Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

نقل الاجنه طفيف التوغل والتزجيج الجنيني في مرحله الجنين الأمثل في نموذج الأرنب

doi: 10.3791/58055 Published: May 16, 2019

Summary

وتجري تقييمات مستمرة لتقنيات الإنجاب المساعدة (الفنون) لتحسين النتائج والحد من المخاطر المرتبطة بها. تصف هذه المخطوطة اجراء لنقل الاجنه بالحد الأدنى من التوغل مع بروتوكول فعال للحجز بالتبريد يسمح باستخدام الأرانب كنموذج حيواني مثالي لتكاثر البشر.

Abstract

وتؤثر تقنيات الإنجاب المساعدة (الفنون) ، مثل ثقافة الاجنه في المختبر أو التجميد الجنيني ، علي أنماط التنمية الطبيعية التي تترتب عليها عواقب ما قبل الولادة وبعدها. لضمان البراءة من التطبيقات الفنية ، والدراسات في النماذج الحيوانية ضرورية. الاضافه إلى ذلك ، وكخطوه أخيره ، تتطلب دراسات تنميه الاجنه تقييم قدرتها علي تطوير نسل صحي كامل الأجل. هنا ، لا غني عن نقل الاجنه إلى الرحم للقيام بأي تجربه ذات صله بالفنون.

وقد استخدم الأرنب كنموذج الكائن الحي لدراسة تكاثر الثدييات لأكثر من قرن. بالاضافه إلى قربها الوراثي للأنواع البشرية وحجمها الصغير وتكلفه صيانتها المنخفضة ، فان لها خصائص انجابيه مهمة مثل الاباضه المستحثة ، والتسلسل الزمني للتطور الجنيني المبكر علي غرار البشر والحمل القصير التي تسمح لنا لدراسة عواقب تطبيق الفن بسهوله. وعلاوة علي ذلك ، يتم تطبيق الفنون (مثل حقن السائل المنوي داخل الجنين ، وثقافة الاجنه ، أو التجميد) مع الكفاءة المناسبة في هذا النوع.

باستخدام تقنيه نقل الاجنه بالمنظار وبروتوكول الحفظ بالتبريد المقدمة في هذه المقالة ، ونحن وصف 1) كيفيه نقل الاجنه من خلال تقنيه سهله وطفيفه التوغل و 2) بروتوكول فعال للتخزين علي المدى الطويل من الأرنب الاجنه لتوفير القدرات اللوجستية المرنة الوقت والقدرة علي نقل العينة. وتشير النتائج التي تم الحصول عليها بعد نقل أجنه الأرانب في مراحل تنموية مختلفه إلى ان المستنقع هو المرحلة المثالية لشفاء ونقل أجنه الأرانب. التالي ، فانه يلزم نقل الاجنه الجنينية ، مما يبرر العملية الجراحية. وعلاوة علي ذلك ، يتم بنجاح المزجج الأرنب الاجنه ومنظار نقلها ، مما يثبت فعاليه التقنيات الموصوفة.

Introduction

وبهدف تجاوز العقم البشري أو تحسين نشر الماشية ذات القيمة الجينية العالية والحفاظ علي الموارد الوراثية الحيوانية ، فان مجموعه من التقنيات تسمي مجتمعه تكنولوجيات الإنجاب المساعدة ، مثل الاباضه الفائقة ، في تم تطوير الإخصاب الأنبوبي ، وثقافة الاجنه ، أو التجميد ،1،2. حاليا ، يتم إعطاء العلاجات الهرمونية لتحفيز المبيضين وإنتاج عدد كبير من بصيلات المبيض عدد الجريبات الغاريه1. البويضات التي يتم جمعها من هذه البصيلات يمكن نضجها ، المخصبة ، وتطويرها في المختبر حتى يتم اما بالتبريد أو نقلها إلى الأمهات البديلة3. ومع ذلك ، خلال هذه العلاجات ، ويتعرض الامشاج و تخليق ملقح لسلسله من العمليات غير الفسيولوجية التي يمكن ان تتطلب التكيف الجنين للبقاء علي قيد الحياة في هذه الظروف4،5. هذا التكيف هو ممكن بسبب اللدونة الجنين في وقت مبكر ، والذي يسمح التغييرات الجنينية في التعبير الجيني والبرمجة التنموية6. ومع ذلك ، يمكن ان تؤثر هذه التعديلات علي المراحل اللاحقة من تطور الجنين حتى سن الرشد ، ومن المقبول علي نطاق واسع الآن ان الأساليب والتوقيت وإجراءات التجميد أو الظروف الثقافية تظهر نتائج مختلفه علي مصير الجنين7 , 8. لذلك ، لتوضيح الآثار المستحثة محدده من الفنون ، واستخدام نماذج الحيوانية تتميز جيدا لا مفر منه.

وقد حدثت أول ولادة حيه موثقه ناتجه عن نقل أجنه ثدييه في ال18909. اليوم ، نقل الاجنه (ET) إلى انثي بديله هو خطوه حاسمه في دراسة الآثار الناجمة عن الفن خلال مرحله ما قبل الغرس علي مراحل تطوير الاجنه اللاحقة10. تقنيات ET تعتمد علي حجم والهيكل التشريحي لكل الحيوانية. وفي حاله النماذج الحيوانية الكبيرة الحجم ، كان من الممكن القيام بعمليات ET عن طريق تقنيات ET غير جراحيه لعنق الرحم ، ولكن في قسطرة الأنواع الأصغر حجما من عنق الرحم هي أكثر تعقيدا وتستخدم التقنيات الجراحية في كثير من الأحيان11. ومع ذلك ، يمكن ان يسبب الجراحة ET نزيف التي يمكن ان تضعف زرع ونمو الجنين ، والدم يمكن ان تغزو تجويف الرحم ، مما تسبب في وفاه الجنين10. ولا تزال التقنيات غير الجراحية عبر عنق الرحم تطبق في البشر ، والبالونات ، والأبقار ، والخنازير والفئران12،13،14، 15،16،17، ولكن الجراحية لا تزال تستخدم ETs في أنواع مثل الماعز والأغنام أو الحيوانية الأخرى التي تمثل صعوبات اضافيه10،18،19،20،21، مثل الأرانب (اثنين الاجهزه المستقلة) أو الفئران (حجم صغير). ومع ذلك ، تميل أساليب النقل الجراحية تدريجيا إلى استبدالها بطرق اقل الغازية. واستخدم التنظير الباطني لنقل الاجنه ، علي سبيل المثال ، في الأرانب والخنازير والتاملات الصغيرة18و19و20. ويمكن استخدام هذه الطرق التنظير طفيف التوغل لنقل الاجنه في أمبول عن طريق infundibulum ، وهو أمر ضروري في الأرانب وأظهرت اثار مفيده في بعض الأنواع20. ويستند هذا إلى اهميه الحوار الصحيح بين الجنين والام خلال مراحل الاجنه المبكرة في القناة. وكما ذكر أعلاه ، فان أعاده عرض الاجنه التي تجري في الأرانب اثناء هجره الاجنه من خلال القناة الهوائية ضرورية لتحقيق الاجنه القادرة علي زرع22،23.

