Singola goccia digitale Polymerase Chain Reaction per rilevazione completa e simultanea delle mutazioni nelle regioni di Hotspot

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per quantificare con precisione le alterazioni genetiche multiple di una regione di destinazione in una singola reazione usando drop-off ddPCR e un paio di idrolisi sonde uniche.

Abstract

Reazione a catena della polimerasi digitale gocciolina (ddPCR) è un metodo di reazione a catena (PCR) altamente sensibile della polimerasi quantitativa basato sul frazionamento del campione in migliaia di dimensioni nano reazioni individuali di acqua in olio. Recentemente, ddPCR è diventato uno degli strumenti più precisi e sensibili per la rilevazione di DNA (ctDNA) del tumore di circolazione. Uno dei principali limiti della tecnica standard ddPCR è il limitato numero di mutazioni che possono essere sottoposti a screening per reazione, come sonde specifiche idrolisi riconoscendo ogni possibile versione alleliche sono necessari. Una metodologia alternativa, il ddPCR di drop-off, aumenta il throughput, poiché richiede solo una singola coppia di sonde per rilevare e quantificare potenzialmente tutte le alterazioni genetiche dalla regione di destinazione. Drop-off ddPCR Visualizza sensibilità paragonabile ai saggi di ddPCR convenzionale con il vantaggio di rilevare un maggior numero di mutazioni in una singola reazione. È conveniente, conserva materiale prezioso campione e può essere utilizzato anche come strumento di scoperta, quando le mutazioni non sono noti a priori.

Introduction

Migliaia di mutazioni somatiche legate allo sviluppo del cancro è stati segnalati¹. Tra questi, alcuni sono marcatori predittivi dell'efficacia della terapia mirata ^2,3 e la selezione di queste mutazioni genetica è pratica clinica di routine in questo momento. Tecnologia digitale di PCR (ddPCR) della gocciolina può essere utilizzata per monitorare la presenza o l'assenza di mutazioni con elevata accuratezza ed è altamente compatibile con biopsie liquido invasivo^4,5. Tuttavia, la corrente ddPCR saggi sono progettati principalmente per rilevare mutazioni conosciute a priori. Questo limita fortemente l'uso di ddPCR come uno strumento di scoperta quando la mutazione è sconosciuta. Infatti, nella progettazione convenzionale ddPCR, una sonda di idrolisi riconoscendo l'allele wild-type (WT sonda) compete con una sonda specifica per riconoscere l'allele del mutante (MUT sonda) (Figura 1A). La sonda con maggiore affinità ibridizza con il modello e rilascia il fluoroforo, che indica la natura dell'allele corrispondente. I dati di fluorescenza ottenuti per ciascuna gocciolina possono essere visualizzati in un grafico a dispersione che rappresenta la fluorescenza emessa dalle sonde WT e MUT in diverse dimensioni. Una rappresentazione schematica di un risultato tipico per un dosaggio di ddPCR convenzionale è presentata in Figura 1A. In questo esempio, la nuvola blu corrisponde alle goccioline contenenti alleli WT identificati dalla sonda WT, mentre la nuvola rossa corrisponde a goccioline in cui l'allele MUT è stato amplificato e identificato dalla sonda MUT. A seconda della quantità di DNA caricato nella reazione, doppie positive goccioline contenenti sia WT e MUT ampliconi possono apparire (nuvola verde). La nuvola grigia luce corrisponde a goccioline vuote.

Poiché la maggior parte delle piattaforme consentono la rilevazione di un numero limitato di fluorofori (solitamente 2, ma fino a 5), velocità effettiva di ddPCR convenzionale è limitata. Targeting per regioni con mutazioni multiple adiacenti richiede pertanto, progettazione di tecnicamente impegnativi saggi multiplex ddPCR o l'utilizzo di reazioni multiple targeting ogni mutazione in parallelo. La strategia di ddPCR di drop-off, supera questa limitazione come potenzialmente può rilevare qualsiasi alterazione genetica all'interno di un'area di destinazione utilizzando un unico paio di WT idrolisi sonde. Le prime coperture di sonda (sonda 1) una sequenza non variabile, adiacente alla regione di destinazione e la seconda sonda (sonda 2) è complementare alla sequenza WT della regione di destinazione, dove le mutazioni sono attesi (Figura 1B). Mentre la prima sonda quantifica la quantità totale di molecole amplificabile nella reazione, la seconda sonda discrimina gli alleli WT e MUT tramite l'ibridazione sub-ottima alle sequenze mutanti. Sonda 2 può identificare diversi tipi di mutazioni in destinazione regione (sostituzioni nucleotidiche singole o multiple, cancellazione, ecc.)⁶. Come ddPCR convenzionale, la nuvola grigia luce corrisponde a goccioline non contenenti nessun molecole di DNA. È importante ricordare che in questo tipo di analisi, una ottimale separazione delle nuvole WT e MUT è dipenda dalla quantità di DNA caricato nella reazione, dal momento che le goccioline contenenti sia WT e MUT alleli di destinazione non possono essere distinto da goccioline contenenti solo il WT modulo. Pertanto, questo test richiede che la maggior parte delle goccioline contengono non più di una copia del gene mirato.

