Summary
이 프로토콜에서 우리가 직접 살아있는 세포에서 핵을 제어 힘을 적용 하는 micropipette 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 생활, 부착 세포에서 핵 기계적 특성의 심문 수 있습니다.
Abstract
핵의 기계적 속성 응답 세포에서 생성 된 기계적인 힘을 결정 합니다. 핵 분자로 골격과 연속 이므로 메서드 부착 세포의 기계적 동작을 필요 합니다. 여기, 우리가 살아있는 부착 세포에서 핵에 직접 힘을 적용 하는 도구로 직접 힘 프로브 (DFP) 토론. 우리는 흡입과 핵 표면에 좁은 micropipette를 연결합니다. micropipette는 변형 하 여 번역 핵 핵 거리 변환 됩니다. 복원 힘은 흡입 힘, 핵 분리 되 고 탄력적 이완. 흡입 압력을 정확 하 게 알려져 있다, 때문에 핵 표면에 강제로 알려져 있다. 이 메서드는 나노 스케일 세력 변형 및 부착 세포에서 핵을 번역 하기에 충분 되며 저항 세력에 핵을 사용할 수 있는 cytoskeletal 요소를 식별 밝혔다. DFP는 살아있는 세포에서 핵 기계적 속성의 구성 요소 세포질과 핵의 기여를 해 부를 사용할 수 있습니다.
Introduction
암과 같은 병 리 핵 모양 및 구조1,2, 일반적으로 동반 된다 핵3,4의 '연'을 변경 포함 됩니다. 기계적 변형에 저항을 핵은 고립 된 핵5에 힘을 적용 하 여 일반적으로 특징 되었습니다.
셀에 핵 분자로 링커의 Nucleoskeleton와 골격 (링컨) 복잡 한6,7,,89골격에 연결 됩니다. 그 결과, 골격과, 세포 층 유착, 세포 외 매트릭스를 통해 핵 기계적으로 통합 되었습니다. 기계적으로 부착 세포 안에 핵을 프로 빙이 기계적 통합에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 살아있는 세포에서 핵을 조작 하는 메서드는 micropipette 포부10,11및 원자 힘 현미경 검사 법12,,1314있습니다. 우리는 최근 생활 부착 셀15에 핵에 직접 기계적인 힘을 적용 하는 직접 힘 프로브 (DFP)를 설명 합니다.
여기, 우리가 일반적으로 알려진된, 나노 기계적 힘을 부착 셀에서 핵 직접 적용할 현미경 시설에서 사용할 수 있는 microinjection 시스템을 사용 하기 위한 절차를 설명 합니다. Femtotip (0.5 µ m 직경 micropipette 팁) 탑재 하 고 튜브에 의해 microinjection 시스템에 연결 된. 때까지 핵 표면에 인접 한 문화 접시의 표면에 상대적으로 45 ° 각도로 위치 팁은 낮 췄 다. 튜브 분리 그리고 핵 표면에 부정적인 흡입 압력을 만들고 물개 micropipette 팁 핵 표면에 대 한 분위기에 열입니다. Micropipette 팁의 번역을 통해 핵 변형 이며 결국 (적용 되는 힘의 크기), 따라는 micropipette에서 분리. 이 분리는 micropipette에 의해 적용 되는 흡입 힘 동등 하 게 복원 (저항) 세력, 핵 및 셀에 의해 발휘 될 때 발생 합니다. 핵의 변위를 측정 하 여 분석을 수행할 수 있습니다 길이 변형 (공식 1), 또는 지역 스트레인 (그림 1A).
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Protocol
1. 영상에 대 한 셀을 준비합니다.
참고: 직접 힘 프로브 (DFP) 모든 부착 셀 형식에 사용할 수 있습니다. 여기, NIH 3T3 마우스 fibroblasts 모델 셀 라인으로이 프로토콜에 대 한 사용 됩니다.
- 문화 NIH 3T3 fibroblast 세포 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)에 하 1%와 10% 기증자 소 혈 청 보충 페니실린-스 35 m m 유리 하단에 원하는 confluency까지 요리. 37 ° C, 5% CO2세포를 유지 합니다.
- NIH 3T3 세포 이미징 뿌리기 전에 모든 35 mm 유리 하단 요리 fibronectin (또는 유사한 ECM 단백질), 5 µ g/mL와 코트를 해야 합니다.
참고: 셀 해야 합니다 수 완전히 확산 및 실험에 대 한 접시에 부착. DFP 메서드가 작동 하려면 confluency 측면에서 제약 되지 않습니다.
- NIH 3T3 세포 이미징 뿌리기 전에 모든 35 mm 유리 하단 요리 fibronectin (또는 유사한 ECM 단백질), 5 µ g/mL와 코트를 해야 합니다.
- 실험 직전 셀 완전 한 성장 매체를 가진 단일 세척 뒤 PBS로 두번 세척.
- 유리 하단 접시에 완전 한 성장 매체의 3 mL를 추가 합니다.
2. 현미경 및 이미지 수집
참고:는 거꾸로 형광 현미경 (또는 동등한) micromanipulator 쪽 팔의 제조 업체의 권장 사항에 따라 설치 된와 함께. 현미경은 37 ° C에서 온도 CO2 수준 5%에서 유지 하기 위해 환경 챔버를도 복 한다. Micromanipulator 및 현미경에 부착 된 microinjector는 또한 필요 합니다. 기름 침수 40 x 1.3 / NA 또는 60 x 1.49 / NA (또는 해당 목표)는 실험에 대 한 것이 좋습니다. 현미경 진동 절연 테이블에 거치 되어야 한다.
그림 1 . 핵 변형 및 현미경 초점
A. 최대 핵 변형 그리고 핵 변형의 휴식. 최대 핵 변형 계산 하기 전에 핵 모양의 뒤 가장자리 했다 처음 변형된 핵의 번역에 대 한 해결을 동시에. Micropipette 팁 초연의 순간에 핵의 모양 당기는 전에 초기 핵 모양에 중첩 되었다. 두 셰이프 사이의 지역 차이 Δ로 측정 되었다1. 최대 핵 변형 ΔA1 원래 핵 영역으로 나눈 값으로 정의 되었다. 마찬가지로, 두 번째 매개 변수, ΔA2, 원래 핵 모양에 micropipette 분리 후 최종 상태 핵 모양 오버레이하여 정의할 수 있습니다. 2. 초점 평면 A에 셀 이동한 다음 micropipette 팁을 찾을 수 평면 B까지 초점 비행기. 이미징, 동안는 micropipette 오른쪽 (주황색 화살표의 방향)으로 번역 되었다. 이 그림은 Neelam 외에서 수정 되었습니다. 15. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 제조 업체의 프로토콜 당 microinjector를 켭니다.
- 침수 기름 스포이드를 사용 하 여 대물 렌즈 위에 침수 기름 한 방울을 적용 합니다.
- 접시 홀더에 접시를 단단히 클램프 하 고 무대에 접시 홀더를 로드 합니다.
참고: 셀 실험 동안 37 ° C, 5% CO2 에서 유지 되어야 합니다. - 초점 (비행기, 그림 1B)에 셀을가지고 목표의 높이 조정 합니다.
- 관심의 셀 데 현미경 단계를 이동 합니다.
- 최상위 순위에 피펫으로 홀더 이동 micromanipulator에 조이스틱을 회전 합니다. 0.5 µ m 직경 팁 micropipette 피펫으로 보유자에 로드 합니다.
- micropipette에 세포 접착을 방지 하려면 미리 실 온에서 0.3 mg/mL 1 시간을 위한 PLL-g-말뚝 솔루션으로 micropipette 팁 취급. 모든 흡입 압력 없이 핵을 micropipette 감동 하 고 다음 핵에서 micropipette 번역 여 접착 테스트 합니다. 접착의 부재는 핵 변형 및 번역의 완전 한 부족에서 분별 수 있습니다.