نماذج الحيوانية أكبر حجما ، مثل الأبقار ، هي مثيره للاهتمام لان السمات البيوكيميائية وما قبل الغرس مماثله لتلك الموجودة في الأنواع البشرية24. ومع ذلك ، الحيوانية الكبيرة مكلفه للغاية لاستخدامها في التجارب الاوليه ، وتعتبر القوارض نموذجا مثاليا (76 ٪ الكائنات الحية النموذجية هي القوارض) للبحوث المختبرية25. ومع ذلك ، فان نموذج الأرنب يوفر بعض المزايا علي القوارض في الدراسات الانجابيه ، كما ان بعض العمليات البيولوجية الانجابيه التي عرضها البشر هي أكثر تشابها في الأرانب من تلك الموجودة في الفئران. الإنسان والأرانب تقديم مماثله الوراثية الجنينية تنشيط الجينوم ، والذواقة وبنيه المشيمة الأرقاء. الاضافه إلى ذلك ، باستخدام الأرانب فمن الممكن ان نعرف التوقيت الدقيق للإخصاب ومراحل الحمل بسبب الاباضه المستحثة25. الأرنب دورات الحياة قصيرة ، واستكمال الحمل في 31 يوما والوصول إلى سن البلوغ في حوالي 4-5 أشهر ؛ الحيوانية من السهل التعامل معها بسبب سلوكها المنصاع وغير العدواني ، وصيانتها اقتصاديه جدا بالمقارنة مع حساب الأكبر من الماشية. وعلاوة علي ذلك ، من المهم ان نذكر ان الأرانب لديها الرحم المزدوج مع اثنين من cervixes مستقله11،25. هذا يضع الأرنب في وضع تفضيلي ، كما يمكن نقل الاجنه من المجموعات التجريبية المختلفة إلى نفس الحيوانية ، ولكن في قرن الرحم مختلفه. وهذا يتيح لنا مقارنه كل من الآثار التجريبية ، والحد من عامل الامومه من النتائج.

اليوم ، غير الجراحية أساليب ET ليست في استخدامها في الأرنب. بعض الدراسات التي أجريت في أواخر 90s باستخدام تقنيه ET عبر عنق الرحم أسفرت عن انخفاض معدلات التسليم تتراوح بين 5.5 ٪ إلى 20.0 ٪11،26 مقابل 50-65 ٪ من الطرق الجراحية ، من بينها اجراء تنظير البطن الموصوفة من قبل Besenfelder و Brem18. معدلات النجاح المنخفضة لهذه الطرق غير الجراحية ET في الأرانب تتزامن مع عدم وجود أعاده عرض الاجنه اللازمة في القناة ، والتي يتم تجنبها في الناقلات العنقية. هنا ، ونحن وصف فعاله الحد الأدنى من الجراحة بالمنظار ET الاجراء باستخدام الأرانب كنموذج الكائن الحي. هذا الأسلوب يوفر نموذجا لمزيد من البحوث الانجابيه في الحيوانية الكبيرة والبشر.

لان الأرانب لديها نافذه زمنيه ضيقه بشكل خاص لغرس الاجنه ، ET في هذا النوع يتطلب درجه عاليه من التزامن بين المرحلة التنموية للجنين في ET والوضع الفسيولوجي للمستلم27. في بعض الحالات ، بعد العلاج التناسلي الذي يبطئ نمو الجنين (مثل الثقافة الانبوبيه) أو يغير من تقبل بطانة الرحم (مثل علاجات الاباضه) ، لا يوجد تزامن بين الجنين ورحم الام. ويمكن ان تؤثر هذه الحالات سلبا علي النتيجة. للرد في هذه السياقات ، ونحن وصف الفعالة الأرنب مورلي التزجيج البروتوكول الذي يسمح لنا لوقفه ، وتنظيم واستئناف التجارب. وهذه العملية مستصوبه من النواحي اللوجستية للدراسات الانجابيه وتتيح لنا القدرة علي تخزين الاجنه علي المدى الطويل ، مما يسمح بنقلها. الاجراء بالمنظار واستراتيجيات الحفظ بالتبريد تسمح بتخطيط أفضل للدراسات مع عدد اقل من الماشية. التالي ، فان منهجيتنا توفر مزايا صحية واقتصاديه وتتوافق مع مفهوم 3Rs (الاستبدال والتخفيض والصقل) للبحوث الحيوانية مع الهدف المعلن لتحسين العلاج البشري للحيوانات التجريبية. وهكذا ، مع هذه الأساليب ، والأرانب تشكل كائن نموذجي مثالي لاختبارات التكاثر في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت جميع الإجراءات التجريبية المستخدمة في هذه الدراسة وفقا للتوجيه 2010/63/EU EEC للتجارب الحيوانية واستعرضتها ووافقت عليها اللجنة الاخلاقيه لتجريب الماشية في الجامعة الvalènciaه ، اسبانيا (قانون البحث: 2015/VSC/PEA/00170). XGD ، FMJ ، MPVC و JSV يحمل شهادة تفويض صادره عن الاداره الحكومية بلنسية لتجربه علي الحيوانية. ويؤذن ل XGD في الموقع بالاشراف علي رعاية ورعاية الماشية اثناء التجربة.

1. نقل الاجنه

  1. اعداد الإناث المستفيدات
    1. استخدام الإناث الناضجة جنسيا فقط (> 4.5 أشهر من العمر).
    2. قبل أسبوع واحد من ET ، وتكييف الإناث إلى 16 ح الضوء/8 ح النظام المظلم لبدء نمو جرابي وتعزيز تقبل الإناث.
    3. حدد الإناث المتلقية ، ومراقبه العمق واللون من الفرج. إذا كان الفرج هو العكر والمحمر ، والأنثى تقبلا.
    4. الحمل بالورم الكاذب (الاباضه) من خلال حقنه عضلية واحده من 1 ميكروغرام من خلات بوسريلين (التناظرية الاصطناعية من هرمون الإفراج عن تروج) بغض الجسم عن وزنه.
      ملاحظه: عاده ، 0.8 ميكروغرام هو جرعه مناسبه لتحريض الاباضه في الأرانب متوسطه الحجم (4-5 كجم) ، لذلك 1 ميكروغرام يضمن عموما الاباضه.
    5. حمل الاباضه قبل أيام عديده كعمر الاجنه ليتم نقلها (علي سبيل المثال ، 70-72 h قبل الطازجة مورلي ET).
  2. التخدير والتسكين
    1. تزن الأرنب وتحميل التخدير والمسكنات التالية.
      1. في حقنه 1 مل مع ابره 30G: تحميل اكسيليازين (5 مغ/كغ) وبوبرينورفين هيدروكلوريد (0.03 ملغ/كغ). في حقنه أخرى 1 مل مع ابره بيريكرانيال 23G, تحميل هيدروكلوريد الكيتامين (35 مغ/كغ).
    2. امسكي الأرنب واحقني خليط الزيازين-البوبرينورفين عضل.
    3. ادخل ابره بيريكرانيال مع الكيتامين في وريد الاذن الحديه ، ببطء إدخال جميع محتويات حقنه عن الوريد.
    4. إصلاح الابره وتركها ادراجها في جميع انحاء الخطوات المتبقية لأداره المزيد من التخدير إذا لزم الأمر.
    5. ترك الأرنب في القفص (نظيفه ودون اي الأخرى الحيوانية) في مرحله دافئه.
    6. مره واحده فاقد الوعي ، وتطبيق مرهم العين لتجنب جفاف العين والتحقق من عدم وجود freflex جفني.
      ملاحظه: هذا البروتوكول يوفر التخدير الجراحي الطائرة لمده لا تقل عن 30 دقيقه. إذا كان مطلوبا وقتا أطول, حقن جرعات اضافيه مع نصف كميه من هيدروكلوريد الكيتامين وصفها في 1.2.1 بعد 30 دقيقه.
    7. راقب عمق التخدير عن طريق التحقق من الدواسة المنعكسة وحركه التنفس. تشير التغيرات في نمط التنفس إلى معدل غير منتظم وأسرع إلى فقدان المستوي المناسب من التخدير.
    8. مراقبه لون الاغشيه المخاطية (العينين والشفتين ، الخ) ، ومعدل التنفس (30-60 الأنفاس في الدقيقة الواحدة) ، ومعدل ضربات القلب (120-325 نبضه في الدقيقة) ودرجه الحرارة المستقيم (38-39.6 درجه مئوية).
    9. قبل ثماني ساعات من النقل ، وحجب الطعام من الحيوانية لتجنب أكبر حجم الأمعاء والنشاط حتى يتم الانتهاء من عمليه ET. اترك حريه الوصول إلى الماء.
  3. اعداد الاجنه
    1. سخن وسائل الاعلام الخاصة بمعالجه الاجنه إلى 25 درجه مئوية: القاعدة المتوسطة (BM) ، المكونة من محلول الفوسفات المخزن في دولبيكو (DPBS) المكمل بنسبه 0.2% (w/v) من زلال مصل الأبقار.
    2. العمل تحت المجسم ، شطف الاجنه الطازجة أو المذابة (الخطوة 2) مع BM.
    3. باستخدام القفازات المعقمة ، قم بإرفاق قسطرة فوق الجافية مكونه بشكل مناسب 17 جرام إلى حقنه 1 مل.
    4. يستنشق 1 سم من BM في القسطرة ، تليها فقاعه الهواء الصغيرة.
    5. يستنشق 5-7 أجنه في حجم 10 μL من BM ، تليها فقاعه الهواء الصغيرة الأخرى.
    6. الانتهاء من تحميل القسطرة عن طريق الشفط 1 سم من BM.
  4. نقل الاجنه
    1. النظر في استخدام قفازات معقمه ، ثوب وقناع لضمان بيئة معقمه.
    2. تعقيم الاداات الجراحية ، وتنظيف الأسطح حيث سيتم اجراء الجراحة ، ويمسح لهم مع 70 ٪ الايثانول.
    3. اجراء التخدير كما هو مفصل سابقا (الخطوة 1.2) ، والتحقق من فقدان ردود الفعل.
    4. حلق الفراء من البطن البطني مع الحلاقة الكهربائية.
    5. اعداد البطن بطني بشكل اسيبكالي.
      1. تنظيف المنطقة الجراحية وأزاله اي الشعر المتبقية. اغسل المنطقة الجراحية بصابون غلوكونات الكلورهسيدين. تعقيم المنطقة مع محلول الكلوركهيكسيدين و الايثانول 96 º (3 مرات).
    6. وضع الحيوانية علي طاوله الجراحية الدافئة ، في موقف Trendelenburg (الراس إلى أسفل في 45 درجه) للتاكد من ان المعدة والأمعاء وتقع في الجمجمة. النظر في اخلاء المثانة إذا كان العكر. إذا تضررت اي الأحشاء في هذه العملية ، قد يموت الحيوانية. ولذلك فمن المهم ان يكون لها مكان مناسب (الشكل 1).
    7. تغطيه المنطقة باستخدام منشفه معقمه ، مع ثقب (الفيستاستين) تعريض المنطقة حليق ، لفصل الموقع الجراحي من اي مناطق تلوث المحتملة.
    8. ادراج واحده مبزل بالمنظار 5 سم في تجويف البطن ، 2 سم الذيليه إلى عمليه الخنجري ، وغير كافيه من خلال ذلك التجويف البريتوني مع الضغط-تنظيم الميكانيكية inسوفيلاتور.
      ملاحظه: يجب ان يكون الضغط داخل البطن 8-12 مم زئبق مع CO2 (الشكل 1a).
    9. ادخل كاميرا المنظار من خلال المنظار التنظيري (الشكل 1 ب).
      ملاحظه: التعرف علي الجهاز التناسلي ، وتحديد حاله وموقف اينفونديبولوم و أمبول قبل ET لتسهيل الخطوات التالية.
    10. قم بإدخال ابره فوق الجافية 17 جرام في المنطقة الاربيه بين 2-3 سم من الداخل (الشكل 1B).
    11. التعرف علي مدخل اينفونديبولوم (الشكل 2 ا، 2 ب).
    12. ادخل القسطرة المحملة (الخطوة 1.3) من خلال ابره فوق الجافية في البطن (الشكل 1C).
    13. تحديد موقع القناة وادراج 1-2 سم من القسطرة فوق الجافية من خلال اينفونديبولوم في أمبول (الشكل 2a-2a). لا تقدم بعيدا جدا في القناة لمنع الضرر والنزيف.
    14. الإفراج عن الاجنه في القناة عن طريق الضغط برفق علي المكبس من حقنه إلى جانب القسطرة (الشكل 2D-2d). يجب علي كل من فقاعات الهواء الخروج من القسطرة.
    15. قم بازاله القثطار مباشره بعد الإفراج عن الاجنه.
    16. شطف القسطرة ، والشفط والإفراج عن التلاعب المتوسطة للتحقق من عدم وجود الاجنه وتاكيد نقلها بنجاح.
    17. كرر الخطوات ال1.4.11ه ل1.4.16 في الجانب الآخر من الرحم ، إذا رغبت في ذلك.
    18. أزاله الابره فوق الجافية وكاميرا المنظار.
    19. الإفراج عن CO2 من خلال trocar بالمنظار. إذا بقي الغاز الزائد في بطن الحيوانية ، فانه سيكون الم وعدم الراحة.
    20. أزاله السيارة بالمنظار من تجويف البطن. أزاله منشفه الجراحية.
    21. توقف عن التخدير.
    22. تنظيف الشق الذي ادلي به تروكار مع محلول الكلوههيكسيدين. إغلاق الشق الذي ادلي به مبزل مع ألومنيوم ميكروزيد وخلع الملابس البلاستيكية.
  5. الرعاية بعد الجراحة
    1. علاج الماشية بالمضادات الحيوية: 10 مغ/كغ من الانروفلوكساسين ، جلد ، كل 24-ساعة لمده 5 أيام.
    2. أداره المسكنات: هيدروكلوريد البوبرينورفين (0.03 ملغم/كغ) ، عضل ، كل 12 ساعة لمده 3 أيام ؛ Meloxicam (0.2 ملغ/كغ) ، جلد ، كل 24-ح لمده 3 أيام.
    3. مراقبه الماشية لمده 30 دقيقه علي الأقل بعد الجراحة (اعتمادا علي الحيوانية وجرعه التخدير المستخدمة) التاكد من انها استعاده الظروف الفسيولوجية.
    4. تحديد المستلم (علي سبيل المثال ، وشم الاذن) والمنزل الحيوانية بشكل فردي في قفص نظيف مع الحالة البيئية المناسبة.

Figure 1
الشكل 1: نقل الاجنه بالمنظار بمساعده تنظير البطن (المنظر الخارجي). ا) إدخال السيارة بالمنظار (منفذ واحد). ب) إدخال الكاميرا بالمنظار وابره فوق الجافية (السهم الأسود). ج) إدخال قسطرة نقل الاجنه (السهم الأبيض) من خلال ابره فوق الجافية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: نقل الاجنه بالمنظار بمساعده تنظير البطن (المنظر الداخلي). ا: إدخال القثطار من خلال ابره فوق الجافية في منطقه البطن. تشير النجمة إلى infundibulum. باء ، جيم ، دال: يتم إدخال القسطرة المحملة بالاجنه في منطقه أمبول عبر infundibulum. هاء ، واو: الإفراج عن الاجنه ، وأكد من قبل التصور من القناات تورم. وقد تم تكييف هذا الرقم من ماركو-خيمينيز وآخرون. 38. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

2-التزجيج الجنيني والاحترار

  1. اجراء جميع التلاعبات في درجه حرارة الغرفة (حوالي 22 درجه مئوية) للحد من سميه محلول التزجيج في درجات حرارة أكثر دفئا.
    ملاحظه: يمكن نقل الاجنه باستخدام الماصة التلقائية 0.1-2 μL في هذا البروتوكول ، ولكن الاجهزه المشابهة الأخرى لنقل الاجنه التي تسحب الحد الأدنى للحجم يمكن ان تكون مناسبه.
  2. التزجيج الاجنه في اجراء بالاضافه إلى خطوتين:
    1. ضعي الاجنه لمده دقيقتين في محلول تولد يتكون من 10% (v/v) جلايكول الاثيلين و 10% (v/v) ثنائي ميثيل سولفوكسيد مذاب في BM.
    2. نقل الاجنه (من الخطوة 2.2.1) لمده دقيقه واحده إلى محلول التزجيج الذي يتكون من 20 ٪ (v/v) جلايكول الاثيلين و 20 ٪ (v/v) ثنائي ميثيل سولفوكيد المذاب في BM.
  3. تحميل الاجنه إلى 125 μL البلاستيك الإسعاف (الذي يحتوي علي نهاية واحده مغلقه مع المكونات القطنية واحده مفتوحة المدقع). وهذه العملية مخططه في الشكل 3.
    1. زوج النهاية مغلقه من 0.125 μL الإسعاف مع الدقيق المناسب (مثل كابترول الثالث®).
    2. يستنشق BM حتى 1/3 من طول القش ، تليها فقاعه الهواء الصغيرة.
    3. يستنشق الاجنه في حجم 40 μL من محلول التزجيج ، تليها فقاعه الهواء الصغيرة الأخرى.
    4. يستنشق BM حتى الجزء السائل الأول (الخطوة 2-3-2) تصل إلى القطن.
    5. اغلق النهاية المفتوحة بقابس من القش.
  4. نفذ الخطوة 2-2-2 بينما يتم القيام بالخطوة 2.3 لضمان عدم انقضاء أكثر من دقيقه واحده ، والتي من شانها ان تكون سامه لأجنه.
  5. يغرق الإسعاف مباشره في النيتروجين السائل لتحقيق التزجيج.
  6. تخزين الإسعاف في ديوار للنيتروجين للوقت المطلوب.
  7. أذابه الاجنه في خطوه واحده.
    1. وضع الإسعاف أفقيا 10 سم من بخار النيتروجين السائل ل 20-30 s.
    2. عندما تبدا عمليه التبلور داخل الإسعاف ، تزج الإسعاف في حمام مائي عند 25 درجه مئوية ل 10-15 s.
    3. أزاله قابس الإسعاف وقطع المكونات القطنية.
    4. مع مايكرو موزع ، وطرد جميع المحتوي إسعاف في لوحه تحتوي علي 0.33 M محلول السكروز في 25 درجه مئوية في BM لمده 5 دقائق.
      ملاحظه: يجب القيام بهذه الخطوة بسرعة من أجل الحد من تعرض الاجنه لمحلول التزجيج.
    5. نقل الاجنه إلى لوحه جديده تحتوي علي حل BM لمده 5 دقائق أخرى.
    6. النظر فقط الاجنه غير التالفة (مع معطف الميوسين سليمه وبيلوسيدا زؤانا) لمواصله مع ET.
      ملاحظه: تاخذ في الاعتبار انه في الاجنه المذابة ، قد تحسن التحويلات غير المتزامنة (علي سبيل المثال ، 60-62 h في التحويلات مورلي) النتائج من خلال السماح باعاده المزامنة بين الجنين وبطانة الرحم الام.

