Здесь мы опишем новый метод, позволяющий анаэробных долгосрочные культивирование установленных клеточных линий. Максимальная выживания время, которая была испытана — 17 дней. Этот метод подходит для тестирования цитотоксических агентов и изучения физиологии anoxically репликации клеток.
Наиболее слизистой поверхности вместе с среднее положение в опухоли и ниш стволовых клеток являются географические области тела, которые аноксии. Предыдущие исследования показывают, что инкубации в нормоксические (5% CO2 в воздухе) или гипоксических условий (низкая кислорода) следуют результаты анаэробной инкубации (отсутствие свободного кислорода) в ограниченных жизнеспособности (2-3 дней). Была разработана Роман методология, позволяющая культивирования аноксии клеток (для по крайней мере 17 дней; максимальное время испытания). Наиболее важным аспектом этой методологии заключается в обеспечении, что нет кислорода вводится в систему. Это получается путем дегазации, средств массовой информации и путем промывки трубок и блюда, колбы, пипетки с анаэробной газовой смеси (H2, CO2, N2) следуют разрешительные материалы, чтобы сбалансировать в анаэробных (без кислорода) среде Перед использованием. Дополнительный уход должны осуществляться при приобретении микрофотографии чтобы убедиться, что получены микроскопии не содержат артефакты. В отсутствие кислорода морфологию клеток значительно изменены. Два отдельных Морфотипы отмечены для всех анаэробно выращенные клетки. Возможность расти и поддерживать mammalian клеток в отсутствие кислорода может применяться для анализа физиологии клетки, полимикробная взаимодействий и характеристика биосинтетических пути для развития Роман рака наркотиков.
Клетки из солидных опухолей, ниши стволовых клеток и те подкладки слизистых поверхностей существуют в средах, которые испытывают снижение кислорода, включая гипоксия1,2,3,4. В нормальной физиологической государствах оксигенации меняется за гипоксии аноксии (полное отсутствие кислорода)5,6. Осознание что атмосферного кислорода отрицательно влияет на репликацию mammalian клетки, и что рост в пробирке клеток могут быть оптимизированы в условиях обедненного кислородом было сообщено в начале 1970-х годов. Рихтер и др. 7 показали, что 1-3% кислорода (гипоксии) повышение эффективности покрытия по сравнению с атмосферным кислородом (20%). Диплоидных клеток человека жизни также распространяется в условиях гипоксических культуры8.
В естественных условиях, гипоксических условий возникают, когда магазины кислорода обедненного (например, во время интенсивных физических упражнений), котором производства АТФ включен в скелетных мышцах от аэробного дыхания для ферментации (анаэробное дыхание) с конечный продукт молочная кислота9. Патологически, в раковой опухоли, интерьер опухоли масса гипоксических для анаэробных из-за плохой васкуляризации10. Эффект ограниченной перфузии на опухоль интерьеры независимо подтверждены опухоли интерьеры колонизирована облигатных анаэробов1. Механически, выживание клетки тумора в гипоксии считается исключительно зависит от экспрессии гена гипоксия индуцибельной фактор 1-альфа (HIF1-альфа), который является первоначальный спонтанной реакцией к гипоксии4,11 , 12. HIF1-альфа в гипоксических условиях индуцируется белков теплового шока, которые связывают HIF1-альфа-промоутер и upregulate транскрипции гена12. Предполагается, что эти белки теплового шока помощи в индукции различных фенотипов, видели в гипоксических микроокружения опухоли. Эти фенотипы exhibit выражение увеличение глюкозы транспортеров клеточной мембраны и интенсивность гликолиза (Варбург эффект)13. Результатом является переход от митохондриальной окислительного фосфорилирования в кислоты брожения.
Аноксии выживания может также использовать альтернативы глюкозы для поддержки выживания явление14,15. Наилучшим учился млекопитающих примером является землекоп, которые могут выжить в течение почти 20 минут без кислорода через фруктоза driven гликолитических ферментации путь14. Альтернативные адаптации происходит в некоторых рыб (например, карп [караси sp.], которые могут выжить в течение значительно дольше периоды времени, с использованием гликолиз с этанолом как субпродукт терминала)15. В обоих случаях ферментация диски метаболизма, позволяя выживания в отсутствие кислорода. Текущий гипотеза для анаэробных выживание является то, что так долго как HIF1-альфа активируется при гипоксии, митохондриальное дыхание, без необходимости для кислорода, происходит в анаэробных условиях16. Кроме того это постулируется, что использование ферментативным путь аноксии/гипоксии выживания улучшает выживания опухоли, поскольку клетки избежать Оксидативный стресс, который может оказаться пагубным для выживания клетки17. Этот постулат поддерживается недавнего исследования, которое показывает, что в кардиомиоцитов, гипоксия уменьшает окислительного стресса на клетки опухоли17.
На сегодняшний день, основополагающий характер ферментативным пути для выживания аноксии mammalian клетки было укоренилось в литературе, должным образом, в значительной степени, неспособность культуры mammalian клеток в условиях полного отсутствия кислорода для более чем 3 дней. Однако альтернативой гликолиз для анаэробных выживания происходит в бактерии. В некоторых бактерий азот или сульфат (среди других соединений) может служить акцепторами терминала электронов для системы цитохрома оксидазы в отсутствие кислорода18. Хотя параллельно бактерий и эукариот эволюции момента отхода от последнего общего предка универсальный, подсчитано, что митохондрии обеспечение энергии для клеток 1.542 миллионов лет до оксигенации океанов19 . Так как исследователи показали, что изолированных митохондриях может производить АТФ в отсутствие кислорода, с нитрита как терминал электрон акцептора, это разумно предположить, что клетки могут функционировать для периодов времени, более чем 3 дней в отсутствие кислорода 20 , 21 , 22 , 23. по методике, описанной в этом исследовании есть утилита для роста анаэробных mammalian клетки многочисленных клеточных линий.
Этот метод представляет впервые mammalian клеток, которые были культивировали для длительных периодов времени в отсутствие кислорода. Основываясь на текущих наблюдениях, аноксии роста потенциала через не ферментативную путь представляется универсальный среди mammalian клеток линий<sup cla…
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят Midwestern университета Управление по исследованиям и поддержке программ за их поддержку.
Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
50cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
FBS | VWR | 1500-500 | |
HBSS | VWR | 20-021-CV | |
trypsin | VWR | 25-052-CI | |
gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
paper towels | In House | ||
cell scraper | CellTreat | 229310 | |
PBS | In house prepared | ||
70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
pH meter | Jenway | 3510 | |
pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |