Anaerob tillväxt och underhåll av däggdjursceller linjer
Summary
Här beskriver vi en ny metod som möjliggör långsiktiga anaerob odling av etablerade cellinjer. Den maximala överlevnadstid som testades är 17 dagar. Denna metod är lämplig för testning av cytotoxiska medel och utforska fysiologi anoxically replikera celler.
Abstract
Mest slemhinnorna tillsammans med mittpunkterna i tumörer och stamceller nischer är geografiska områden av kroppen som är syrefria. Tidigare studier visar att inkubering i normoxic (5% CO2 i luften) eller hypoxisk (låg syrehalt) villkor följt av en anoxiska inkubation (frånvaro av fritt syre) resultat i begränsad viabilitet (2 – 3 dagar). En ny metodik utvecklades som möjliggör en anoxiska cell odling (för minst 17 dagar, den maximala tid testat). Den mest kritiska aspekten av denna metod är att säkerställa att inget syre tillförs systemet. Detta erhålls genom avgasning av media, och genom spolning rör, rätter, kolvar och pipetter med en anaerob gasblandningen (H2, CO2, N2) följt av tillåter material temperera anoxiska (icke-syre) miljön före användning. Ytterligare försiktighet måste iakttas när förvärva mikrofotografier för att säkerställa att de micrographs som erhålls inte innehåller artefakter. I frånvaro av syre, är cellmorfologi signifikant. Två olika morphotypes är kända för alla anaerobt odlade celler. Förmågan att växa och bibehålla däggdjursceller i frånvaro av syre kan tillämpas på analysen av cellfysiologi, polymikrobiella interaktioner och karakterisering av biosyntetiska vägar för romanen cancer läkemedelsutveckling.
Introduction
Det finns celler från solida tumörer, stamceller nischer och de foder slemhinnorna i miljöer som upplever minskad syrehalt, inklusive anoxia1,2,3,4. I normala fysiologiska staterna varierar syresättning utöver hypoxi anoxia (komplett frånvaro av syre)5,6. Insikten att luftens syre inverkar negativt på däggdjursceller replikering och att in vitro- celltillväxt kan optimeras enligt utarmat Syreförhållandena rapporterades under 1970. Richter et al. 7 visade att 1 – 3% av syrebrist (hypoxi) förbättrad plätering effektivitet jämfört med luftens syre (20%). Den humana diploida cell livslängden förlängs också i hypoxisk kultur villkor8.
In vivo, hypoxisk tillstånd uppstå när syre butiker är utarmat (t.ex., under intensiv träning), vari ATP produktionen slås i skelettmuskulaturen från aerob respiration att jäsning (anaerob respiration) med den slutprodukten av mjölksyra9. Patologiskt, i cancertumörer, interiören av tumören massan är hypoxisk att syrefria på grund av dålig vaskularisering10. Effekten av begränsad perfusionen på tumör interiörer valideras självständigt av tumör interiörer koloniserats av obligata anaerober1. Slentrianmässigt, tumör cellöverlevnad i hypoxi tros vara uteslutande är avhängig av uttrycket av genen hypoxi-inducerbara faktor 1-alpha (HIF1-alpha), vilket är det första spontana svaret hypoxi4,11 , 12. HIF1-alpha framkallas hypoxisk villkor av värma chockar proteiner som binder den HIF1-alfa promotorn och upregulate den gen transkription12. Dessa värma chockar proteiner tros stöd i induktion av de olika fenotyperna sett i den tumör hypoxisk mikromiljö. Dessa fenotyper uppvisar ett ökat uttryck av cellens membran glukostransportörer och graden av glykolys (Warburg effekten)13. Resultatet är en switch från mitokondriell oxidativ fosforylering till laktat jäsning.
Syrefria överlevnad kan också utnyttja alternativ till glukos att stödja överlevnad fenomen14,15. De bäst studerade däggdjur exemplet är mullvad råtta, som kan överleva i nästan 20 min utan syre genom en fruktos-driven glycolytic jäsning väg14. En alternativ anpassning sker i vissa fisk (t.ex., karp [Carassius sp.], som kan överleva för betydligt längre tidsperioder med glykolys med etanol som terminal biprodukt)15. I båda fallen driver jäsning den metabolism som möjliggör överlevnad i frånvaro av syre. Den aktuella hypotesen för anoxiska överlevnad är att så länge HIF1-alpha är aktiverad under hypoxi, mitokondriell respiration, utan behov av syre, sker under anaeroba förhållanden16. Dessutom är det förutsatte att användningen av en fermentativa väg för hypoxisk/anoxiska överlevnad ökar tumör överlevnad eftersom cellerna undvika oxidativ stress som kan visa sig vara skadligt för den cell överlevnad17. Detta postulat stöds av en studie som visar att hypoxi i hjärtmuskelceller, minskar oxidativ stress placeras på tumör cell17.
Hittills har har oumbärliga ett fermentativa utbildningsavsnitt för anoxiska däggdjursceller överlevnad varit ingrodd i litteraturen, vederbörlig, till stor del, till en oförmåga att kultur däggdjursceller i fullständig avsaknad av syre i mer än 3 dagar. Ett alternativ till glykolys för anaerob överlevnad sker dock i bakterier. I vissa bakterier, kan kväve eller sulfat (bland andra föreningar) fungera som terminal Elektronacceptorer för cytokrom oxidas systemet i frånvaro av syre18. Även om den bakteriella och eukaryota utvecklingen skett parallellt sedan avvika från den senaste universal gemensamma förfadern, uppskattas det att mitokondrierna var att ge energi till cellerna i 1.542 miljoner år innan syresättning av haven19 . Eftersom forskare har visat att isolerade mitokondrierna kan producera ATP i frånvaro av syre, nitrit som den terminal Elektronacceptor, är det rimligt att anta att celler skulle kunna fungera under perioder längre än 3 dagar i frånvaro av syre 20 , 21 , 22 , 23. den metod som beskrivs i denna studie har ett verktyg för anaerob däggdjursceller tillväxt av flera cellinjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna metod motsvarar första gången däggdjursceller som odlades för längre tidsperioder i frånvaro av syre. Baserat på aktuella observationer, verkar den syrefria tillväxt kapacitet via en icke-fermenterande väg vara universell bland däggdjursceller linjer28, där anaeroba tillväxten resulterade i fenotyp divergens. Detta observerades för alla cellinjer som testas. Öka andelen cellerna med anaerob odling, blev rundade, utvecklat en suspension-liknande befolkning och kunde rep…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Midwestern University kontor för forskning och sponsrade program för deras stöd.
Materials
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
References
- Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants?. Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).
- Liao, J., et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).
- Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Biedermann, L., Rogler, G. The intestinal microbiota: its role in health and disease. European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).
- Cui, X. Y., et al. Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267, 423 (1977).
- Warburg, O. On the origin of cancer. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer. The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous. The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).
- Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva. Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).
- Park, T. J., et al. Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat. Science. 356 (6335), 307 (2017).
- Johnston, I. A., Bernard, L. M. Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia. Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).
- Takahashi, E., Sato, M. Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).
- Mandziuk, S., et al. Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture. Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).
- Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).
- Müller, M., et al. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase. Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).
- Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).
- Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase. Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).
- Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. Cancer stem cells in breast cancer and metastasis. Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).
- Sarmento, B., et al. Cell-based in vitro models for predicting drug permeability. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).
- Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).