Figure 3
الشكل 3: مخطط القش المحمل بشكل صحيح. ا) يشير BM إلى وسائل الاعلام التي تتلاعب بالاجنه المستخدمة اثناء التزجيج. يجب تحميل الاجنه في محلول التزجيج. ب) المظهر المجهري لقشه المحملة بتفاصيل مكبره لوضعيه الجنين. هذا الجهاز كبير الحجم يسمح لنا للمزجج عدد كبير من الاجنه ، علي عكس الاجهزه حجم الحد الأدنى. وعلاوة علي ذلك ، فان التعامل مع هذا الجهاز هو أسهل مقارنه مع الاجهزه حجم الحد الأدنى ، في حين ان النتائج متشابهة في الأرانب41. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الحد الأدنى الغازية نقل بالمنظار من الاجنه الطازجة أو المزجج يضع الأرنب بين أفضل النماذج الحيوانية للدراسات الانجابيه. ويبين الجدول 1 نتائج الاجنه المنقولة الطازجة في مراحل تنموية مختلفه (الشكل 4). معدل البقاء علي قيد الحياة عند الولادة (النسبة المئوية من الاجنه مما ادي إلى الجرو) أثبتت فعاليه تقنيه بالمنظار الموصوفة في هذه الورقة. وقد تحققت القيم الأعلى عندما أجريت العمليات الخاصة بالاجنه في مرحله المستنقعات ، سواء كانت في وقت مبكر أو في المستنقعات الصغيرة. واستنادا إلى هذه النتائج ، أجرينا تجربه ثانيه لإثبات معدل البقاء علي قيد الحياة بعد التزجيج لهذه الاجنه. التالي ، فاننا نعرض في الجدول 2 النتائج التي تم الحصول عليها بعد نقل الأرنب اللاذع المستعاد في الوقت نفسه ، والتفريق بين تلك الاجنه التي وصلت إلى درجه جيده من الضغط ام لا. وكان معدل البقاء علي قيد الحياة عند الولادة مختلفا بين مراحل الجنين المختلفة ، حيث كان اعلي في المستنقعات المضغوطة. ولذلك ، نقل الجنين بالمنظار هو تقنيه موثوق بها لنقل الاجنه الطازجة واللاذعة في الأرانب

Figure 4
الشكل 4: أجنه الأرانب. ا) pronuclear. ب) ثماني خلايا. ج) الmorula المبكر. د) morula الميثاق. ه) الكيسة البدائية. تشير النجمة إلى الضمير الثنائي. السهام السوداء تشير إلى البليوسيدا زؤانا. السهام البيضاء تشير إلى معطف الميوسين ، الذي يختلف عاده بين الاجنه. ICM: كتله الخلية الداخلية. TE: المغذيات. شريط المقياس: 50 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

المرحلة التنموية1 الاجنه المستلمين مكان النقل معدل الحمل (%) معدل الغرس (%) معدل البقاء عند الولادة (%)2
برووجلي 78 7 اوفيدوكت 7 (100) 50 (64.0) (ب ) 34 (43.6) (ب )
8 خلايا 81 7 اوفيدوكت 7 (100) 60 (74.1) (ب ) 53 (65.4) (ا )
[مورولا] مبكرة 81 7 اوفيدوكت 7 (100) 80 (98.8) (ا ) 60 (74.1) (ا )
المدمجة مورلي 80 7 اوفيدوكت 7 (100) 80 (100) (ا ) 58 (72.5) (ا )
الكيسه 80 7 الرحم 7 (100) 73 (91.3) (ا ) 38 (47.5) (ب )

الجدول 1 كفاءه نقل الاجنه الأرانب الطازجة (في الجسم المجري المستمدة) عن طريق تنظير البطن. تم انتشال 1أجنه مختلفه في 18-20h (pronuclear) ، 36-38h (8 خلايا) ، 60-62 h (في وقت مبكر morula) ، 70-72 h (morula المدمجة) و 80-82 h (الكيسة) بعد التزاوج. المدمجة (> 32 الخلايا) وغير المدمجة أجنه (≈ 32 الخلايا) يمكن ان تقوم في 70-72 h ، ولكن تم نقل فقط أجنه المدمجة. 2 معدل البقاء علي قيد الحياة عند الولادة من الحامل المتلقي لا. الف ، باء القيم التي لها مرتفع مختلفه تختلف إحصائيا (P < 0.001).

مرحله التطوير الاجنه المنقولة المستلمين معدل الحمل (%) معدل البقاء عند الولادة (%)1
غير مضغوط 135 10 9 (90) 62 (45.9) (ب )
ضغط 150 10 10 (100.0) 98 (65.3) (ا )
مجموع 285 20 19 (95) 160 (56.1)

الجدول 2 القدرة علي البقاء لغير المضغوطة مقابل الmorula المضغوط. [ا], [ب] قيم مع مرتفع مختلفه إحصائيا مختلفه ([ب] < 0.001). 1 معدل البقاء علي قيد الحياة عند الولادة من الحامل المتلقي لا. وتم انتشال الاجنه في نفس الوقت (70-72 ساعة) وتم التمييز بينها وبين الخلايا المدمجة (> 32 خليه) والاجنه غير المدمجة (خلايا ≈ 32).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

منذ أول حاله الولادة الحية موثقه من الاجنه المنقولة9، وقد أصبحت هذه التقنية وأنواع الأرانب حاسمه في الدراسات الانجابيه. والي جانب ذلك ، تتطلب الدراسات البحثية المتعلقة بالاجنه ، التي تنطوي علي التلاعب والإنتاج والتجميد وما إلى ذلك ، كخطوه أخيره ، تقييم قدره الاجنه علي توليد نسل صحي كامل الأجل. ولذلك ، فان تقنيه نقل الاجنه لا غني عنها13،28. علي مر السنتين ، تم استبدال الطرق الجراحية المستخدمة في البداية لنقل الاجنه في رحم الام تدريجيا بطرق اقل الغازية في الغالبية العظمي من الأنواع13،14،15، 21 , 27 , 29 , 30-ومع ذلك ، ففي الأرانب ، تصبح الاجنه في المراحل المبكرة من النمو وفي الأنابيب المنتجة للجنين أمرا لا مفر منه لضمان نتيجة مماثله للظروف الطبيعية. في الأرانب ، معطف الميوسين في الداخل هو عامل حاسم يسمح غرس الاجنه ، كما انه يحدث بعد أعاده تشكيل الطلاء الجنينية خلال التوسع الكيسة في قرون الرحم. ومع ذلك ، يقتصر ترسب المعطف الميوسين إلى القناة لمده 3 أيام بعد الاباضه ، واليات الجزيئية لترسب المواد معطف غير معروف إلى حد كبير31. لهذه الأسباب ، من المعروف انه في المختبر-المتقدمة الكيسة لم يبقوا علي قيد الحياة عند نقلها إلى الرحم32،33،34، والاجنه مع معطف الميوسين التالفة لديها انخفاض معدل البقاء علي قيد الحياة 35-المثل ، أدت المجموعات التي أبلغت عن نقل الاجنه عبر عنق الرحم في الأرانب إلى انخفاض معدلات المواليد المباشرة11و26. هنا ، نقدم تقنيه طفيفه التوغل ، مقتبسه من Besenfelder و Brem18، لنقل الاجنه مع معدلات المواليد الناجحة. ووفقا للنتائج التي جاءت في الجدول 1، كانت مرحله المستنقعات في أجنه الأرانب أفضل مرحله جنينيه لتحقيق معدل بقاء مرتفع عند الولادة. واحد التفسيرات الممكنة هو الحساسية الأكبر للتلاعب بالمراحل الاولي. ومن المثير للاهتمام ان معدل النجاح يزداد مع تقدم المرحلة الجنينية ، وربما يرجع ذلك إلى زيادة تعرض الجنين لإفرازات اوفيدوتال قبل شفائه. ولكن عندما تصل الاجنه إلى مرحله الكيسة البدائية ويتم نقلها إلى الرحم ، تنخفض القيم بشكل جذري. لا تستبعد ما قيل ، يمكن ان يكون تفسيرا ممكنا ان الاجنه المنقولة إلى القناة يمكن استعاده الضرر المحتمل المتولد في طبقه الميوسين اثناء التلاعب الجنين. التالي ، فان الكيسات البدائية المنقولة إلى الرحم ستحرم من هذه اليه ، مما قد يضر بقدرتها علي الغرس.

