling programvaran. Ställa in en avi-förvärv (video) eller nd-förvärv (bilder) i samlingen bildbehandlingsprogram.
Obs: För någon imaging förvärva programvara, ställa in realtid video imaging eller time-lapse bild förvärv med ett kort tidsintervall. - Växla till den motsvarande lysrör imaging kanal (dvs, GFP, RFP, etc.) och börja imaging.
- Översätt mikropipett spets från kroppen av cellen (till höger, figur 1B) tills kärnan lossnar från mikropipett.
Anmärkning: Dra längs den positiva x-riktningen (till höger i synfältet). Den dragkraft som kan programmeras och kontrolleras av datorn eller joysticken kan flyttas manuellt. Vi har inte hittat något samband mellan dra ränta och nukleära deformation15 tyder på ett primärt elastiskt svar att tvinga.
3. dataanalys
- Utföra bildanalys med någon grundläggande bildbehandling programvara tillgänglig. Omfattningen av nukleära deformation kan kvantifieras genom antingen den längd stammen (Ɛ) eller området stammen (figur 1A). Kvantifiera längd stam med ekvation 1, där L och L0 representerar längder av kärnan på maximal deformation och utgångsläget, respektive.
(Ekvation 1)
(Ekvation 1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2A visar de att tvinga på en NIH 3T3 mus fibroblast nucleus. Som mikropipett spetsen är översatt till höger, kärnan deformeras och så småningom lossnar från mikropipett spetsen. Längd stam av kärnan ses att öka med ökande sugstyrka (figur 2B). Framkanten av kärnan (mikropipett dra kanten) bildar en nukleär utstick och bakkanten är fördrivna från sin ursprungliga placering. Längden på utstick är mycket större än bakkantsdämpning förskjutningen (figur 2 c), vilket tyder på en tät integration mellan kärnan och omgivande cytoplasman. Tidrymden är kort för avslappning av nukleära framkant (< 1 s), och den nukleära baksida kanten (< 2 s) (figur 2D).
Figur 2 . Karakterisering av nukleära Deformation
Deformation och förskjutning av kärnan i en levande, fastsittande cell av DFP. En NIH 3T3 fibroblast kärna drogs med 6 nN kraft. Bilderna visar den nukleära formen på den angivna tiden. Skalstapeln: 5 µm B. kärn deformation kvantifierades genom längd stam. Nukleära deformation ökade med tillämpad styrkor. Felstaplar visar standardavvikelsen för medelvärdet (SEM); n > 6. C. förskjutning i framkant är större än förskjutningen på biskäret. D. längd stam avkoppling är mycket snabbare än bakkanten avkoppling. P < 0,05; felstaplar visar SEM; n = 10. Denna siffra har ändrats från Neelam et al. 15. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Vi har använt metoden DFP för att bestämma hur cytoskeletal krafter bidra till nukleära motstånd mot deformation i cellen. Medan inga signifikanta skillnader i nukleära deformation eller översättning hittades efter F-aktin (av cytochalasin-D) eller mikrotubulära störningar (av nocodazole), resulterade att minska vimentin uttryck genom siRNA-baserade knockdown i signifikant större nukleära översättning och deformation (figur 3). Detta tyder på att vimentin mellanliggande glödtrådar i fibroblaster är det huvudsakliga cytoskeletal element som hjälpa kärnan motstå lokala kraft.
Figur 3 . Fluorescerande bilder av nukleära Deformation
DFP användes för att fastställa bidraget från cytoskeletal krafter till nukleära deformation. Kärnan var målat med SYTO 59 färgämne. Fluorescerande bilder visar överdra av kärnan innan (röd, pseudo färg) och efter (grön, pseudo färg) på det angivna villkoret. CTRL, kontroll celler; CYTO-D, celler behandlas med cytochalasin-D; NOC, celler behandlas med nocodazole; SNABBSTOPP, celler transfekterade med kodade siRNA; vim siRNA, transfekterade celler med siRNA inriktning vimentin. Denna siffra har ändrats från Neelam et al. 15. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mätning mekanisk integrering av kärnan med cellskelettet är en utmaning för mest aktuella metoder, såsom mikropipett aspiration16, eftersom de kräver antingen isolerade atomkärnor (där kärnan är frikopplade från cytoskelettet) eller kärnor i suspenderade celler (där extracellulära krafter, såsom dragkraft styrkor, är frånvarande). Kraft har tillämpats till kärnan genom att tillämpa biaxiell stam celler anhängare till en membran17,18. Denna teknik begränsas dock av det faktum att kraften på kärnan är okänd. Atomic force microscopy (AFM) sonder har använts att strecksatsen kärnan i intakta celler; dessa erbjudande den fördelen att de avslöjar de mekaniska egenskaperna av kärnan samtidigt som den är integrerad med cytoskelettet. För att lägga till befintliga in-vivo -tekniker för att karaktärisera den nucleus12,13,14, har vi utvecklat en enkel och robust metod att mekaniskt sond kärnan i en levande fastsittande cell medan det fortfarande är integrerad omgivande cytoskelettet. Ett centralt inslag i denna teknik är att kraften på kärnan är just känd och kontrolleras.