참고: 패키지 여 제조 제안을 따르십시오.
- micropipette에 세포 접착을 방지 하려면 미리 실 온에서 0.3 mg/mL 1 시간을 위한 PLL-g-말뚝 솔루션으로 micropipette 팁 취급. 모든 흡입 압력 없이 핵을 micropipette 감동 하 고 다음 핵에서 micropipette 번역 여 접착 테스트 합니다. 접착의 부재는 핵 변형 및 번역의 완전 한 부족에서 분별 수 있습니다.
- 미세 제어를 조정 하 여 비행기 A와 비행기 B 셀의 맨 위에 객관적인 초점 비행기를 올립니다 (그림 1B단계 2.4 참조).
- 거친 제어는 micromanipulator를 설정 합니다. 천천히 micropipette의 실루엣에 대 한 보고는 micropipette 초점으로 완전히 때까지 비행기 B 아래로 micropipette 가져.
- 일단 micropipette 팁 초점에, 세밀 하 게 제어 하는 micromanipulator를 설정 합니다.
- 목표 셀 (비행기 A, 그림 1B)의 적도 면에 낮은 및 15 µ m 비행기 A 위의 (그림 1B, 파선된 micropipette) micropipette.
- 원하는 압력; microinjector에 보상 압력 (Pc)를 설정 안정 압력에 대 한 몇 초 동안 기다립니다.
참고: 최적의 압력 세트 포인트 셀 종류와 실험의 특정 목표에 따라 달라 집니다. 대부분의 경우, 300 hPa 좋은 출발점이 있을 것 이다. - micropipette micromanipulator 패널에 클린 설정을 사용 하 고 기포 micropipette 팁에서 나타날 ㄴ 다는 것을 확인 하 여 막힌 되지 확인 하십시오.
- 팁을 팁 핵 표면에 닿아 가볍게 때까지 micropipette을 서서히 낮추어 셀에 넣습니다.
참고:는 micropipette, 낮추는 때 micropipette 팁의 실루엣 될 것 이다 분명 그것은 초점으로 온다. 전에 micropipette 건드리면 핵, 객관적인 초점을 핵 (동일한 x y 좌표, 더 높은 z-비행기)와 micropipette 끝. 다시 핵 (비행기, 그림 1B)의 적도 면에 초점을 반환 및 점차 micropipette 팁. - 되므로 대기 micropipette 튜브의 끝을 열어 microinjection 시스템에서 압력 공급 튜브를 분리 하 여 micropipette 팁과 핵 막 인감을 만듭니다. 이 단계는 부정적인 압력 Pc 와 같은 핵 표면에 만듭니다.
- 현미경 이미지 컬렉션 소프트웨어와 함께 이미지를 취득 합니다. Avi-인수 (비디오) 또는 nd-수집 (이미지) 이미지 컬렉션 소프트웨어에서를 설정 합니다.
참고: 어떤 이미징 소프트웨어를 인수, 실시간 비디오 이미징 또는 짧은 시간 간격으로 시간 경과 이미지 인수를 설정 합니다. - 해당 형광 이미징 채널을 토글 (즉, GFP, RFP, 등)와 이미징 시작.
- (오른쪽, 그림 1B)에 셀의 본문에서 micropipette 팁 번역 핵은 micropipette에서 분리 될 때까지.
참고: (오른쪽에 있는 보기의 필드에) 긍정적인 x 방향에 따라 팁을 당겨. 풀링 레이트 프로그램을 컴퓨터에 의해 제어 또는 조이스틱을 수동으로 이동할 수 있습니다. 우리 밀 지 사이 어떤 상관 관계를 발견 하지 않은 속도 핵 변형15 를 주로 탄성 응답을 제안.
3. 데이터 분석
- 사용할 수 있는 기본적인 이미지 처리 소프트웨어 이미지 분석을 수행 합니다. 길이 변형 (Ɛ) 또는 지역 스트레인 (그림 1A)에 의해 핵 변형 정도 측정할 수 수 있습니다. 길이 변형 방정식 1를 사용 하 여 계량 어디 L과 L0 는 각각 최대 변형 및 초기 위치에서 핵의 길이 나타냅니다.
(식 1)
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Representative Results
그림 2A 는 NIH 3T3 마우스 구와 핵의 강제로 보여줍니다. Micropipette 팁은 오른쪽에 번역, 핵 변형 하 고 결국 micropipette 팁에서 분리. 핵의 길이 변형 흡입 힘 (그림 2B) 증가 함께 증가를 볼 수 있다. 핵 (micropipette 당기는 가장자리)의 앞쪽 가장자리 핵 돌출을 형성 하 고 후행 가장자리 그것의 원래 위치에서 난민. 돌출의 길이 후행 가장자리 변위 (그림 2C), 핵 및 주변 세포질 간의 긴밀 한 통합을 제안 보다 훨씬 큽니다. 시간의 척도 핵 앞쪽 가장자리의 짧은 휴식 (< 1 s), 그리고 핵 뒷면 가장자리 (< 2 s) (그림 2D).
그림 2 . 핵 변형 특성
변형 하 고 변위는 DFP에 의해 생활, 부착 세포에서 핵의. NIH 3T3 구와 핵 6 nN 힘으로 당겨 졌다. 이미지는 지정 된 시간에 핵 모양을 보여줍니다. 눈금 막대: 5 µ m B. 핵 변형 길이 긴장에 의해 공인 되었다. 핵 변형 적용된 힘 증가. 오차 막대 표시 표준 오차 (SEM); 뜻의 n > 6. C. 첨단에서 변위는 trailing 가장자리에서 변위 보다 큽니다. D. 길이 긴장 이완 뒷면 가장자리 휴식 보다 훨씬 빠릅니다. P < 0.05; 오차 막대 표시 SEM; n = 10. 이 그림은 Neelam 외에서 수정 되었습니다. 15. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
우리가 어떻게 cytoskeletal 힘을 결정 하 DFP 메서드를 사용한 셀에 변형 핵 저항을. 반면 F-말라 (cytochalasin-D)에 의해 또는 (nocodazole)에 의해 microtubule 중단 후 핵 변형 또는 번역에 상당한 차이가 발견, siRNA 기반 최저 통해 vimentin 식 감소 귀착되 었 다 상당히 큰 핵 번역 그리고 변형 (그림 3). 이 섬유 아 세포에서 vimentin 중간 필 라 멘 트 핵 현지 힘을 저항할 수 있도록 주요 cytoskeletal 요소는 나왔다.
그림 3 . 핵 변형 형광 이미지
DFP는 결정 핵 변형에 cytoskeletal 힘의 기여를 사용 되었다. 핵은 SYTO 59 염료와 스테인드. 형광 이미지 (붉은, 의사 색) 전에 핵의 오버레이 표시 (녹색, 의사 색) 후 표시 된 상태에서. Ctrl 키를, 제어 셀; Cytochalasin-d; CYTO-D, 세포 치료 NOC, nocodazole;로 치료 하는 세포 꺼져, 스크램블된 siRNA;와 페 셀 vim은 siRNA 세포 vimentin를 대상으로 siRNA와 페. 이 그림은 Neelam 외에서 수정 되었습니다. 15. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
어느 고립 된 핵 (핵은 골격에서 분리)를 필요로 하기 때문에 micropipette 포부16, 등 최신 방법에 대 한 도전 이다 골격 가진 핵의 기계적 통합 측정 또는 일시 중단 된 셀 (견인 힘, 같은 세포 외 세력 있는 결 석)에 핵. 강제로 막17,18; 세포 점착에 biaxial 긴장을 적용 하 여 핵에 적용 된 그러나,이 기술은 핵에 힘 불명 하다는 사실에 의해 제한 됩니다. 원자 힘 현미경 (AFM) 프로브; 그대로 셀에 핵을 사용 장점은 그들이 동안 핵의 기계적 성질을 공개 골격와 통합이 제공 합니다. 핵12,,1314대상이 기존 vivo에서 기술에 추가 하려면, 우리는 그것 동안 살아있는 부착 세포에서 핵을 기계적으로 프로브를 간단 하 고 강력한 방법을 개발 했습니다. 주변의 골격을 통합. 이 기술은의 주요 기능은 핵에 힘은 정확 하 게 알려진 하 고 제어입니다.
적용 하 여는 DFP, 우리 추정 나노 뉴턴 규모 힘 변형 생활, 부착 세포에서 핵을 번역 하는 충분 한. 또한, 다양 한 cytoskeletal 요소의 기여의 체계적인 연구를 통해 우리가 발견 vimentin 기반 중간 필 라 멘 트 셀에 핵 스티프닝 담당 세포 골격의 주요 구성 요소는 15.
일부 주의이 실험으로 적용 됩니다. 그것은 흡입 압력 셀에 적용 된 알 수 없는 변경 될 두 micropipette 또는 팁의 골절의 막힘으로 정기적으로 실험, 동안 막힘 또는 파손 micropipette 팁을 확인 하는 것이 중요. micropipette 막힌 경우를 확인 하려면 조작자에 클린 설정을 사용 하 여 최대 압력을 적용 하 여 공기 방울 micropipette 팁에서 신흥에 대 한 확인. Micropipette 팁 깨진 골절 경우 다음 실험을 시작 하기 전에 micropipette를 교체 합니다. 또한, 그것은 핵 긴장 힘, 따라 다릅니다 및 0 0 힘에서 확인 하는 것이 중요 (참조 Neelam 외. 15).이 실험에서 관찰 된는 경우 수 micropipette 팁과 (PLL 못 치료)에 불구 하 고 핵 표면 사이 일반적인 접착 핵 변형에 대 한 책임이 있을 수 있습니다. 기술의 또 다른 한계는 세포 자체에 micropipette의 삽입 cytoskeletal 구조의 일부 지역 장애를 일으킬 수 있습니다.
그것은 핵 변형/번역의 범위와 로딩 속도 사이의 상관 관계에 대 한 테스트에 유용 합니다. 상관 관계의 부재는 주로 탄성 저항을 의미 것. 실제로,이 우리 구와 핵15경우가 발견입니다. 핵에 힘 알려져 있지만 메서드 매개 변수 영의 계수의 계산을 허용 하지 않습니다. 우리는 주로 핵 변형 하는 셀에 번역 저항 세포 구조의 기여를 해 부를 그것을 이용 했다. 우리 보고 있지만 2 차원 핵 모양15,19, 그것은 전체 3 차원 모양에서 핵의 계량에 유용할 수 있습니다.
micropipette에 흡입 압력 알려져 있다, 하지만 그것은 통해 물 흐름 핵 표면 때문에 적용 하는 실제 압력10숨 구멍 보다 큰. 그러나, 우리가 나타났습니다 핵 숨 구멍을 통해 흐름을 저항 micropipette (참조 Neelam 외 에 계산에 대 한 지원 정보를 통해 훨씬 더 큰 15) 합리적인 막 permeabilities를 micropipette 차원. 따라서, 외부 막 표면에 압력 흐름의 존재에도 불구 하 고 흡입 압력에 동일 해야 합니다.
결론적으로는 DFP 알려지고 제어 힘을 부착 셀에서 통합된 핵 골격의 기계적 응답 척도를 사용자 수 있습니다. 이 메서드는 분자 구성 요소 셀 내에 핵의 기계적인 동작에 세포질에서 핵에의 기여를 해 부를 사용 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH R01 EB014869에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FluoroDish | WPI | FD35 | |
| SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
| Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
| InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
| FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
| Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
| Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
| Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
| Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
| Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |
References
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