Crescimento anaeróbico e manutenção de linhas de células de mamíferos
Summary
Aqui, descrevemos um novo método que permite o cultivo de longo prazo anaeróbico de linhagens celulares estabelecidas. O tempo máximo de sobrevivência que foi testado é 17 dias. Este método é adequado para o teste de agentes citotóxicos e explorando a fisiologia da anoxically replicação de células.
Abstract
Mais superfícies mucosas, juntamente com os pontos médios em tumores e nichos de células-tronco são áreas geográficas do corpo que são anóxica. Estudos anteriores mostram que a incubação em normoxic (5% CO2 no ar) ou hipóxia condições (baixos níveis de oxigênio) seguiram por um resultados de incubação anóxica (ausência de oxigênio livre) na viabilidade limitada (2 – 3 dias). Uma nova metodologia foi desenvolvida que permite a um cultivo celular anóxica (pelo menos 17 dias, o tempo máximo testado). O aspecto mais importante desta metodologia é garantir que não há oxigênio é introduzido no sistema. Isso é obtido, a desgaseificação de mídia e por tubos de irrigação, pratos, balões e pipetas com uma mistura de gás anaeróbio (H2, CO2, N2) seguido por permitir que os materiais para equilibrar ao ambiente anóxico (não-oxigênio) antes do uso. Cuidados adicionais devem ser exercido quando adquirir fotomicrografias para garantir que as micrografias obtidas não contêm artefatos. Na ausência de oxigênio, a morfologia celular é significativamente alterada. Dois morfotipos distintos são anotados para todas as células cultivadas anaerobicamente. A capacidade de crescer e manter pilhas mamíferas na ausência de oxigênio pode ser aplicada à análise da fisiologia celular, interações polymicrobial e a caracterização das vias biossintéticas para desenvolvimento de drogas câncer romance.
Introduction
Existem células de tumores sólidos, nichos de células-tronco e aqueles que revestem as superfícies mucosas em ambientes que experimentam níveis reduzidos de oxigênio, incluindo anóxia1,2,3,4. Em Estados fisiológicos normais, oxigenação varia além da hipóxia, anóxia (completa ausência de oxigênio)5,6. A realização que oxigênio atmosférico afeta negativamente a replicação de células de mamíferos e o crescimento de células em vitro pode ser otimizado sob condições de oxigênio empobrecido foi relatada na década de 1970. Richter et al . 7 mostrou que 1-3% dos níveis de oxigênio (hipóxia) reforçada chapeamento eficiência em comparação com o oxigênio atmosférico (20%). A expectativa de vida de célula diploide humana também é estendida na cultura hipóxica condições8.
In vivo, hipóxicos condições ocorrem quando oxigênio lojas estão esgotados (por exemplo, durante o exercício intenso), no qual a produção de ATP é alternada no músculo esquelético da respiração aeróbia de fermentação (respiração anaeróbia) com o produto final de ácido láctico9. Patologicamente, em tumores cancerosos, o interior do tumor, massa é hipóxica para anóxica devido à pobre vascularização10. O efeito da perfusão limitada no interior do tumor independente é validado pelos interiores de tumor colonizadas por anaeróbios obrigatórios1. Mecanicamente, a sobrevivência de células de tumor em hipóxia é pensada para ser unicamente dependente da expressão do gene hypoxia-inducible factor 1-alfa (HIF1-alfa), que é a resposta inicial espontânea de hipóxia4,11 , 12. HIF1-alfa é induzida em condições de hipóxicos por proteínas de choque do calor que ligam o HIF1-alfa promotor e upregulate de transcrição do gene12. Estas proteínas de choque do calor são acreditadas para ajudar na indução dos vários fenótipos visto no microambiente hipóxico do tumor. Estes fenótipos apresentam um aumento da expressão dos transportadores de glicose a membrana celular e a taxa de glicólise (o efeito Warburg)13. O resultado é um interruptor da fosforilação oxidativa mitocondrial para fermentação de lactato.
