Vi præsenterer her, en protokol for at nøjagtigt kvantificere flere genetiske ændringer af et målområde i en enkelt reaktion ved hjælp af drop-off ddPCR og et unikt par hydrolyse sonder.
Droplet digital polymerase kædereaktion (ddPCR) er en meget følsomme kvantitative polymerase kædereaktion (PCR) metoden baseret på prøve fraktionering i tusindvis af nano-størrelse vand-i-olie individuelle reaktioner. For nylig, er ddPCR blevet et af de mest nøjagtige og følsomme værktøjer for cirkulerende tumor DNA (ctDNA) registrering. En af de store begrænsninger i standard ddPCR teknik er det begrænsede antal mutationer, der kan blive screenet pr. reaktion, som specifikke hydrolyse sonder anerkende hver muligt allel version er påkrævet. En alternativ metode, drop-off ddPCR, øger overførselshastighed, da det kræver kun et enkelt par sonder til at detektere og kvantificere potentielt alle genetiske ændringer i den målrettede region. Drop-off ddPCR viser sammenlignelige følsomhed for konventionelle ddPCR assays med fordelen ved påvisning af et større antal mutationer i en enkelt reaktion. Det er omkostningseffektiv, sparer dyrebare prøvemateriale og kan også bruges som en opdagelse værktøj, når mutationer ikke er kendt på forhånd.
Tusindvis af somatiske mutationer relateret til udviklingen af kræft har været rapporteret1. Blandt disse, nogle få er forprogrammeret markører for effekten af målrettede terapi 2,3 og genetisk screening af disse mutationer er nu rutinemæssig klinisk praksis. Droplet digital PCR (ddPCR) teknologi kan bruges til at overvåge tilstedeværelsen eller fraværet af mutationer med lang opdagelse nøjagtighed og er yderst kompatibel med non-invasiv likvide biopsier4,5. Nuværende ddPCR assays er dog primært beregnet til at påvise mutationer kendt på forhånd. Dette begrænser i høj grad brug af ddPCR som en opdagelse værktøj når mutationen er ukendt. Faktisk, i konventionelle ddPCR design, en hydrolyse sonde anerkende vildtypeallelen (WT sonde) konkurrerer med en bestemt probe anerkende den mutante allel (MUT sonde) (figur 1A). Sonden med højere affinitet hybridiserer til skabelonen og frigiver sin fluorophore, med angivelse af arten af den tilsvarende allel. Fluorescens oplysningerne for hver dråbe kan visualiseres i en scatter plot der repræsenterer fluorescens udledes af WT og MUT sonderne i forskellige dimensioner. En skematisk fremstilling af en typisk resultat for en konventionel ddPCR assay er præsenteret i figur 1A. I dette eksempel svarer blue sky til dråber indeholdende WT alleler identificeret ved WT sonden, mens den røde Sky svarer til dråber som MUT allel er blevet forstærket og identificeret af MUT sonden. Afhængigt af mængden af DNA indlæst i reaktionen, kan dobbelt positive dråber indeholdende både WT og MUT amplikoner vises (grøn Sky). Lys grå Sky svarer til tomme dråber.
Da de fleste platforme giver mulighed for påvisning af et begrænset antal fluorophores (normalt 2, men op til 5), er overførsel af konventionelle ddPCR begrænset. Derfor kræver rette sig mod regioner med flere tilstødende mutationer design af teknisk udfordrende multiplex ddPCR assays eller brug af flere reaktioner rettet mod hver enkelt mutation i parallel. Drop-off ddPCR strategi, overvinder denne begrænsning, som det kan potentielt afsløre genetiske ændring inden for et målområde ved hjælp af en unik WT hydrolyse sonder. De første sonde (sonde 1) dækker en ikke-variable sekvens, støder op til regionen mål og den anden sonde (sonde 2) er et supplement til WT sekvens af regionen mål hvor mutationer er forventet (figur 1B). Mens den første sonde kvantificerer det samlede beløb for amplifiable molekyler i reaktionen, diskriminerer den anden sonde WT og MUT alleler af sub-optimale hybridisering til mutant sekvenser. Sonden 2 kan identificere flere typer af mutationer i target region (enkelt eller flere nukleotid erstatninger, sletning, etc.)6. Som i konventionelle ddPCR svarer lys grå sky til dråber indeholder ingen DNA molekyler. Det er vigtigt at erindre, at i denne type analyse, optimal adskillelse af WT og MUT skyer er afhængig af mængden af DNA indlæst i reaktionen, da dråber indeholdende både WT og MUT target alleler ikke kan skelnes fra dråber indeholder kun WT form. Denne analyse kræver derfor, at de fleste dråber indeholder mere end én kopi af målrettede genet.
For at designe en effektiv drop-off ddPCR analyse, optimering er afgørende, og protokollen skal følges nøje. Hver kombination af primere og sonder har en unik PCR reaktion effektivitet. Således har en individuel analyse skal valideres omhyggeligt på kontrolprøver inden det anvendes på værdifulde prøveemner. Optimering og validering er vigtigt at certificere peak signal detection og vurdere specificiteten og følsomheden. Som beskrevet i protokollen, kan alle mutationer i et målområde, er omfattet af “sonde 2” …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Institut Curie SiRIC (grant Inka-DGOS-4654). Forfatterne ønsker også at takke Caroline Hego for hendes bidrag til videoen.
K2EDTA tube (color code : lavender) | BD | 367863 | EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample |
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol) | Qiagen | 55114 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol) | Qiagen | 937556 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
QIAsymphony SP system | Qiagen | 9001297 | fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification |
QIAvac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously |
Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA |
QX100 or QX200 reader | Bio-Rad | 186-3003 or186-4003, respectively | The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector |
QX100 or QX200 droplet generator | Bio-Rad | 186-3002 or 186-4002, respectively | Instrument used for droplet generation |
C1000 thermal cycler | Bio-Rad | 1851196 | Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module |
Plate sealer | Bio-Rad | 181-4000 | PX1™ PCR plate sealer |
DG8 cartridge holder | Bio-Rad | 186-3051 | Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation |
Droplet generator cartridges and gaskets | Bio-Rad | 186-4007 | Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation |
PCR supermix | Bio-Rad | 186-3010 | ddPCR supermix for probes (no dUTP) |
96-well PCR plates | Eppendorf | 951020362 | 96-well semi-skirted plates |
Foil seal | Bio-Rad | 181-4040 | Pierceable foil heat seal |
ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 186-3004 | oil used in the read |
Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad | 186-3005 | oil for droplet generation |
DNA loBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 0030 108.051 | Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding |
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set | HORIZON | HD780 | The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations |
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500 | Life Technologies | Q32854 | The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL |
Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer |