Één druppel digitale Polymerase-kettingreactie voor alomvattende en gelijktijdige detectie van mutaties in Hotspot regio 's
Summary
Hier presenteren we een protocol om meerdere genetische wijzigingen van een target gebied in een enkele reactie drop-off ddPCR met een unieke combinatie van hydrolyse sondes nauwkeurig te kwantificeren.
Abstract
Druppel digitale polymerase-kettingreactie (ddPCR) is een zeer gevoelige kwantitatieve polymerase kettingreactie (PCR) methode gebaseerd op monster fractionering in duizenden nano-sized water-in-olie individuele reacties. Onlangs, ddPCR is uitgegroeid tot een van de meest nauwkeurige en gevoelige instrumenten voor circulerende tumor (ctDNA) DNA detectie. Een van de belangrijkste beperkingen van de standaard ddPCR-techniek is het beperkte aantal mutaties die kan worden gescreend per reactie, zoals specifieke hydrolyse sondes herkennen van elke mogelijke allèlique versie nodig zijn. Een alternatieve methode, de drop-off ddPCR, verhoogt de doorvoer, omdat het vereist slechts een paar van sondes voor het detecteren en kwantificeren van potentieel alle genetische veranderingen in het gerichte gebied. Drop-off ddPCR toont vergelijkbare gevoeligheid aan conventionele ddPCR testen met het voordeel van het opsporen van een groter aantal mutaties in een enkele reactie. Het is rendabel, conserveert kostbare monstermateriaal, en kan ook worden gebruikt als een ontdekkingshulpmiddel mutaties zijn niet bekend een priori.
Introduction
Duizenden van somatische mutaties die betrekking hebben op kankerontwikkeling zijn gerapporteerde1. Daaronder een paar zijn voorspellende markers van de werkzaamheid van gerichte therapie 2,3 en genetische screening van deze mutaties is nu gangbare klinische praktijk. Droplet-technologie voor digitale PCR (ddPCR) kan worden gebruikt om te controleren op de aanwezigheid of de afwezigheid van mutaties met weetje speurder nauwkeurigheid en is zeer compatibel met niet-invasieve vloeibare biopsieën4,5. Huidige ddPCR testen zijn echter voornamelijk ontworpen om mutaties bekend een prioridetecteren. Dit beperkt ernstig het gebruik van ddPCR als een ontdekkingshulpmiddel wanneer de mutatie onbekend is. Inderdaad, in het ontwerp van de conventionele ddPCR, een sonde van de hydrolyse herkennen van het wild-type allel (WT sonde) concurreert met een specifieke sonde herkennen de mutant allel (MUT sonde) (figuur 1A). De sonde met hogere affiniteit aan de sjabloon hybridizes en haar fluorophore, met vermelding van de aard van de overeenkomstige allel releases. De gegevens van de fluorescentie verkregen voor elke druppel kunnen worden gevisualiseerd in een scatterplot vertegenwoordigen de fluorescentie die wordt uitgestoten door de WT en MUT sondes in verschillende dimensies. In figuur 1Ais een schematische weergave van een typisch resultaat voor een conventionele ddPCR assay gepresenteerd. In dit voorbeeld, de blauwe wolk komt overeen met de druppels met WT allelen geïdentificeerd door de WT sonde, overwegende dat de rode wolk correspondeert met druppels waarin de MUT-allel is versterkt en geïdentificeerd door de MUT-sonde. Afhankelijk van de hoeveelheid DNA geladen in de reactie, dubbele positieve druppels met zowel WT en MUT waarbij kunnen worden weergegeven (groene wolk). De licht grijze wolk komt overeen met lege druppels.