Protocol

Il protocollo presentato qui segue le linee guida di etica dell'Institut Curie. Tutti i campioni umani sono stati ottenuti da pazienti arruolati, previo consenso informato, in studi approvati dalla Institutional Review Board presso Institut Curie.

1. raccolta, conservazione di Plasma ed estrazione di DNA libero di sangue

Nota: Può essere utilizzato DNA Estratto da qualsiasi tipo di "tessuto" (ad es., fresco o formaldeide-fisso paraffina embedded tessuti (FFPE), cellule in campioni di cultura o di sangue). Qui, forniamo istruzioni dettagliate per la raccolta del sangue, del plasma isolamento e archiviazione ed estrazione di DNA (cfDNA) senza cellula.

1. Deposito di raccolta e del plasma del sangue (Figura 2B)
   1. Raccogliere campioni di sangue in provette con EDTA 7 mL. Due tubi si raccomanda di raccogliere circa 4 mL di plasma.
   2. Centrifugare le provette per 10 min a 820 x g all'interno di 3 h del tiraggio del sangue per separare i globuli rossi (RBC), globuli bianchi (WBC) e plasma. Il tempo tra il campionamento e la centrifugazione è fondamentale per ottenere alta qualità cfDNA (cioè, cfDNA non contaminato con DNA rilasciato dalla WBC).
   3. Attentamente dispensare il surnatante (plasma) utilizzando una pipetta da 1 mL senza toccare lo strato di WBC; circa 2 mL di plasma sono solitamente recuperato per provetta EDTA.
   4. Trasferire il plasma per provette da 2 mL e centrifugare le aliquote a 16.000 x g per 10 min a 15 ° C per rimuovere i detriti cellulari.
   5. Pipettare attentamente il surnatante (plasma) senza disturbare il pellet. Distribuire il plasma in provette criogeniche 2 mL e conservare a-80 ° C fino a quando necessario.
2. cfDNA estrazione (Figura 2B)
   Nota: Qui, presentiamo la procedura utilizzando il kit di estrazione manuale. Una versione automatizzata seguendo le istruzioni del produttore può essere eseguita anche per l'isolamento di cfDNA.
   1. Mettere 400 µ l di proteinasi K in una provetta da 50 mL. Aggiungere 4 mL di plasma (volume ordinariamente utilizzato) e 3,2 mL di tampone di lisi ACL (contenente 1,0 µ g vettore RNA) dal kit. Tappare la provetta e mescolare nel Vortex per 30 s per ottenere una soluzione omogenea. Incubare a 60 ° C per 30 min.
   2. Aggiungere 7,2 mL di tampone ACB (dal kit) MU per ottimizzare l'associazione degli acidi nucleici circolanti per la membrana di silice e mescolare nel Vortex per 15 – 30 s. Incubare la provetta per 5 minuti sul ghiaccio.
   3. Inserire la pompa del vuoto della colonna e l'estensione di 20 mL. Chiudere le posizioni non utilizzate per consentire l'aspirazione a vuoto.
   4. Applicare con cura la miscela ACB lisato-buffer in Ampliatore (brevemente il tubo per raccogliere il massimo di lisato-buffer ACB miscela centrifuga), accendere la pompa del vuoto e consentire il lisato di essere completamente disegnata attraverso le colonne. Rimuovere e gettare l'Ampliatore.
   5. Applicare 600 µ l di tampone ACW1 alla colonna. Quando buffer ACW1 ha disegnato attraverso la colonna, aggiungere 750 µ l tampone ACW2 e infine 750 µ l di etanolo (96 – 100%). Quindi, posizionare la colonna in una provetta pulita 2 mL e centrifugare a piena velocità (20.000 x g) per 3 minuti eliminare l'etanolo.
   6. Posizionare la colonna in un nuovo tubo di raccolta da 2 mL. Aprire il coperchio e incubare a 56 ° C per 10 minuti asciugare completamente la membrana.
   7. Posizionare la colonna in una provetta di associazione basso di DNA pulito 1,5 mL. Applicare attentamente 36 µ l di acqua RNAsi-libera con 0,04% di sodio azide (buffer AVE). Chiudere il coperchio e incubare a temperatura ambiente per 3 min.
   8. Centrifugare a piena velocità (20.000 x g) per 1 min eluire gli acidi nucleici e conservare a-20 ° C fino a quando necessario.
3. quantificazione di cfDNA
   Nota: cfDNA quantificazione viene eseguita con un fluorometro utilizzando il protocollo del produttore immediatamente dopo l'estrazione o scongelare i campioni a temperatura ambiente (TA), prima dell'uso. Evitare più cicli di gelo/disgelo.
   1. Usare l'analisi di alto-sensibilità secondo la quantità di cfDNA previsto, che di solito è inferiore a 100 ng/mL di plasma. cfDNA concentrazioni variano da 2-10 ng/mL per i donatori sani, ma possono essere alte come 100 ng/mL in pazienti con malattia metastatica.
   2. Assicurarsi che tutti i reagenti siano a RT e mescolano 199 µ l di tampone di diluizione fluorimetro con 1 µ l di colorante (200x) per reazione (numero N di campioni + 2 standard per calibrare il fluorimetro) per ottenere una soluzione di lavoro.
   3. Vortex la soluzione di cfDNA accuratamente per garantire omogeneità e centrifugare brevemente per raccogliere contenuti nella parte inferiore del tubo.
   4. Mix 5 µ l di ciascun campione di cfDNA con 195 µ l di soluzione di lavoro.
   5. Miscelare 10 µ l di ogni standard con 190 µ l di soluzione di lavoro.
   6. Vortice accuratamente tutte le provette per 2 – 3 s garantire omogeneità e centrifugare brevemente per raccogliere contenuti nella parte inferiore dei tubi.
   7. Incubare per 2 minuti al buio a RT.
   8. Leggere le provette nel fluorimetro, utilizzando la modalità di uscita 'ng / µ l'
   9. Calcolare la concentrazione finale in ng/mL di plasma come segue: ng / µ l x 36 (volume di eluato cfDNA) / 4 (volume di plasma estratto).

