Anaërobe groei en het onderhoud van zoogdieren cellijnen
Summary
Hier beschrijven we een nieuwe methode waarmee de anaërobe op lange termijn teelt van bestaande cellijnen. De maximale overlevingstijd die werd getest is 17 dagen. Deze methode is geschikt voor het testen van cytotoxische agenten en het verkennen van de Fysiologie van de anoxically cellen te repliceren.
Abstract
Meest mucosal oppervlakken samen met de middelpunten in tumoren en stamcel niches zijn geografische gebieden van het lichaam die zuurstofvrije. Eerdere studies tonen aan dat de incubatie in normoxic (5% CO2 in lucht) of hypoxische (lage zuurstofniveaus) voorwaarden gevolgd door een zuurstofvrije incubatie (een ontbreken van vrije zuurstof) resulteert in beperkte levensvatbaarheid (2-3 dagen). Een nieuwe methodiek ontwikkeld waarmee een zuurstofvrije cel teelt (voor ten minste 17 dagen; de maximale tijd getest). Het meest kritieke aspect van deze methode is om ervoor te zorgen dat er geen zuurstof wordt ingevoerd in het systeem. Dit percentage wordt verkregen door het ontgassen van media, en door de afboekingsmethode buizen, gerechten, kolven en pipetten met een anaërobe gasmengsel (H2, CO2, N-2) gevolgd door toe te staan van het materiaal dat voor het milieu (niet-zuurstof) zuurstofvrije equilibreer voorafgaand aan gebruik. Extra zorg moet worden betracht bij het verwerven van photomicrographs om ervoor te zorgen dat de verkregen microfoto geen artefacten bevatten. Bij gebrek aan zuurstof, is de cel morfologie ingrijpend veranderd. Twee verschillende morphotypes worden vermeld voor alle anaëroob gekweekte cellen. De mogelijkheid om te groeien en te handhaven van zoogdiercellen in afwezigheid van zuurstof kan worden toegepast op de analyse van celfysiologie, polymicrobial interacties en de karakterisering van nieuwe kanker Geneesmiddelenontwikkeling biosynthetic opleidingstrajecten.
Introduction
Cellen van solide tumoren, stamcel niches en de voering van de mucosal oppervlakken bestaan in omgevingen die ervaring van verminderde zuurstofniveaus, met inbegrip van Anoxie1,,2,,3,4. In normale fysiologische staten varieert oxygenatie dan van hypoxie Anoxie (de volledige afwezigheid van zuurstof)5,6. Het besef dat atmosferische zuurstof beïnvloedt in negatieve zin zoogdiercellen replicatie en dat celgroei in vitro kan worden geoptimaliseerd verarmd zuurstof omstandigheden werd gemeld in de vroege jaren 1970. Richter et al. 7 bleek dat 1-3% van de zuurstofniveaus (hypoxie) verbeterde plating efficiëntie ten opzichte van de atmosferische zuurstof (20%). De levensduur van de menselijke diploïde cel wordt ook uitgebreid in de hypoxische cultuur voorwaarden8.
In vivo, hypoxische voorwaarden optreden als zuurstof winkels zijn verarmd (b.v.tijdens intense oefening), waarin de ATP productie is ingeschakeld de skeletspieren van aërobe ademhaling om gisting (anaërobe ademhaling) met de eindproduct van melkzuur9. Pathologisch, in kanker tumoren, het interieur van de tumor is massa hypoxische aan zuurstofvrije als gevolg van slechte vascularisatie10. Het effect van de beperkte perfusie op tumor interieurs is onafhankelijk gevalideerd door tumor interieurs gekoloniseerd door obligate sporenvormende anaerobe bacteriën1. Mechanistically, de overleving van de cel van de tumor in hypoxie wordt beschouwd als uitsluitend afhankelijk is van de expressie van het gen van hypoxie-afleidbare factor 1-alpha (HIF1-alpha), die is de eerste spontane reactie op hypoxie4,11 , 12. HIF1-alpha hypoxische voorwaarden wordt geïnduceerd door hitteschokprotëinen die de HIF1 binden-Alfa promotor en upregulate de gene transcriptie12. Deze hitteschokprotëinen worden verondersteld om te helpen bij de inductie van de verschillende fenotypes gezien in de tumor hypoxische communicatie. Deze fenotypen vertonen een grotere expressie van de celmembraan glucose vervoerders en het tempo van de glycolyse (het Warburg effect)13. Het resultaat is een overstap van Mitochondriale oxidatieve fosforylatie aan lactaat gisting.
Zuurstofvrije overleving kan ook gebruik maken van alternatieven voor glucose ter ondersteuning van de overleving fenomeen14,15. De best bestudeerde zoogdieren in het volgende voorbeeld is de mole-rat, die voor bijna 20 minuten zonder zuurstof tot en met een fructose-gedreven glycolytic gisting traject14kunnen overleven. Een alternatieve aanpassing treedt op in bepaalde soorten vis (bijvoorbeeldkarpers [Carassius sp.], die aanzienlijk langer kunnen overleven periodes glycolyse met ethanol als de terminal bijproduct)15. In beide gevallen drijft gisting de stofwisseling waardoor het voortbestaan in de afwezigheid van zuurstof. De huidige hypothese voor zuurstofvrije overleving is dat zo lang als HIF1-alpha is geactiveerd tijdens hypoxie, mitochondriale ademhaling, zonder de behoefte aan zuurstof, optreedt onder anaërobe omstandigheden16. Bovendien is het gepostuleerd dat het gebruik van een fermenterende traject voor hypoxische/zuurstofvrije overleving tumor overleving verbetert, aangezien de cellen voorkomen oxidatieve stress die blijken dat kan te zijn schadelijk voor de cel overleving17. Dit postulaat wordt ondersteund door een recente studie waaruit blijkt dat in cardiomyocytes, hypoxie de oxidatieve stress op de tumor cel17geplaatst vermindert.
Tot op heden, heeft het essentiële karakter van een fermenterende traject voor de overleving van de zuurstofvrije zoogdieren cel zijn ingebakken in de literatuur, gevolg, grotendeels, een onvermogen om cultuur cellen van zoogdieren in het volledig ontbreken van zuurstof voor meer dan 3 dagen. Echter, een alternatief voor voor de overleving van de anaërobe glycolyse gebeurt bij bacteriën. In bepaalde bacteriën, kan stikstof of sulfaat (onder andere verbindingen) dienen als terminal elektronen acceptoren voor het cytochroom oxidase-systeem in de afwezigheid van zuurstof18. Hoewel de bacteriële en eukaryote evolutie is opgetreden in parallel sinds afwijken van de laatste gemeenschappelijke voorouder van universele, geschat wordt dat mitochondriën energie naar cellen door 1.542 miljoen jaar voordat de oxygenatie van de oceanen19 voorzien waren . Omdat onderzoekers hebben aangetoond dat de geïsoleerde mitochondriën ATP in de afwezigheid van zuurstof, met nitriet als de terminal elektron acceptor produceren kunnen, is het redelijk te veronderstellen dat de cellen voor perioden langer dan 3 dagen in de afwezigheid van zuurstof functioneren kunnen 20 , 21 , 22 , 23. de methodologie beschreven in deze studie heeft een hulpprogramma voor de anaërobe zoogdieren celgroei van talrijke cellijnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze methode eerst zoogdieren cellen voorstelt die werden gekweekt voor langere tijd in de afwezigheid van zuurstof. Op basis van de huidige waarnemingen, lijkt de zuurstofvrije groei vermogen via een niet-fermenterende weg te zijn universele onder zoogdiercellen lijnen28, waar de anaërobe groei resulteerde in fenotype divergentie. Dit werd waargenomen voor alle cellijnen getest. Met de anaërobe teelt, verhoging van de verhoudingen van de cellen werd afgerond, ontwikkelde een schorsing-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken de Midwestern Universiteit Office of Research en gesponsorde programma’s voor hun steun.
Materials
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
References
- Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants?. Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).
- Liao, J., et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).
- Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Biedermann, L., Rogler, G. The intestinal microbiota: its role in health and disease. European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).
- Cui, X. Y., et al. Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267, 423 (1977).
- Warburg, O. On the origin of cancer. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer. The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous. The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).
- Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva. Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).
- Park, T. J., et al. Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat. Science. 356 (6335), 307 (2017).
- Johnston, I. A., Bernard, L. M. Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia. Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).
- Takahashi, E., Sato, M. Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).
- Mandziuk, S., et al. Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture. Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).
- Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).
- Müller, M., et al. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase. Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).
- Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).
- Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase. Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).
- Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. Cancer stem cells in breast cancer and metastasis. Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).
- Sarmento, B., et al. Cell-based in vitro models for predicting drug permeability. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).
- Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).