Aangezien de meeste platformen toestaan voor de detectie van een beperkt aantal fluorophores (meestal 2, maar maximaal 5), is doorvoer van conventionele ddPCR beperkt. Targeting van regio’s met meerdere aangrenzende mutaties vereist daarom ontwerp van technisch uitdagende multiplex ddPCR testen of het gebruik van meerdere reacties gericht op elke mutatie in parallel. De drop-off ddPCR strategie, overwint deze beperking zoals het potentieel kan detecteren elke genetische wijziging binnen de regio van een doel met behulp van een uniek paar WT hydrolyse sondes. De eerste sonde (sonde 1) omvat die een reeks van de niet-variabele, grenzend aan de target-regio en de tweede sonde (sonde 2) is een aanvulling op de WT-volgorde van de doel-regio waar de mutaties zijn verwacht (figuur 1B). Terwijl de eerste sonde de totale hoeveelheid amplifiable moleculen in de reactie kwantificeert, discrimineert de tweede sonde WT en MUT allelen door suboptimale hybridisatie aan mutant sequenties. Sonde 2 herkent meerdere soorten mutaties in de regio (enkelvoudige of meervoudige nucleotide vervangingen, verwijdering, enz.) van doelstelling6. Zoals in conventionele ddPCR correspondeert de licht grijze wolk druppels met geen DNA-moleculen. Het is belangrijk eraan te herinneren dat in dit type van test, optimale scheiding van WT en MUT wolken afhankelijk van de hoeveelheid DNA geladen in de reactie is, omdat druppels met zowel WT en MUT doel allelen niet kunnen worden onderscheiden van druppels met alleen de WT formulier. Deze test vereist daarom bevatten de meeste druppels niet meer dan één exemplaar van de gerichte gen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor het ontwerpen van een efficiënte drop-off ddPCR assay, optimalisatie is cruciaal, en het protocol moet zorgvuldig worden gevolgd. Elke combinatie van primers en sondes heeft een unieke PCR reactie efficiëntie. Een afzonderlijke bepaling moet dus zorgvuldig worden gevalideerd op controlemonsters alvorens te worden gebruikt op waardevolle proefmonsters. Optimalisatie en validatie zijn belangrijk voor het certificeren van piek signaal detectie en beoordelen van de gevoeligheid en specificiteit. Zoals beschreven in he…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door Institut Curie SiRIC (grant INCa-DGOS-4654). De auteurs bedank ook Caroline Hego voor haar bijdrage aan de video.
Materials
| K2EDTA tube (color code : lavender) | BD | 367863 | EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol) | Qiagen | 55114 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
| QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol) | Qiagen | 937556 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
| QIAsymphony SP system | Qiagen | 9001297 | fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification |
| QIAvac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA |
| QX100 or QX200 reader | Bio-Rad | 186-3003 or186-4003, respectively | The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector |
| QX100 or QX200 droplet generator | Bio-Rad | 186-3002 or 186-4002, respectively | Instrument used for droplet generation |
| C1000 thermal cycler | Bio-Rad | 1851196 | Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module |
| Plate sealer | Bio-Rad | 181-4000 | PX1™ PCR plate sealer |
| DG8 cartridge holder | Bio-Rad | 186-3051 | Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation |
| Droplet generator cartridges and gaskets | Bio-Rad | 186-4007 | Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation |
| PCR supermix | Bio-Rad | 186-3010 | ddPCR supermix for probes (no dUTP) |
| 96-well PCR plates | Eppendorf | 951020362 | 96-well semi-skirted plates |
| Foil seal | Bio-Rad | 181-4040 | Pierceable foil heat seal |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 186-3004 | oil used in the read |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad | 186-3005 | oil for droplet generation |
| DNA loBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 0030 108.051 | Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding |
| Multiplex I cfDNA Reference Standard Set | HORIZON | HD780 | The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations |
| QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500 | Life Technologies | Q32854 | The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer |
References
- Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
- Amado, R. G., Wolf, M., et al. Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).
- Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer. New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).
- Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -. F. Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective. Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).
- Saliou, A., Bidard, F. -. C., et al. Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions. Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).
- Decraene, C., Silveira, A. B., et al. Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR. Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).
- Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. Primer3–new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), e115 (2012).
- Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin. Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).
- Bidshahri, R., Attali, D., et al. Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).
- Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data. F1000Research. 5, (2016).
- Forbes, S. A., Beare, D., et al. COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution. Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).
