Anaerob vækst og vedligeholdelse af pattedyr cellelinjer
Summary
Her, beskriver vi en ny metode, der giver mulighed for anaerobe langsigtede dyrkning af etablerede cellelinier. Den maksimale overlevelsestid, der blev testet er 17 dage. Denne metode er velegnet til afprøvning af cytotoksiske agenter og udforske fysiologi anoxically kopiere celler.
Abstract
Mest slimhindeinfektioner sammen med midtpunkter i tumorer og stamcelle nicher er geografiske områder af kroppen, der er iltfrit. Tidligere undersøgelser viser, at inkubationen i normoxic (5% CO2 i luft) eller hypoksiske (lavt iltindhold) betingelser efterfulgt af en anoxiske inkubation (fravær af fri ilt) resultater i begrænset levedygtighed (2-3 dage). En roman metode blev udviklet som gør det muligt for en anoxiske celle dyrkning (for mindst 17 dage, den maksimale tid testet). Det mest kritiske aspekt af denne metode er at sikre, at ingen ilt tilføres systemet. Dette opnås ved den afgasning af medier, og rødmen rør, retter, kolber og pipetter med en anaerob gasblandingen (H2, CO2, N2) efterfulgt af tillade materialer til Reagensglasset anoxiske (ikke-ilt) miljøet før brug. Skal udvises ekstra forsigtighed, når erhvervelse af mikrofotografier til at sikre, at micrographs opnåede ikke indeholder artefakter. I mangel af ilt, er celle morfologi væsentligt ændret. To særskilte morphotypes er kendt for alle anaerobt vokset celler. Evnen til at vokse og vedligeholder mammale celler i mangel af ilt kan anvendes til analyse af celle fysiologi, polymicrobial interaktioner og karakterisering af biosyntetiske veje for romanen kræft narkotika udvikling.
Introduction
Celler fra solide tumorer, stamcelle nicher og dem foring de slimhindeinfektioner findes i miljøer, der oplever nedsat iltindhold, herunder iltmangel1,2,3,4. I normale fysiologiske stater varierer iltning ud over det af hypoxi til iltmangel (den fuldstændige mangel på ilt)5,6. Den erkendelse, at atmosfæriske ilt negativt påvirker pattedyr celle replikering og at in vitro- cellevækst kan optimeres forarmet ilt betingelser blev rapporteret i begyndelsen af 1970erne. Richter et al. 7 viste, at 1-3% af iltindhold (hypoksi) forbedret plating effektivitet i forhold til atmosfærisk ilt (20%). Den humane diploide celle levetid er også udvidet i hypoksiske kultur betingelser8.
In vivo, hypoksiske forhold forekommer når ilt butikker er forarmet (f.eks.under intens træning), hvori ATP produktion er tændt i skeletmuskulaturen fra aerob respiration og gæring (anaerob respiration) med den slutproduktet af mælkesyre9. Patologisk, i kræfttumorer, indre af tumor masse er hypoksiske til anoxiske på grund af dårlig vascularization10. Effekten af den begrænsede perfusion på tumor interiør er selvstændigt valideret af tumor interiør koloniseret af obligat anaerober1. Mekanisk, tumor celle overlevelse i hypoxi menes at være udelukkende afhænger af ekspressionen af hypoxi-inducerbar faktor 1-alpha-genet (HIF1-alpha), som er den første spontane reaktion hypoxi4,11 , 12. HIF1-alpha er induceret hypoksiske betingelser af heat shock proteiner der binder HIF1-alpha promotor og upregulate gen transskription12. Disse heat shock proteiner menes at støtte i induktion af de forskellige fænotyper set i tumor hypoksiske mikromiljø. Disse fænotyper udviser øget udtryk for cellemembranen glukose transportvirksomheder og hastigheden af glycolysen (Warburg virkning)13. Resultatet er et skift fra mitokondrie oxidativ fosforylering til laktat gæring.
Anoxiske overlevelse kan også benytte alternativer til glucose til støtte for overlevelse fænomen14,15. De bedst undersøgte pattedyr eksempel er mole-rat, som kan overleve i næsten 20 min. uden ilt gennem en fruktose-drevet glycolytic gæring vej14. En alternativ tilpasning sker i visse fisk (fxkarper [Carassius sp.], som kan overleve betydeligt længere tid perioder ved hjælp af glykolyse med ethanol som den terminal biprodukt)15. I begge tilfælde drev gæring stofskiftet muliggør overlevelse i mangel af ilt. Den nuværende hypotese for anoxiske overlevelse er, at så længe som HIF1-alpha er aktiveret under hypoxi, mitokondrie respiration, uden behov for ilt, opstår under anaerobe betingelser16. Derudover er det postuleret at brugen af et Fermentativ pathway for hypoksiske/anoxiske overlevelse forbedrer tumor overlevelse, da cellerne undgå oxidativ stress, som kan vise sig for at være til skade for celle overlevelse17. Dette postulat er støttet af en nylig undersøgelse, som viser, at iltsvind i cardiomyocytes, reducerer den oxidative stress placeret på tumor celle17.
Til dato, har de væsentlige karakter af et Fermentativ vej for anoxiske pattedyr celle overlevelse været indgroet i litteraturen, grund, i vid udstrækning, at en manglende evne til at kultur mammale celler i den fuldstændige mangel på ilt til mere end 3 dage. Men et alternativ til glykolyse for anaerob overlevelse forekommer i bakterier. I visse bakterier, kan kvælstof eller sulfat (blandt andre forbindelser) tjene som terminal elektronacceptorer for cytokrom oxidase system i mangel af ilt18. Selv om bakteriel og eukaryote udviklingen skete parallelt siden afviger fra den sidste universal fælles forfader, anslås det, at mitokondrier leverer energi til celler 1.542 millioner år før iltningen af havene19 . Da forskere har vist, at de isolerede mitochondrier kan producere ATP i mangel af ilt, med nitrit som terminal elektron acceptor, er det rimeligt at antage, at celler kunne fungere for perioder længere end 3 dage i mangel af ilt 20 , 21 , 22 , 23. den metode, der beskrives i denne undersøgelse har et hjælpeprogram for de anaerobe pattedyr cellevækst af talrige cellelinjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne metode repræsenterer første gang pattedyrceller, der var kulturperler for længere perioder i mangel af ilt. Baseret på aktuelle observationer, synes den anoxiske vækst evne via en ikke-Fermentativ vej at være universelle blandt pattedyrceller linjer28, hvor de anaerobe vækst resulterede i fænotype divergens. Dette blev observeret for alle cellelinjer testet. Med anaerob dyrkning, øge proportioner af celler blev afrundet, udviklet en suspension-lignende befolkning og var i s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke Midwestern Universitet Office of Research og sponsorerede programmer for deres støtte.
Materials
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
References
- Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants?. Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).
- Liao, J., et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).
- Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Biedermann, L., Rogler, G. The intestinal microbiota: its role in health and disease. European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).
- Cui, X. Y., et al. Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267, 423 (1977).
- Warburg, O. On the origin of cancer. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer. The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous. The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).
- Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva. Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).
- Park, T. J., et al. Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat. Science. 356 (6335), 307 (2017).
- Johnston, I. A., Bernard, L. M. Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia. Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).
- Takahashi, E., Sato, M. Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).
- Mandziuk, S., et al. Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture. Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).
- Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).
- Müller, M., et al. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase. Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).
- Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).
- Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase. Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).
- Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. Cancer stem cells in breast cancer and metastasis. Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).
- Sarmento, B., et al. Cell-based in vitro models for predicting drug permeability. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).
- Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).