2. ddPCR sonda e disegno dell'iniettore (Figura 2A)

Nota: L'amplificazione delle molecole mirate nell'analisi della ddPCR di drop-off segue principi simili di qPCR. Ogni primer e la sonda è stato progettato con il software dedicato convenzionale Primer3⁷ (http://primer3.ut.ee/).

1. Disegno dell'iniettore
   1. Nella finestra Impostazioni generali, modificare 'concentrazione di cationi bivalenti' a 3.8, «concentrazione dei dNTP» 0,8 e ' mispriming/ripetizione Library' per l'organismo corretta.
   2. Nella finestra impostazioni di anticipo, modificare la 'Tabella dei parametri termodinamici' e la 'concentrazione salina formula' Santa Lucia 1998.
   3. Scegliere una T_m tra 55 e 70 ° C (con 50 mM per la concentrazione di sale e 300 nM per la concentrazione del oligonucleotide).
   4. Verificare la specificità dei primer utilizzando strumenti come PrimerBlast.
   5. Evitare le regioni che dispongono di strutture secondarie.
   6. Scegliere una sequenza che ha un contenuto di GC di 50 – 60%.
   7. Evitare ripetizioni del Gs e Cs più di 3 basi.
   8. Scegliere gli iniettori con Gs e Cs alla loro estremità 3' quando possibile.
   9. Assicurarsi che 3' estremità del primer accoppiati non significativo complementarità per evitare dimeri dell'iniettore. Ampliconi devono essere inferiore a 150 bp per amplificare in modo efficiente cfDNA (media dimensione è 170 bp⁸) e il DNA Estratto da FFPE, che è spesso frammentata.
2. Design della sonda
   Nota: Sonde di idrolisi sono etichettati con un reporter fluorescente all'estremità 5' e un quencher all'estremità 3'. Essi forniscono alta specificità, alto rapporto segnale-rumore e consentire il funzionamento in multiplex se necessario. Due canali gocciolina lettori sono compatibili con coloranti FAM e HEX o VIC, nonché analisi di FAM/HEX o FAM/VIC accoppiato sonde.
   1. Progettazione di idrolisi sonde complementari alla sequenza WT della regione di destinazione e la regione adiacente non variabile.
   2. Scegliere sonde che entrambi situati entro l'amplicone definito dalla coppia di primer precedentemente progettata. Sequenze dell'iniettore non possono coincidere con le sequenze di sonda, anche se essi possono sedere uno accanto a altro.
   3. Scegliere il filo che ha più Cs di Gs. sonde devono avere un contenuto di GC di 30-80%.
   4. Selezionare sonde che sono fra i 13 e i 30 nucleotidi di lunghezza. Sonde più lunghe tendono a mostrare maggiore fluorescenza di fondo perché la distanza tra il fluoroforo e il quencher colpisce tempra del reporter fluoroforo.
   5. Selezionare T_m delle sonde da 3 a 10 ° C superiore a T_m degli iniettori per garantire sonda idrolisi durante ricottura di primer ed estensione. Esaltatori di T_m si consigliano di raggiungere la necessaria T_m , mantenendo la sonda breve, come più breve sonde discriminano varianti di singolo nucleotide in modo più efficiente. Sonde non dovrebbero avere un G all'estremità 5' perché questo disseta il segnale di fluorescenza anche dopo idrolisi.
   6. Design drop-off sonde come segue: 5'-(VIC) -sequenza complementare di WT della regione mutata-(MGB NFQ)-3' e sonda come riferimento: 5'-(6-FAM) -sequenza complementare di una regione non variabile-(MGB NFQ)-3'. Sono possibili anche altre combinazioni del reporter/quencher.