يتم تنفيذ هذه التقنية باستخدام أداه منفذ واحد (5 ملليمتر المنظار trocar) ، مع طفيفه ، والتلاعب وجيزة. ولذلك ، لا يتطلب شق the5 المنظار مبزل إغلاق. وتشمل فوائد تقنيه بالمنظار انخفاض الم بعد العملية الجراحية, عوده أسرع إلى النشاط الطبيعي, ومضاعفات اقل بعد العملية الجراحية. الاضافه إلى ذلك ، فان إجراءات التنظير الباطني تحفز التصاقات البطنية بشكل اقل وتسمح باستجابة مناعية أفضل من قبل المتلقي بالمقارنة مع الجراحة المفتوحة21،36،37. تراكم الادله من مختبرنا قد أظهرت فعاليه هذا الاجراء ET في نموذج أرنب. وهكذا ، تم في السنوات الخمس الاخيره نقل ما مجموعه 3,909 أجنه (1,335 أجنه طازجه و 2,574ه) من خلال الإجراءات الموصوفة في هذه المخطوطة. ونتيجة لهذه التقنية ، كانت معدلات نسل الاجنه المنقولة الطازجة واللاذعة 62.9 في المائة و 42.5 في المائة ، علي التوالي38،39،40،41،42، 43 , 44 , 45 , 46 , 47وتستند العديد من الدراسات علي هذا الأسلوب: ماركو-خيمينيز وآخرون . 38 , 39 , 40 , 41, Vicente et al. 42, viudes De-كاسترو et al. 43, saenz-De-juano et al. 44 , 45 , 47, lavara et al. 46.

ويرد أدناه وصف للتوصيات العملية لتنفيذ هذه التقنية. في تجارب استزراع الاجنه ، من المستحسن أيضا استخدام قثطار جديد لنقل الاجنه بدلا من القسطرة المستخدمة لنقل الاجنه بين وسائل الاعلام الثقافية ووسائل التلاعب. هذا يتجنب نقل الزيوت المعدنية ويضمن تدفق الأمثل. خلال ET من المهم تقليل التعامل مع الجهاز التناسلي ، حيث ان الإفراط في التلاعب بالقناة قد يؤدي إلى التصاقات. إذا تم الملتوية القناة ، وتوظيف حقنه فوق الجافية في محاولة لوضعها بشكل صحيح ، وليس القسطرة ، كما انه يحتوي علي الاجنه والتلاعب الميكانيكية يمكن ان يسبب خسارتهم. بمجرد ان يمر القسطرة عبر القناة ، فانه ينزلق بسهوله. وإذا لم يحدث ذلك ، فقد يكون القسطرة قد انحرف. مره واحده داخل القناة, إذا كانت وسائل الاعلام لا تتدفق, تحريك القسطرة خارج قليلا ومحاولة أعاده ادراجه مره أخرى. إذا كان لا يزال لا يتدفق ، يتم انسداد القسطرة. قم بإزالته من القناة وحرر المحتوي إلى طبق بوسط نظيف. ثم قم باعاده تحميل الاجنه إلى قسطرة أخرى وحاول أعاده إدخالها في القناة مره أخرى. التسليم عاده ما ياخذ الأماكن 28-30 أيام بعد نقل مورلي.

الاضافه إلى ذلك ، هناك أدله تشير إلى ان مرحله نمو الاجنه يمكن ان تكون أكثر تقدما من بيئة الرحم في الإناث الكاذبات ، ولكن ليس العكس. علي وجه التحديد ، الاجنه لديها القدرة علي الانتظار لبيئة الرحم مواتيه ، ولكن بيئة الرحم لا يمكن ان تنتظر الاجنه في المرحلة الصحيحة لغرس10. وفيما يتعلق بالاجنه اللاذعة ، فمن الممكن ، بعد تخزين قصير/طويل الأجل ، مزامنة المرحلة التنموية للجنين مع بيئة الرحم الملائمة المناظرة. وعلاوة علي ذلك ، إذا كان المتبرع بالاجنه هو أيضا متلقي الاجنه ، يمكن تجاوز الآثار الضارة للاباضه علي بطانة الرحم باستخدام تقنيه التزجيج ونقل الاجنه في دوره لاحقه48. في الأرانب ، الاجنه اللاذعة المنقولة إلى القناات من المتلقيين المستحثة لاباضه 60-62 h مسبقا (asynchrony) هو تقنيه عاليه الكفاءة44،49. ذات الصلة مع هذا, وقد اقترح ان التحول الجنين oviductal خلال 10-12 h يمكن ان تفسر الآثار المفيدة في استعاده فسيولوجيا الخلية واستبدال الخلايا الميتة, وربما إصلاح الضرر المستحث في معطف الميوسين اثناء الجنين التلاعب. بالاضافه إلى ذلك ، تقدم الاجنه اللاذعة تاخيرا في التطور ، حيث تم تعليقها بشكل أيضي اثناء التخزين. ولذلك ، فان نقل الاجنه بالتبريد إلى متلقين غير متزامنين يسمح للجنين باعاده تنشيط نشاطه الأيضي ، التالي تتم مزامنة مرحله النمو الجنينية مع بيئة الرحم. بدلا من ذلك ، إذا تم نقل الاجنه الباكية إلى مستقبلات متزامنة ، فان المحادثة المتقاطعة بين الام والجنين تعيق بداية الحمل الناجح. في الأرنب ، وقد تم الحصول علي اعلي معدل البقاء علي قيد الحياة بعد نقل داخل القناة من أجنه49التبريد. وتتسق بياناتنا مع هذا التقرير ، علي الرغم من ان مرحله المستنقعات تعرض معدلات بقاء مختلفه بعد الحجز بالتبريد اعتمادا علي درجه الضغط عند 70-72 ساعة (الجدول 2). هنا ، أظهرت أجنه ضغط اعلي معدلات البقاء علي قيد الحياة عند الولادة بالمقارنة مع أجنه غير المضغوط ، والذي كان في التوافق مع التقارير السابقة التي تبين ان كل مرحله من مراحل التنمية لديها أليتها الخاصة بالنسبة لتخلل كريوبروتيكتانتس و مدي الجفاف خلال أضافه حل التجميد50. الكامنة وراء هذه التقنيات ، وقد أظهرنا ان مزيجا من التزجيج ونقل الاجنه داخل القناة هو استراتيجية ناجحه لأعاده تاسيس السكان الأرانب بعد 15 عاما من التخزين في النيتروجين السائل ، دون تاثير سلبي علي البقاء علي قيد الحياة بعد ذوبان الجليد والولادة الحية51.