Anóxica sobrevivência também pode utilizar alternativas para glicose para apoiar o fenômeno de sobrevivência14,15. O melhor exemplo de mamíferos estudado é a toupeira, que podem sobreviver por quase 20 min sem oxigênio através de uma fermentação glicolítico orientado a frutose via14. Uma alternativa adaptação ocorre em certos peixes (por exemplo, carpa [SP.Carassius ], que pode sobreviver por significativamente mais períodos de tempo usando a glicólise com etanol como subproduto o terminal)15. Em ambos os casos, a fermentação impulsiona o metabolismo, permitindo a sobrevivência na ausência de oxigênio. A hipótese atual para sobrevivência anóxica é que tanto tempo como HIF1-alfa é ativado durante a hipóxia, respiração mitocondrial, sem a necessidade de oxigênio, ocorre sob condições anaeróbicas16. Além disso, postula-se que o uso de uma via fermentativa para sobrevivência hipóxica/anóxica aumenta sobrevivência do tumor, desde que as células evitar stress oxidativo que poderia para ser prejudicial para a célula de sobrevivência17. Este postulado é suportado por um estudo recente que mostra que em cardiomyocytes, hipóxia reduz o estresse oxidativo, colocado sobre o tumor de célula17.
Até à data, a natureza essencial de uma via fermentativa para a sobrevivência da pilha mamíferas anóxica tem sido entranhada na literatura, devido, em grande parte, a uma incapacidade de células de mamíferos de cultura na ausência completa de oxigênio por mais de 3 dias. No entanto, uma alternativa à glicólise para a sobrevivência anaeróbica ocorre em bactérias. Em certas bactérias, nitrogênio ou sulfato (entre outros compostos) pode servir como aceitadores de electrões terminal para o sistema do citocromo oxidase na ausência de oxigênio18. Embora a evolução bacteriana e eucariótica ocorreu em paralelo desde divergindo o último ancestral comum universal, estima-se que as mitocôndrias foram fornecendo energia para as células para 1,542 milhões de anos antes da oxigenação dos oceanos19 . Desde que os pesquisadores têm mostrado que as mitocôndrias isoladas podem produzir ATP na ausência de oxigênio, com nitrito como o aceitador terminal do elétron, é razoável supor que as células poderiam funcionar por períodos de tempo mais de 3 dias na ausência de oxigênio 20 , 21 , 22 , 23. a metodologia descrita neste estudo tem uma utilidade para o crescimento da pilha mamífera anaeróbico de numerosas linhas de célula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método representa pela primeira vez células mamíferas que foram cultivadas por longos períodos de tempo na ausência de oxigênio. Baseado nas observações atuais, o crescimento anóxica capacidade através de um caminho não-fermentativa parecem ser universal entre linhas de células de mamíferos28, onde o crescimento anaeróbico resultou em divergência de fenótipo. Isto foi observado para todas as linhas celulares testadas. Com o cultivo de anaeróbio, aumentar as proporç?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecer o centro-oeste Universidade escritório de pesquisa e programas patrocinados pelo seu apoio.
Materials
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
References
- Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants?. Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).
- Liao, J., et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).
- Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Biedermann, L., Rogler, G. The intestinal microbiota: its role in health and disease. European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).
- Cui, X. Y., et al. Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267, 423 (1977).
- Warburg, O. On the origin of cancer. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer. The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous. The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).
- Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva. Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).
- Park, T. J., et al. Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat. Science. 356 (6335), 307 (2017).
- Johnston, I. A., Bernard, L. M. Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia. Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).
- Takahashi, E., Sato, M. Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).
- Mandziuk, S., et al. Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture. Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).
- Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).
- Müller, M., et al. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase. Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).
- Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).
- Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase. Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).
- Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. Cancer stem cells in breast cancer and metastasis. Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).
- Sarmento, B., et al. Cell-based in vitro models for predicting drug permeability. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).
- Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).