3. ottimizzazione di ddPCR reazione (Figura 2A)

Nota: Controlli di DNA Wild-type e mutanti utilizzati in questo passaggio possono essere ottenuti da linee cellulari, campioni tumorali o standard di riferimento DNA commercialmente disponibili, ad esempio.

1. Eseguire una PCR convenzionale in un termociclatore utilizzando la funzionalità di gradiente termica per convalidare la specificità del prodotto della PCR amplificato da primer disegnati.
   1. Preparare una miscela di reazione PCR unica come descritto di seguito al punto 4.1 (senza sonde) su un modello di controllo del DNA di selvaggio-tipo per un minimo di 8 reazioni di avere almeno una reazione a temperatura.
   2. Eseguire l'amplificazione utilizzando il programma descritto al punto 4.3.2 e una gamma di temperature di ricottura intorno la temperatura di annealing teorica degli iniettori.
   3. Caricare i prodotti di PCR su un gel di agarosio al 3% per selezionare per ricottura temperature fornendo prodotti specifici.
2. Eseguire una serie di drop-off ddPCRs utilizzando i parametri descritti sopra, ma questa volta tra cui entrambe le sonde.
   1. Utilizzare 100% WT DNA, DNA MUT 100% e una miscela di WT e MUT DNA (per esempio 50% WT MUT/50%) per determinare le migliori condizioni per la netta separazione delle nuvole gocciolina WT e MUT.
   2. Scegliere un intervallo di temperature di ricottura sopra la temperatura impostata al punto 4.1.
   3. Selezionare la temperatura di ricottura che permette per rilevazione specifica di WT o MUT segnali quando usando il DNA di WT 100% o 100% del DNA MUT e migliore separazione delle nubi gocciolina WT e MUT.
   4. Concentrazioni nel tempo e primer/sonda di ricottura può essere regolato anche per migliorare la separazione delle nuvole e a diminuire il numero di goccioline con fluorescenza intermedio (effetto pioggia).
3. Valutare lo sfondo o il limite dello spazio in bianco (LOB) del dosaggio.
   1. Eseguire un minimo di 48 reazioni di ddPCR individuali drop-off con un controllo WT DNA utilizzando i parametri di ricottura e concentrazioni di primer/sonde selezionate in 3.2.
   2. Per ogni reazione, calcolare la frequenza dell'allele del mutante (MAF) come segue: (numero di mutante goccioline/numero di goccioline riempite) x 100.
      Nota: Tipo di dati LOB è definito come la media MAF di falsi positivi e associato SD da cui viene calcolato l'intervallo di confidenza 95% (95% CI). LOB = (media di falsi positivi MAF) + IC al 95%.
4. Valutare il limite di rilevabilità (LOD) del dosaggio.
   1. Eseguire drop-off ddPCR reazioni utilizzando diluizioni seriali del MUT DNA nel DNA di WT, con MAFs che vanno da 5% a 0,01% (≥ 8 replica a condizione). Utilizzare concentrazioni ricottura di parametri e primer/sonde selezionate in 3.2.
      Nota: Il LOD è definito come i più piccoli valori MAF per cui replica presenti valori medi e SD sopra il LOB (Vedi Decraene et al. ⁶ per maggiori dettagli).

4. ddPCR protocollo (Figura 2B)

Nota: Simile ai tradizionali ddPCR, il protocollo di ddPCR di drop-off consiste di 4 fasi: (i) PCR mescolare preparazione, (ii) gocciolina generazione, l'amplificazione di PCR (iii) e (iv) dati acquisizione.