يجب ان تؤخذ التفاصيل التالية في الاعتبار لتنفيذ هذه التقنية بنجاح. ومن المهم ان نضع في اعتبارنا ان الكثافة المتزايدة للوسيطات المتتالية المستخدمة في التزجيج (DPBS ، محلول تاخيرمن ، محلول التزجيج) يمكن ان تحفز انكماش الاجنه بسبب الجفاف الجنيني التدريجي. ومع ذلك ، يتم استرداد مظهره الطبيعي عندما يكون الجنين معايرتها مع الوسط. وعلاوة علي ذلك ، عندما ينتقل الجنين بين وسائل الاعلام المتزايدة الكثافة ، فانه يميل إلى الانتقال إلى سطح وسائل الاعلام بسبب حركات الكثافة. لتجنب فقدان الاجنه وضمان وقت التزجيج ، ينصح باجراء التزجيج في قطرات صغيره من وسائل الاعلام التي من شانها ان تبقي الجنين في مكانه.

في الختام ، نحن هنا وصف كل من تقنيه ET وطريقه التزجيج الجنين التي تسهل الدراسات المستقبلية التي تستخدم الأرانب كنموذج. استنادا إلى المسافة الوراثية القريبة بين الأرانب والبشر ، فان استخدام هذا النموذج يمكن ان يوفر نتائج قابله للتحويل بسهوله إلى الطب السريري البشري. الاضافه إلى ذلك ، طريقتنا يقدم بعض المزايا الصحية والاقتصادية ، والمطابقة لمفهوم 3 Rs من الرفاه الحيواني (الاستبدال والتخفيض والصقل) ، مع الحفاظ علي هدف تحسين المعاملة الانسانيه للحيوانات التجريبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل بأموال من وزاره الاقتصاد والقدرة التنافسية في اسبانيا (AGL2017-85162-1-R) وبرنامج البحوث المتعلقة بالعموميات في فالنسيا (PrometeoII 2014/036). نسخه النص الإنكليزي المنقحة من قبل n. Macowan خدمه اللغة الانجليزيه

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 332
Buprenorphine hydrochloride Alvet Escartí 626 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buserelin Acetate Sigma Aldrich B3303
Clorhexidine digluconate soap Alvet Escartí 0265DCCJ500B
Clorhexidine digluconate solution Alvet Escartí 0265DCCA500B
CO2 Air Liquide 99921 CO2 N48.
CO2 Incubator Fisher scientific 15385194
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich W387509
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) Sigma Aldrich D5773 Without calcium chloride.
Electric razor Oster Golden A5 078005-140-002
Endoscope camera Optomic Spain S.A OP-714
Endoscope trocar with silicone leaflet valve Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 30114GK Lightweight trocar model.
Enrofloxacin Alvet Escartí 9993046 To be ordered by a licensed veterinarian.
Epicraneal needle 23G Alvet Escartí 514056353 Smaller needles can be also used.
Epidural catheter Vygon corporate 187.10
Epidural needle Vygon corporate 187.10
Ethylene Glycol Sigma Aldrich 102466-M
Eye ointment Alvet Escartí 5273
Ketamine hydrochloride Alvet Escartí 184 To be ordered by a licensed veterinarian.
Laparoscopy equipment Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 26003 AA Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel.
Light source Optomic Spain S.A Fibrolux 250
Liquid Nitrogen Air Liquide P1505XXX
Mechanical CO2 insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. Endoflator®
Meloxicam Alvet Escartí 9993501 To be ordered by a licensed veterinarian.
Petri dishes, 35-mm Sigma Aldrich CLS430165-500EA
Plastic dressing (Nobecutan) IBOR medica 7140028
Plastic Straw 0.25 mL IMV - technologies 6431
Povidone iodide solution Alvet Escartí 02656DPYS500S
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
Silicone tube for insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 20400040
Stereomicroscope Leica MZ16F There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few.
Sterile Gloves Alvet Escartí 087GL010075
Sterile gown Alvet Escartí 12261501
Sterile mask Alvet Escartí 058B15924B
Straw Plug IMV - technologies 6431
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Syringe, 1-mL Fisher scientific 11750425
Syringe, 5-mL Fisher scientific 11773313
Urinary catheter IMV - technologies 17722
Waterbath RAYPA BAE-4
Xylazine Alvet Escartí 525225 To be ordered by a licensed veterinarian.
Rabbits Universitat Politècnica de València Line A Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (ART). Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8, (4), 388-402 (2017).
  2. Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo vitrification in rabbits: Consequences for progeny growth. Theriogenology. 84, (5), 674-680 (2015).
  3. Sirard, M. A. The influence of in vitro. fertilization and embryo culture on the embryo epigenetic constituents and the possible consequences in the bovine model. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8, (4), 411-417 (2017).
  4. Feuer, S. K., Rinaudo, P. F. Physiological, metabolic and transcriptional postnatal phenotypes of in vitro. fertilization (IVF) in the mouse. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8, (4), 403-410 (2017).
  5. Jiang, Z., et al. Genetic and epigenetic risks of assisted reproduction. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 44, 90-104 (2017).
  6. Fleming, T. P., Velazquez, M. A., Eckert, J. J. Embryos, DOHaD and David Barker. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 6, (5), 377-383 (2015).
  7. Sparks, A. E. Human embryo cryopreservation-methods, timing, and other considerations for optimizing an embryo cryopreservation program. Seminars in Reproductive Medicine. 33, (2), 128-144 (2015).
  8. Swain, J. E. Optimal human embryo culture. Seminars in Reproductive Medicine. 33, (2), 103-117 (2015).
  9. Heape, W. Preliminary note on the transplantation and growth of mammalian ova within a uterine foster-mother. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 48, 457-459 (1890).
  10. Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal embryo transfer and vasectomy in the mouse model. Journal of Visualized Experiments. (84), e51214 (2014).
  11. Kidder, J. D., Roberts, P. J., Simkin, M. E., Foote, R. H., Richmond, M. E. Nonsurgical collection and nonsurgical transfer of preimplantation embryos in the domestic rabbit (Oryctolagus cuniculus) and domestic ferret (Mustela putorius furo). Journal of Reproduction and Fertility. 116, (2), 235-242 (1999).
  12. Tıras, B., Cenksoy, P. O. Practice of embryo transfer: recommendations during and after. Seminars in Reproductive Medicine. 32, (4), 291-296 (2014).
  13. Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53, (3), 228-231 (2014).
  14. Moreno-Moya, J. M., et al. Complete method to obtain, culture, and transfer mouse blastocysts nonsurgically to study implantation and development. Fertility and Sterility. 101, (3), e13 (2014).
  15. Hasler, J. F. Forty years of embryo transfer in cattle: a review focusing on the journal Theriogenology, the growth of the industry in North America, and personal reminisces. Theriogenology. 81, (1), 152-169 (2014).
  16. Bauer, C. The baboon (Papio sp.) as a model for female reproduction studies. Contraception. 92, (2), 120-123 (2015).
  17. Martinez, E. A., et al. Nonsurgical deep uterine transfer of vitrified, in vivo-derived, porcine embryos is as effective as the default surgical approach. Science Reports. 5, 10587 (2015).
  18. Besenfelder, U., Brem, G. Laparoscopic embryo transfer in rabbits. Journal of Reproduction and Fertility. 99, 53-56 (1993).
  19. Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47, (5), 1051-1060 (1997).
  20. Besenfelder, U., Havlicek, V., Kuzmany, A., Brem, G. Endoscopic approaches to manage in vitro and in vivo embryo development: use of the bovine oviduct. Theriogenology. 73, (6), 768-776 (2010).
  21. Fonseca, J. F., et al. Nonsurgical embryo recovery and transfer in sheep and goats. Theriogenology. 86, (1), 144-151 (2016).
  22. Denker, H. W. Structural dynamics and function of early embryonic coats. Cells Tissues Organs. 166, 180-207 (2000).
  23. Marco-Jiménez, F., López-Bejar, M. Detection of glycosylated proteins in rabbit oviductal isthmus and uterine endometrium during early embryo development. Reproduction in Domestic Animals. 48, (6), 967-973 (2013).
  24. Ménézo, Y. J., Hérubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reproductive BioMedicine Online. 4, (2), 170-175 (2002).
  25. Fischer, B., Chavatte-Palmer, P., Viebahn, C., Navarrete Santos, A., Duranthon, V. Rabbit as a reproductive model for human health. Reproduction. 144, (1), 1-10 (2012).
  26. Besenfelder, U., Strouhal, C., Brem, G. A method for endoscopic embryo collection and transfer in the rabbit. Zentralbl Veterinarmed A. 45, (9), 577-579 (1998).
  27. Daniel, N., Renard, J. P. Embryo transfer in rabbits. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (1), (2010).
  28. Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters rabbit foetal placenta at transcriptomic and proteomic level. Reproduction. 147, (6), 789-801 (2014).
  29. Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. Biotechniques. 47, (5), 919-924 (2009).
  30. Duan, X., Li, Y., Di, K., Huang, Y., Li, X. A nonsurgical embryo transfer technique in mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 32, (4), 440-446 (2016).
  31. Denker, H. W., Gerdes, H. J. The dynamic structure of rabbit blastocyst coverings. I. Transformation during regular preimplantation development. Anatomy and Embryology. 157, 15-34 (1979).
  32. Seidel, G. E., Bowen, R. A., Kane, M. T. In vitro fertilization, culture and transfer of rabbit ova. Fertility and Sterility. 27, 861-870 (1976).
  33. Binkerd, P. E., Anderson, G. B. Transfer of cultured rabbit embryos. Gamete Research. 2, 65-73 (1979).
  34. Murakami, H., Imai, H. Successful implantation of in vitro cultured rabbit embryos after uterine transfer: a role for mucin. Molecular Reproduction and Development. 43, 167-170 (1996).
  35. Techakumphu, M., Wintenberger-Torrèsa, S., Sevelleca, C., Ménézo, Y. Survival of rabbit embryos after culture or culture/freezing. Animal Reproduction Science. 13, (3), 221-228 (1987).
  36. Gitzelmann, C. A., et al. Cell-mediated immune response is better preserved by laparoscopy than laparotomy. Surgery. 127, (1), 65-71 (2000).
  37. Huang, S. G., Li, Y. P., Zhang, Q., Redmond, H. P., Wang, J. H., Wang, J. Laparotomy and laparoscopy diversely affect macrophage-associated antimicrobial activity in a murine model. BMC Immunology. 14, 27 (2013).
  38. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Almela-Miralles, V., Vicente, J. S. Development of Cheaper Embryo Vitrification Device Using the Minimum Volume Method. Public Library of Science One. 11, (2), e0148661 (2016).
  39. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Generation of live offspring from vitrified embryos with synthetic polymers supercool X-1000 and Supercool Z-1000. CryoLetters. 35, 286-292 (2014).
  40. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Use of cyclodextrins to increase cytoplasmic cholesterol in rabbit embryos and their impact on live KITs derived from vitrified embryos. Cryoletters. 35, 320-326 (2014).
  41. Marco-Jiménez, F., Lavara, R., Jiménez-Trigos, E., Vicente, J. S. In vivo development of vitrified rabbit embryos: Effects of vitrification device, recipient genotype, and asynchrony. Theriogenology. 79, (7), 1124-1129 (2013).
  42. Vicente, J. S., et al. Rabbit morula vitrification reduces early foetal growth and increases losses throughout gestation. Cryobiology. 67, 321-326 (2013).
  43. Viudes-de-Castro, M. P., Marco-Jiménez, F., Cedano-Castro, J. I., Vicente, J. S. Effect of corifollitropin alfa supplemented with or without Lh on ovarian stimulation and embryo viability in rabbit. Theriogenology. 98, 68-74 (2017).
  44. Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters at transcriptomic and proteomic level rabbit foetal placenta. Reproduction. 147, 789-801 (2014).
  45. Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Lavara, R., Vicente, J. S. Direct comparison of the effects of slow freezing and vitrification on late blastocyst gene expression, development, implantation and offspring of rabbit morulae. Reproduction in Domestic Animals. 49, 505-511 (2014).
  46. Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Long-term and transgenerational effects of cryopreservation on rabbit embryos. Theriogenology. 81, 988-992 (2014).
  47. Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo transfer manipulation cause gene expression variation in blastocysts that disrupt implantation and offspring rates at birth in rabbit. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 207, 50-55 (2016).
  48. Roque, M., Valle, M., Kostolias, A., Sampaio, M., Geber, S. Freeze-all cycle in reproductive medicine: current perspectives. JBRA Assisted Reproduction. 21, (1), 49-53 (2017).
  49. Tsunoda, Y., Soma, T., Sugie, T. Effect of post-ovulatory age of recipient on survival of frozen-thawed rabbit morulae. Journal of Reproduction and Fertility. 65, (2), 483-487 (1982).
  50. Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17, (3), 744-751 (2002).
  51. Lavara, R., Baselga, M., Vicente, J. S. Does storage time in LN2 influence survival and pregnancy outcome of vitrified rabbit embryos? Theriogenology. 76, (4), 652-657 (2011).
نقل الاجنه طفيف التوغل والتزجيج الجنيني في مرحله الجنين الأمثل في نموذج الأرنب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).More

Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter