Одной капли цифровой полимеразной цепной реакции для комплексного и одновременного обнаружения мутаций в регионах Hotspot
Summary
Здесь мы представляем протокол точно определить несколько генетические изменения целевого региона в одном реакции с использованием высадки ddPCR и уникальный Пара зондов гидролиза.
Abstract
Капелька цифровой полимеразной цепной реакции (ddPCR) является высокочувствительным количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР) метод, основанный на фракционирование образца в тысячи индивидуальных реакций воды в нефти, нано размера. Недавно ddPCR стал одним из наиболее точных и чувствительных инструментов для циркулирующих опухолевые выявления ДНК (ctDNA). Одним из основных ограничений стандартного ddPCR техники является ограниченное количество мутаций, которые могут проверяться на реакции, которые требуются конкретные гидролиза зонды, признавая каждой возможной аллельные версии. Альтернативная методология, высадки ddPCR, повышает пропускную способность, так как он требует только одна пара зондов для выявления и количественной оценки потенциально все генетические изменения в целевом регионе. Высадки ddPCR отображает сопоставимых чувствительности обычных ddPCR анализов с преимуществом обнаружения большее количество мутаций в одной реакции. Он является экономически эффективным, экономит драгоценное образец материала и может также использоваться как инструмент для обнаружения при мутации не известны заранее.
Introduction
Были сообщения о1тысячи соматических мутаций, связанных с развитием рака. Среди них некоторые являются прогнозирования маркеры эффективности таргетная терапия 2,3 и генетический скрининг этих мутаций теперь обычной клинической практике. Капелька цифровая технология ПЦР (ddPCR) может использоваться для наблюдения за наличие или отсутствие мутации с высоким Определение точности и высоко совместим с неинвазивные жидкого биопсий4,5. Однако текущий ddPCR анализы предназначены прежде всего для выявления мутаций известный априори. Это серьезно ограничивает использование ddPCR как инструмент обнаружения, когда мутация неизвестен. Действительно в обычных ddPCR дизайн, гидролиз зонд, признавая аллеля дикого типа (WT зонд) конкурирует с конкретного ПЭП, признавая Мутантный аллель (MUT зонд) (рис. 1A). Зонд с более высокой аффинностью скрестил на шаблон и освобождает его Флюорофор, указывая на характер соответствующего аллеля. Флуоресценции данных, полученных для каждой капли могут быть визуализированы в точечной, представляющие испускаемых WT и MUT зондов в разных измерениях флуоресценции. Схематическое представление типичный результат для обычных ddPCR assay представлена на рисунке 1A. В этом примере синий облако соответствует капли, содержащие WT аллели, выявленные WT зонда, в то время как красные облака соответствует капель, в которых был усиленный и определены зонд MUT MUT аллеля. В зависимости от количества ДНК, загруженных в реакции двойной положительный капли, содержащие WT и MUT ампликонов может появиться (зеленый облако). Светло серый облако соответствует пустой капельки.
Поскольку большинство платформы позволяют для обнаружения ограниченное количество флуорофоров (обычно 2, но до 5), пропускная способность обычных ddPCR ограничен. Таким образом ориентация регионов с несколькими соседними мутации требует дизайн технически сложных мультиплекс ddPCR анализов или использование нескольких реакций, ориентации каждого мутация параллельно. Высадки ddPCR стратегии, преодолевает это ограничение, как он потенциально может обнаружить генетические изменения в пределах целевого региона, используя уникальную пару WT гидролиза зондов. Первый зонд (зонд 1) переплетами-переменной последовательности, прилегающих к целевого региона и второй зонд (зонд 2) дополняет WT последовательность целевого региона, где мутации являются ожидается (рис. 1B). В то время как первый зонд измеряет общее количество мы молекул в реакции, второй зонд дискриминирует WT и MUT аллели, субоптимальных гибридизации мутант последовательностей. Зонд 2 можно определить несколько типов мутаций в целевом регионе (один или несколько нуклеотидов замены, удаления и т.д.)6. Как и в обычных ddPCR светло серые облака соответствует капель, содержащих не молекул ДНК. Важно напомнить, что в этом типе пробирного, оптимальное разделение WT и MUT облака зависит количество ДНК, загруженных в реакции, так как капли, содержащие WT и MUT целевой аллели нельзя отличить от капель, содержащих только WT формы. Таким образом этот assay требует, что большинство капель содержат не более одной копии целевого гена.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для разработки эффективной высадки ddPCR assay, оптимизация имеет решающее значение, и протокол должен быть тщательно следили за. Каждая комбинация грунты и зонды имеет уникальную эффективность реакции PCR. Таким образом отдельные assay должно тщательно проверяться на контрольных образцах пе?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Institut Curie SiRIC (Грант инков-DGOS-4654). Авторы также хотел бы поблагодарить Каролин Hego за ее вклад в видео.
Materials
| K2EDTA tube (color code : lavender) | BD | 367863 | EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol) | Qiagen | 55114 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
| QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol) | Qiagen | 937556 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
| QIAsymphony SP system | Qiagen | 9001297 | fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification |
| QIAvac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA |
| QX100 or QX200 reader | Bio-Rad | 186-3003 or186-4003, respectively | The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector |
| QX100 or QX200 droplet generator | Bio-Rad | 186-3002 or 186-4002, respectively | Instrument used for droplet generation |
| C1000 thermal cycler | Bio-Rad | 1851196 | Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module |
| Plate sealer | Bio-Rad | 181-4000 | PX1™ PCR plate sealer |
| DG8 cartridge holder | Bio-Rad | 186-3051 | Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation |
| Droplet generator cartridges and gaskets | Bio-Rad | 186-4007 | Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation |
| PCR supermix | Bio-Rad | 186-3010 | ddPCR supermix for probes (no dUTP) |
| 96-well PCR plates | Eppendorf | 951020362 | 96-well semi-skirted plates |
| Foil seal | Bio-Rad | 181-4040 | Pierceable foil heat seal |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 186-3004 | oil used in the read |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad | 186-3005 | oil for droplet generation |
| DNA loBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 0030 108.051 | Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding |
| Multiplex I cfDNA Reference Standard Set | HORIZON | HD780 | The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations |
| QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500 | Life Technologies | Q32854 | The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer |
References
- Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
- Amado, R. G., Wolf, M., et al. Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).
- Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer. New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).
- Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -. F. Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective. Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).
- Saliou, A., Bidard, F. -. C., et al. Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions. Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).
- Decraene, C., Silveira, A. B., et al. Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR. Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).
- Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. Primer3–new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), e115 (2012).
- Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin. Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).
- Bidshahri, R., Attali, D., et al. Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).
- Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data. F1000Research. 5, (2016).
- Forbes, S. A., Beare, D., et al. COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution. Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).