1. Preparazione della miscela PCR
   1. Seguire le precauzioni standard, come ad esempio indossare guanti, utilizzando una cappa PCR pulita, le pipette pulite e RNasi, DNasi-free distillata acqua per evitare la contaminazione.
   2. Disgelo ed equilibrare i componenti di reazione a TA.
   3. Preparare 20 x mix di primer/sonde in acqua distillata, con primer a 18 µM ciascuna e sonde a 5 µM ciascuna.
   4. Per tutte le singole reazioni di PCR, preparare una miscela di esempio combinando 2 x ddPCR supermix (10 μL), 1 µ l di 20 x mix primer/sonde e fino a 10 ng DNA campione qsp 20 µ l di acqua distillata.
   5. Vortice la reazione mescolare accuratamente per garantire omogeneità e centrifugare brevemente per raccogliere contenuti nella parte inferiore del tubo prima dell'erogazione. Non esitate a ripetere questo passaggio per ciascuna miscela di reazione prima dell'uso.
2. Generazione di goccia
   1. Inserire la cartuccia di ddPCR e caricare 20 μL di miscela di reazione contenente campioni nei pozzetti centrali della cartuccia per la generazione di goccia (verde posizioni nella Figura 2B) usando una pipetta a 8 canali.
   2. Aggiungere 70 μL di generatore di olio goccia nei pozzetti fondo (gialli posizioni).
   3. Inserire la cartuccia, con una guarnizione, nel generatore di goccia; goccioline saranno prodotta nei pozzetti superiori della cartuccia (posizioni blu).
   4. Aspirare e dispensare lentamente e delicatamente (per evitare di tosatura) 40 μL delle goccioline dalle cartucce in una piastra PCR a 96 pozzetti. Utilizzare una pipetta multicanale per ottimizzare il trasferimento delle gocce.
3. Amplificazione di PCR
   1. Sigillare la piastra PCR finale con un foglio di alluminio utilizzando un foglio sigillante immediatamente dopo aver trasferito le goccioline per evitare l'evaporazione. Centrifugare brevemente la piastra per raccogliere contenuti presso il fondo dei pozzetti.
   2. Eseguire un'amplificazione di PCR convenzionale in un termociclatore usando il seguente programma: 95 ° C 10 min, 40 cicli di [94 ° C 30 s, convalidato ricottura T ° per 60 s], 98 ° C 10 min (rampa di 2,5 ° C/s). Include controlli con nessun input DNA e DNA wild-type (≥ 3 replicati) in ogni esecuzione.
   3. Quando completata l'esecuzione, centrifugare brevemente la piastra per raccogliere contenuti presso il fondo dei pozzetti.
4. Acquisizione dati
   1. Dopo l'amplificazione di PCR, utilizzare il lettore di gocciolina di contare PCR-positivi e goccioline di PCR-negativi, seguendo le istruzioni del produttore.
      Nota: Il lettore di gocciolina solitamente offre un sistema di rilevazione ottica a due colori compatibile con fluorofori FAM, VIC o HEX.

5. analisi dei dati (Figura 2 e Figura 3)

Nota: Le goccioline di PCR-positivi e negativi di PCR sono contati per fornire una quantificazione assoluta della MUT e gli alleli WT presso la regione di destinazione. Le goccioline assegnate vengono utilizzate per calcolare la MAF in ciascun pozzetto. Gocciolina quantificazione e analisi di drop-off le analisi possono essere eseguite utilizzando il pacchetto di ddPCR R (https://github.com/daattali/ddpcr) sviluppato da Attali e colleghi^9,10. Questo pacchetto di R classifica automaticamente le goccioline come vuoto, parte della "pioggia" (a causa di amplificazione inefficiente), o riempito con un segnale reale positivo (Figura 3). La seguente sezione che presenta le diverse fasi dell'analisi è una versione breve della vignetta descrittiva dell'algoritmo scritto dai suoi autori (Vedi algoritmo di https://github.com/daattali/ddpcr/blob/master/vignettes/. RMD per maggiori dettagli). I dati vengono esportati in file con valori delimitati da virgole (FileName_Amplitude.csv) e caricati nel pacchetto ddPCR per essere analizzati direttamente in R o tramite l'interfaccia web dedicata.

