La croissance anaérobie et l’entretien de lignées cellulaires de mammifères
Summary
Nous décrivons ici une nouvelle méthode qui permet la culture anaérobie à long terme de lignées cellulaires établies. Le temps de survie maximale qui a été testé est de 17 jours. Cette méthode convient pour les essais des agents cytotoxiques et explorer la physiologie de réplication des cellules anoxically.
Abstract
Plus les surfaces muqueuses ainsi que les milieux dans les tumeurs et les cellules souches niches sont des régions géographiques du corps qui sont anoxiques. Les études précédentes montrent que l’incubation dans normoxique (5 % CO2 dans l’air) ou hypoxique conditions (faibles teneurs en oxygène) suivies par une incubation anoxiques (l’absence d’oxygène libre) des résultats en viabilité limitée (2 à 3 jours). Une nouvelle méthodologie a été développée qui permet une culture de cellules anoxiques (au moins 17 jours ; durée maximale testée). L’aspect le plus important de cette méthodologie est de s’assurer qu’aucun oxygène n’est introduit dans le système. Ceci est obtenu par le dégazage des médias et de tubes de chasse d’eau, vaisselle, flacons et pipettes avec un mélange de gaz anaérobie (H2, CO2, N2) suivie en autorisant les matériaux s’équilibrer à l’environnement anoxique de la (non-oxygène) avant son utilisation. Soins supplémentaires doivent être exercé lorsque les photomicrographies acquérir pour s’assurer que les micrographies obtenus ne contiennent pas d’artefacts. En l’absence d’oxygène, la morphologie des cellules est significativement altérée. Deux types morphologiques distincts sont remarquables pour toutes les cellules cultivées en anaérobiose. La capacité de développer et maintenir des cellules de mammifères en l’absence d’oxygène peut être appliquée à l’analyse de la physiologie cellulaire, les interactions polymicrobienne et la caractérisation des voies biosynthétiques pour le développement de médicaments nouveaux de cancer.
Introduction
Il existe des cellules de tumeurs solides, les niches de cellules souches et les revêtement des surfaces muqueuses dans les environnements qui connaissent les teneurs en oxygène réduite, y compris l’anoxie1,2,3,4. Dans les États physiologiques normales, oxygénation varie en outre de l’hypoxie d’anoxie (l’absence totale d’oxygène)5,6. La réalisation que l’oxygène atmosphérique affecte négativement la réplication des cellules de mammifères et que la croissance cellulaire in vitro peut être optimisée sous conditions appauvri en oxygène a été signalée dans les années 1970. Richter et al. 7 a montré que 1 à 3 % du taux d’oxygène (hypoxie) amélioré placage à l’efficacité par rapport à l’oxygène atmosphérique (20 %). La durée de vie de cellules diploïdes humaines est également prolongée dans les conditions de culture hypoxique8.
In vivo, des conditions hypoxiques surviennent lorsque les réserves d’oxygène sont épuisés (par exemple, pendant l’exercice intense), dans laquelle la production d’ATP est activée dans le muscle squelettique de la respiration aérobie de fermentation (respiration anaérobie) avec la produit de l’acide lactique,9. Pathologiquement, dans les tumeurs cancéreuses, l’intérieur de la tumeur, la masse est hypoxique à anoxiques en raison de la mauvaise vascularisation10. L’effet de la perfusion limitée sur les intérieurs de la tumeur est indépendamment validé par des intérieurs de tumeur colonisées par des bactéries anaérobies obligatoires1. Mécaniquement, la survie des cellules tumorales en hypoxie est considérée comme dépendant uniquement de l’expression du gène alpha-1 facteurs inductibles par l’hypoxie (HIF1-alpha), qui est la première réponse spontanée à une hypoxie4,11 , 12. HIF1-alpha est induite dans des conditions hypoxiques par des protéines de choc thermique qui lient la HIF1-promoteur alpha et réguler positivement la transcription de gène12. Ces protéines de choc thermique sont soupçonnés d’aide dans l’induction des phénotypes différents dans le microenvironnement hypoxique de la tumeur. Ces phénotypes présentent une expression accrue des membrane cellulaire des transporteurs de glucose et le taux de glycolyse (l’effet Warburg)13. Il en résulte une commutation de la phosphorylation oxydative mitochondriale de lactate fermentation.
Survie anoxique peut utiliser également des solutions de rechange au glucose pour soutenir la survie phénomène14,15. Le meilleur exemple de mammifères étudié est le rat-taupe, qui peuvent survivre pendant presque 20 minutes sans oxygène par une voie de fermentation glycolytique pilotée par le fructose14. Une autre adaptation se produit dans certains poissons (p. ex., carpe [Carassius SP.], qui peut survivre pendant nettement plus longtemps périodes à l’aide de glycolyse avec de l’éthanol comme le sous-produit terminal)15. Dans les deux cas, la fermentation lecteurs le métabolisme qui permet la survie en l’absence d’oxygène. L’hypothèse actuelle pour la survie anoxique est que si longtemps HIF1-alpha est activé pendant l’hypoxie, la respiration mitochondriale, sans le besoin d’oxygène, se produit dans des conditions anaérobies,16. En outre, il est postulé que l’utilisation d’une voie fermentaire pour la survie hypoxique/anoxique améliore la survie de la tumeur puisque les cellules éviter le stress oxydatif qui pourrait s’avérer préjudiciable à la survie de cellule17. Ce postulat est supporté par une étude récente qui montre que dans les cardiomyocytes, hypoxie réduit le stress oxydatif, placé sur la cellule de tumeur17.
A ce jour, la nature essentielle d’une voie fermentaire pour la survie des cellules de mammifères anoxique a été enracinée dans la littérature, sont dus, en grande partie, à une incapacité de cellules de mammifères en culture en l’absence totale d’oxygène pendant plus de 3 jours. Toutefois, une alternative à la glycolyse pour la survie anaérobie se produit chez les bactéries. Dans certaines bactéries, l’azote ou sulfate (parmi d’autres composés) peut servir comme accepteurs d’électrons pour le système cytochrome oxydase en l’absence de l’oxygène18. Bien que l’évolution des bactéries et des eucaryote ont eu lieu en parallèle depuis divergeant du dernier ancêtre commun universel, on estime que les mitochondries ont été fournir l’énergie aux cellules 1,542 millions d’années avant l’oxygénation des Océans19 . Étant donné que les chercheurs ont montré que les mitochondries isolées peuvent produire de l’ATP en l’absence d’oxygène, avec nitrite comme accepteur terminal d’électron, il est raisonnable de supposer que les cellules pouvaient fonctionner pendant une période supérieure à 3 jours en l’absence d’oxygène 20 , 21 , 22 , 23. la méthodologie décrite dans la présente étude a une utilité pour la croissance des cellules de mammifères anaérobie de nombreuses lignées cellulaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette méthode représente la première fois des cellules de mammifères qui ont été cultivés pendant une période prolongée de temps en l’absence d’oxygène. Se fondant sur les observations actuelles, la croissance anoxique capacité via une voie non fermentatif semble être universelle parmi les cellules de mammifères lignes28, où la croissance anaérobie entraîné divergence de phénotype. Cela a été observée pour toutes les lignées cellulaires testées. Avec la culture …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le Bureau de recherche de l’Université du Midwest et parrainé des programmes pour leur soutien.
Materials
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
References
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