Genom att tillämpa DFP, uppskattar vi att nano-newton skala krafter är tillräcklig för att deformera och översätta kärnan i leva, vidhäftande celler. Dessutom genom systematiska studier av bidragen från olika cytoskeletal element, har vi funnit att vimentin-baserade mellanliggande glödtrådar är den primära delen av cellulära cytoskelettet ansvarar för styva kärnan i cellen 15.
Några varningar gäller med dessa experiment. Det är viktigt att regelbundet kontrollera den mikropipett tipset för igensättning eller brott under experiment, som båda igensättning av mikropipett eller fraktur i spetsen skulle leda till okända förändringar insugningstrycket tillämpas på cellen. För att kontrollera om mikropipett är igensatt, Använd inställningen rena på manipulatorn att utöva maximala påtryckningar och kolla luftbubblor framväxande från mikropipett spets. Om mikropipett spetsen är trasig eller brutna, ersätta mikropipett innan du påbörjar nästa experiment. Det är också viktigt att bekräfta den nukleära stammen varierar med kraft, som är noll vid noll kraft (se Neelam o.a. 15). om detta inte beaktas i experiment, då det är möjligt att icke-specifik vidhäftning mellan mikropipett spets och nukleära ytan (trots behandling med PLL-PEG) kan vara ansvarig för nukleära deformation. En annan begränsning av tekniken är att införandet av en mikropipett i cellen själv kan orsaka vissa lokala störningar av cytoskeletal strukturer.
Det är användbart att testa för korrelationer mellan omfattningen av nukleära deformation och översättning och fisktätheten. En avsaknad av korrelation skulle innebära ett primärt elastiskt motstånd. Detta är vad vi har funnit vara fallet för fibroblast atomkärnor15. Medan kraften på kärnan är känd, tillåter metoden inte beräkning av parametrar som de Youngs modul. Vi har främst använt det för att dissekera bidrag av cellulära strukturer till motstånd mot kärnkraft deformation och översättning i cellen. Medan vi har rapporterat tvådimensionell nukleära former15,19, kan det vara användbart att kvantifiera den full tredimensionell formen av kärnan under kraft.
Sugtrycket i mikropipett är känd, men det är större än det faktiska trycket som tillämpas på den nukleära ytan på grund av flödet av vatten genom porer10. Vi har dock visat att motståndet att flöda genom kärnkraft porerna är mycket större genom mikropipett (se stödinformation för beräkningar i Neelam o.a. 15) för rimliga membran permeabiliteten och mikropipett dimensioner. Trycket vid yttre membran ytan bör därför lika med insugningstrycket trots förekomsten av flöde.
Sammanfattningsvis, tillåter DFP användaren att kvantifiera integrerad nucleus-cytoskelettet i en fastsittande cell mekanisk reaktion på en känd och kontrollerad kraft. Denna metod skulle kunna användas att dissekera bidrag från molekylära komponenter i kärnan och cytoplasman till den mekaniska beteenden av kärnan inom cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH R01 EB014869.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FluoroDish | WPI | FD35 | |
| SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
| Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
| InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
| FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
| Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
| Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
| Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
| Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
| Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |
References
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
- Bank, E. M., Gruenbaum, Y. The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship. Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).
- Lammerding, J., et al. Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics. Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).
- Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures. Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).
- Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins. Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).
- Tapley, E. C., Starr, D. A. Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).
- Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
- Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency. Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).
- Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope. Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).
- Pagliara, S., et al. Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency. Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).
- Liu, H., et al. In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy. ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).
- Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy. Physical Biology. 10 (6), 065002 (2013).
- Neelam, S., et al. Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).
- Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
- Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation. Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).
- Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells. Methods. 94, 27-32 (2016).