1. Rettifiche di parametro
   Nota: Ogni progetto di assay di drop-off risultati in distribuzioni specifiche gocciolina finale e variazioni nella forma di nube, separazioni o posizioni è da aspettarselo. Per garantire un'analisi automatizzata efficiente, un insieme di parametri deve essere regolato. Se un pozzo ha un profilo imprevisto, potrebbe causare l'analisi di tutta la piastra a fallire, risultante in un messaggio di errore. La problematica ben dovranno essere identificati e rimossi dall'analisi automatizzata.
   1. Identificare i pozzetti non riuscite utilizzando (REMOVE_FAILURES). Utilizzare TOTAL_DROPS_T (il valore predefinito è 5.000) per regolare il minimo numero di goccioline in ciascun pozzetto. Utilizzare EMPTY_LAMBDA_LOW_T (il valore predefinito è 0,3) ed EMPTY_LAMBDA_HIGH_T (il valore predefinito è 0,99) per regolare le metriche che valutano le nuvole previsto gocciolina (vuoto, MUT, WT) e la loro qualità.
      Nota: Avere troppi goccioline vuote è un segno che non c'era abbastanza amplificabile modello nella reazione.
   2. Identificare le goccioline di outlier utilizzando (REMOVE_OUTLIERS). Utilizzare TOP_PERCENT (valore predefinito è p = % 1) per regolare il top cento p di goccioline avendo il più alto valore del segnale in ogni dimensione di segnale (FAM, VIC/HEX) fuori di goccioline nell'intera piastra. Utilizzare CUTOFF_IQR (il valore predefinito è 5) per regolare la soglia di valore erratico di top cento p di segnale più alto.
   3. Identificare le goccioline vuote utilizzando (REMOVE_EMPTY). Utilizzare CUTOFF_SD (il valore predefinito è 7) per regolare la deviazione standard della distribuzione gaussiana (vuoto goccioline) inferiore dei valori sonda 1.
   4. Goccioline di cancello utilizzando (classificare). Utilizzare CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD (il valore predefinito è 3) per regolare la deviazione standard della distribuzione gaussiana (riempito goccioline) maggiore dei valori sonda 1. Utilizzare ADJUST_BW_MIN (il valore predefinito è 4) e ADJUST_BW_MAX (il valore predefinito è 20) per regolare i parametri k_min e k_max per stimare la densità del kernel dei valori sonda 2 e discriminare la MUT e la nube WT di goccioline.
      1. Utilizzare SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ (valore predefinito è p = % 1) e SIGNIFICANT_P_VALUE (il valore predefinito è s=0.01% livello di significatività) per classificare i pozzi come mutante o wildtype.
         Nota: In questo algoritmo, un mutante bene è definito come avendo una MAF che è statisticamente significativamente superiore p %.
2. Analisi automatizzata
   Nota: Per ogni parametro presentato in questa sezione, gli autori del pacchetto ddPCR R hanno proposto di default valori basati sulla loro esperienza e i relativi dati. Tuttavia, tutti i parametri possono essere modificati per aumentare la qualità dell'analisi (Figura 3).
   1. Identificare i pozzi non riuscite.
      1. Utilizzare quattro metriche di controllo di qualità (impostazioni: REMOVE_FAILURES) per identificare i pozzi non riuscite; il primo è il numero minimo di goccioline che dovrebbe contenere un pozzo. Gli altri tre concentrano sull'identificazione di popolazioni valido candidato per il vuoto, possibilmente FAM + e HEX + / VIC + goccioline. Rimuovere i pozzi che non soddisfano questi criteri da analisi a valle.
   2. Identificare le goccioline di outlier.
      1. Al fine di evitare la distorsione della gocciolina gating, rimuovere outlier (cioè, goccioline anormalmente alto valore HEX/VIC o FAM) da un'ulteriore analisi impostando una soglia limite superiore (impostazioni: REMOVE_OUTLIERS).
   3. Identificare le goccioline di vuote.
      1. Identificare le goccioline di vuote per ridurre la dimensione dei dati (in un tipico pozzo, essi rappresenteranno per la maggior parte delle goccioline) ed eliminare la discriminazione statistica a causa della presenza di una grande porzione di informazioni inutili come goccioline contenenti solo modello rimangono ( impostazioni: REMOVE_EMPTY).
   4. Eseguire gocciolina gating.
      1. Classificare le goccioline rimanenti come mutante, wildtype o pioggia (impostazioni: classificare).
   5. Identificare le goccioline della pioggia.
      1. Goccioline di pioggia risultano dalle amplificazione inefficiente, escludere dalla FAM + o HEX + / VIC + nuvole. Determinare i confini della loro cluster utilizzando i valori di sonda 1 (impostazione: CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD).
   6. Identificare il mutante contro le goccioline di selvaggio-tipo.
      1. Come il momento clou dell'analisi è discriminazione tra modelli mutante e wildtype, identificare tutte le goccioline rimanenti in questa fase come l'uno o l'altro. Poiché dovrebbero avere valori simili di sonda 1, utilizzare sonda 2 valori per meglio prevedere loro rispettiva natura (impostazioni: ADJUST_BW_MIN e ADJUST_BW_MAX).
   7. Classificare i pozzi come mutante contro il selvaggio-tipo.
      1. Dopo aver determinato che le goccioline sono MUT e WT, calcolare la MAF. Utilizzando la frequenza dei mutanti e il p-valore associato di ciascun pozzetto, è possibile classificarli (impostazioni: SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ, SIGNIFICANT_P_VALUE) come WT (contenente principalmente le goccioline WT) o pozzetti MUT (contenenti un numero statisticamente significativo di MUT goccioline).
3. Esplorare ed esportare i dati
   1. Esplorare ed esportare i dati come numero di goccioline, outlier, goccioline di vuote, le concentrazioni o grafici che possono essere ulteriormente personalizzate per una rappresentazione ottimale.

Representative Results

In uno studio di proof-of-concept, mutazioni di KRAS esone 2 (codoni 12 e 13) ed EGFR esone 19 delezioni sono stati studiati nei tessuti FFPE e campioni di plasma dai malati di cancro utilizzando il drop-off ddPCR strategia⁶.

La sonda di drop-off KRAS interrogato una regione di bp 16 comprendente più mutazioni nell'esone 2 del gene KRAS , che oltre il 95% delle mutazioni di KRAS note nei cancri umani¹¹del porto. La sonda di riferimento era 20 bp in lunghezza e trova 3 bp a valle. Per ottimizzare la nostra analisi, abbiamo usato il DNA Estratto da linee cellulari che contiene 2 degli aminoacidi più frequentemente mutati KRAS : G12V (c.35GT, SW480) e G13D (c.38GA, HCT 116).

Il dosaggio di drop-off EGFR è stato progettato per eseguire la scansione per tutte le cancellazioni di attivazione dell'EGFR esone 19. Il dosaggio utilizzato una sonda di 25 bp-lungo drop-off posizionata sopra la ricorrente regione cancellata insieme con una sonda di riferimento di 21 bp, trova 31 bp a valle nell'amplicone stesso. Per ottimizzare la nostra analisi, abbiamo usato un set standard di riferimento cfDNA tra cui l' EGFR esone 19 eliminazione c.2235_2249del, p.Glu746_Ala750del.

Sensibilità, specificità e posizione delle nubi di goccia sono stati definiti con campioni di controllo MUT e il DNA genomic WT PBMC come mostrato in Figura 4A per KRAS. Abbiamo inoltre dimostrato che questo tipo di analisi funziona su più tipi di alterazioni genetiche come singola sostituzione, più le sostituzioni o le eliminazioni (Figura 4B), così come sui vari tipi di campione⁶.

Figura 1: il drop-off ddPCR richiede un unico paio di idrolisi oligo-sonde a scansione tutte le mutazioni di una hotspot area. Analisi di progetti con un risultato schematico visualizzato come tracciati a dispersione bidimensionale che mostra l'intensità di fluorescenza della gocciolina. (A) ddPCR convenzionale con mutante (sonda MUT) e sonde di selvaggio-tipo (sonda WT) targeting esatta stessa regione. (B), il drop-off ddPCR contiene una sonda di riferimento (sonda 1) che si accoppia ad una regione non variabile e una sonda di drop-off (sonda 2) la regione mutata ma complementare alla sequenza WT, entro la stessa amplicon di targeting. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: flusso di lavoro ddPCR di drop-off per l'analisi di mutazione del DNA del plasma. Il flusso di lavoro completo è composto da 5 fasi principali: (A) (1) disegno di primer e sonde, (2) ottimizzazione del dosaggio, estrazione di isolamento e cfDNA (3) del plasma (B), (4) ddPCR eseguire e (C) (5) analisi dei dati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: analisi di drop-off ddPCR. Drop-off ddPCR analisi flusso di lavoro evidenziando i parametri più importanti che hanno bisogno di essere perfezionato. In questo modo efficiente identificazione automatica degli outlier, vuoto, pioggia o goccioline positive; assegnazione di goccioline MUT o WT e computing la MAF per ciascun pozzetto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Risultati rappresentativi - KRAS ed EGFR drop-off ddPCR saggi. (A) esempio di risultati ottenuti durante le fasi di ottimizzazione del dosaggio ddPCR drop-off. Rilevamento del mutante e/o DNA wild-type in una reazione contenente 100% MUT DNA, DNA MUT 5% ed il 100% WT DNA. (B) esempi di campioni di plasma analizzati con il KRAS ed EGFR drop-off ddPCR dosaggi risultati del rilevamento di singolo nucleotide e sostituzioni multiple in essone 2 di KRAS e un'omissione in essone 19 di EGFR . Questa figura è stata adattata da Decraene et al. ⁶. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Per progettare un'analisi ddPCR di consegna efficiente, ottimizzazione è fondamentale, e il protocollo deve essere seguito attentamente. Ogni combinazione di primer e sonde ha un unico efficienza di reazione di PCR. Pertanto, un'analisi individuale deve essere convalidato con attenzione su campioni di controllo prima di essere utilizzati su campioni di prova importante. Ottimizzazione e validazione sono importanti per certificare il rilevamento del segnale di picco e valutare la sensibilità e specificità. Come descritto nel protocollo, tutte le mutazioni che si trova in una regione di destinazione rientrano la "sonda 2" possono potenzialmente essere interrogate. Tuttavia, la convalida è consigliato per mutazioni situate alle estremità 5' o 3' di "sonda 2", dal momento che possono interessare l'efficienza del test drop-off.

Il metodo presentato qui può essere eseguito con DNA Estratto da qualsiasi tipo di "tessuto", compresi i tessuti FFPE, cellule in campioni di sangue o di cultura. Tuttavia, la qualità dell'estrazione dell'acido nucleico può influire notevolmente ddPCR risultati. Inibitori della PCR come eparina, proteine, EME, fenolo, proteasi, collagene, melanina, detergenti o sali devono essere eliminati il più possibile durante il campionamento e la procedura di purificazione. Anche se i campioni di DNA possono essere diluiti per ridurre l'impatto di inibitori della PCR sul ddPCR, diluizione diminuisce la sensibilità perché meno copie del target saranno testate per reazione. Questo dovrebbe essere preso in considerazione quando un certo livello di sensibilità è raggiungibile, come un minimo di copie deve essere testato.

DdPCR drop-off può essere applicato a molti tipi di alterazioni molecolari (sostituzioni nucleotidiche singole e multiple, le omissioni, ecc.). Oltre a utilizzare solo due sonde per rilevare tutte le alterazioni (aumentando così praticità ed economicità del dosaggio), drop-off ddPCR genera meno rumore di sfondo⁶ e Mostra una maggiore sensibilità rispetto ai saggi multiplex. Inoltre, poiché viene eseguita in una singola reazione, minime quantità di campioni dei pazienti vengono consumati. Questo test è particolarmente interessante nel contesto della biopsia liquida perché la quantità di ctDNA è spesso bassa in questi campioni.

Infatti, il metodo presentato qui è applicabile per la selezione di mutazione in materiale liquido-biopsia e ha già dimostrato la sua utilità per la pratica clinica (selezione di mutazione diESR1 nello studio clinico PADA-1 - NCT03079011). Tuttavia, è fondamentale utilizzare ampliconi più breve possibile in questo ambiente a causa della frammentazione di cfDNA⁸.

Caratterizzazione a valle deve ancora essere effettuata separatamente per identificare la mutazione esatta portata da alleli del mutante. Tuttavia, poiché le decisioni terapeutiche sono principalmente basate sullo stato mutazionale delle regioni hotspot di oncogeni indirizzabile (mutante di vs WT), la possibilità di drop-off ddPCR immediatamente identificare mutazioni lo rende un potente strumento diagnostico. Inoltre, la mutazione non ha bisogno di essere conosciuto aprioristicamente per progettare un'analisi in contrapposizione alle attuali soluzioni commerciali. Inoltre, drop-off ddPCRs combinabile con dosaggi specifici ddPCR convenzionale ad aumentare ulteriormente il numero di mutazioni schermati per (dati non mostrati). Infine, ddPCR drop-off può essere applicato ad altri campi di ricerca. In particolare, può risultare un utile strumento per lo screening di colonie positive negli esperimenti di modifica del genoma.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
K2EDTA tube (color code : lavender)	BD	367863	EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)	Qiagen	55114	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)	Qiagen	937556	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony SP system	Qiagen	9001297	fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification
QIAvac 24 Plus	Qiagen	19413	For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q33226	The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA
QX100 or QX200 reader	Bio-Rad	186-3003 or186-4003, respectively	The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector
QX100 or QX200 droplet generator	Bio-Rad	186-3002 or 186-4002, respectively	Instrument used for droplet generation
C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851196	Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module
Plate sealer	Bio-Rad	181-4000	PX1™ PCR plate sealer
DG8 cartridge holder	Bio-Rad	186-3051	Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation
Droplet generator cartridges and gaskets	Bio-Rad	186-4007	Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation
PCR supermix	Bio-Rad	186-3010	ddPCR supermix for probes (no dUTP)
96-well PCR plates	Eppendorf	951020362	96-well semi-skirted plates
Foil seal	Bio-Rad	181-4040	Pierceable foil heat seal
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	oil used in the read
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	oil for droplet generation
DNA loBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	0030 108.051	Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set	HORIZON	HD780	The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500	Life Technologies	Q32854	The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL
Qubit Assay Tubes	Life Technologies	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer