Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

家兔模型最佳胚胎阶段微创胚胎移植与胚胎玻璃化

doi: 10.3791/58055 Published: May 16, 2019

Summary

辅助生殖技术 (Art) 正在进行持续评估, 以改善结果并减少相关风险。这份手稿描述了一个微创胚胎移植程序与一个有效的冷冻保存协议, 允许使用兔子作为一个理想的动物模型的人类生殖。

Abstract

辅助生殖技术 (Art), 如体外胚胎培养或胚胎冷冻保存, 会影响自然发育模式, 并造成围产期和产后的后果。为了确保 ART 应用的无害性, 有必要对动物模型进行研究。此外, 作为最后一步, 胚胎发育研究需要评估他们发育足月健康后代的能力。在这里, 胚胎移植到子宫是必不可少的, 以执行任何与艺术有关的实验。

一个多世纪以来, 兔子一直被用作研究哺乳动物繁殖的模型生物。除了系统发育接近人类物种和体积小, 维护成本低之外, 它还具有重要的生殖特征, 如诱导排卵、类似人类的早期胚胎发育年表和短怀孕使我们能够很容易地研究抗逆转录病毒疗法应用的后果。此外, Art (如胞浆内精子注射、胚胎培养或冷冻保存) 在本物种中具有适当的应用效率。

利用腹腔镜胚胎移植技术和本文提出的冷冻保存方案, 描述了 1) 如何通过简单、微创技术移植胚胎, 2) 一种有效的兔长期储存方案以提供时间灵活的后勤能力和运输样品的能力。在不同发育阶段移植兔胚胎后得到的结果表明, 莫鲁拉是兔胚胎恢复和移植的理想阶段。因此, 输卵管胚胎移植是必要的, 证明手术的合理性。此外, 还成功地对兔进行了玻璃化和腹腔镜转移, 证明了所述技术的有效性。

Introduction

为了绕过人类不育或改善高遗传价值牲畜的传播和保护动物遗传资源, 一套统称为辅助生殖技术的技术, 如超排卵, 在体外受精, 胚胎培养, 或冷冻保存, 发展 1, 2。目前, 激素治疗是为了刺激卵巢, 并产生大量的卵泡 1.从这些卵泡中收集的卵母细胞可以成熟、受精和体发育, 直到它们被冷冻保存或转移到代孕母亲3。然而, 在这些治疗过程中, 配子和合子暴露在一系列非生理过程中, 这些过程可能需要胚胎适应才能在这些条件下存活 4,5。这种适应是可能的由于早期胚胎可塑性, 允许胚胎在基因表达和发育编程6的变化。然而, 这些修饰会影响到成年前胚胎发育的各个阶段, 现在人们普遍认为, 方法、时间、冷冻保存程序或培养条件对胚胎命运的影响是不同的。,8. 因此, 为了阐明抗逆转录病毒疗法的具体诱发影响, 使用特征良好的动物模型是不可避免的。

1890年发生了第一次由哺乳动物胚胎移植而产生的活产.如今, 胚胎移植 (ET) 对代孕女性的影响是研究胚胎植入前对随后胚胎发育阶段10的抗逆转录病毒效应的关键一步。ET 技术取决于每种动物的大小和解剖结构。在大型动物模型的情况下, 它是可能的执行 et 通过经宫颈非手术 ET 技术, 但在较小的物种导尿子宫颈是比较复杂的, 手术技术是经常使用 11.然而, 手术 ET 可导致出血, 可能会损害植入和胚胎发育, 因为血液会侵入子宫腔, 导致胚胎死亡10。经宫颈非手术 et 技术仍适用于人类、、牛、猪和小鼠12131415、16、17, 但手术E t 仍被用于山羊、绵羊或其他动物等物种, 这些动物会带来额外的困难,兔子(两种)或小鼠 (小尺寸)。尽管如此, 手术转移方法往往已逐渐被侵入性较小的方法所取代。内窥镜检查被用来转移胚胎, 例如, 在兔子, 猪和小反刍动物18,19,20。这些微创内窥镜方法可用于通过漏斗将胚胎移植到壶腹, 这在兔子中是必不可少的, 并已在某些物种20中显示出有益的效果。这是基于胚胎和母亲在输卵管早期胚胎阶段正确对话的重要性。如上所述, 在胚胎通过输卵管的胚胎迁移过程中, 兔子的胚胎重塑对于实现能够植入22,23 的胚胎至关重要。

大尺寸的动物模型, 如牛, 很有趣, 因为生化和植入前的特征与人类 24 种相似。然而, 大型动物过于昂贵, 无法在初步试验中使用, 啮齿类动物被认为是实验室研究的理想模型 (76% 的模型生物是啮齿类动物)。然而, 兔子模型在生殖研究中比啮齿类动物有一些优势, 因为人类所表现出的一些生殖生物过程在兔子中比在小鼠身上更相似。人类和兔子呈现类似的胚胎基因组激活、胃和血液胎盘结构。此外, 使用兔子可以知道受精的确切时间和怀孕阶段, 因为他们诱发排卵25。兔子的生命周期很短, 31天内完成妊娠, 约4-5 进入青春期;这种动物由于其温顺和非攻击性的行为, 容易处理, 与大型动物的费用相比, 它的保养非常经济。此外, 重要的是要提到, 兔子有一个双子宫, 有两个独立的子宫颈11,25。这使得兔子处于优先的位置, 因为来自不同实验组的胚胎可以转移到同一动物体内, 但进入不同的子宫角。这使我们能够比较这两种实验效果, 减少母亲因素的结果。

如今, 非手术 ET 方法在兔中没有使用。在90年代末使用经颈椎 et 技术进行的一些研究导致低分娩率从5.5% 到 20.0 11,26和50-65 的手术方法, 其中包括腹腔镜手术描述Besenfelder 和 Brem18。这些非手术性 ET 方法在兔体内的成功率较低, 与输卵管缺乏必要的胚胎重塑而同时发生, 而输卵管输卵管内缺乏必要的胚胎重塑, 而输卵管内的胚胎重塑是避免的。在这里, 我们描述了一个有效的微创腹腔镜 ET 程序使用兔子作为模型生物。这项技术为大型动物和人类的生殖研究提供了一个模型。

由于家兔胚胎植入的时间窗口特别狭窄, 该物种的 et 要求在 ET 胚胎发育阶段和接受者27的生理状态之间有高度的同步性。在某些情况下, 在生殖治疗减缓胚胎发育 (如体外培养) 或改变子宫内膜接受度 (如超排卵治疗) 后, 胚胎和母亲子宫之间没有同步。这些情况会对结果产生负面影响。为了在这些情况下的反应, 我们描述了一个有效的兔子脑膜玻璃化协议, 使我们能够暂停, 组织和恢复实验。这一过程在后勤方面是生殖研究所需要的, 并使我们有能力长期储存胚胎, 使其能够运输。腹腔镜手术和冷冻保存策略可以更好地规划少动物的研究。因此, 我们的方法提供了卫生和经济优势, 并符合 3Rs (替换, 减少和细化) 的动物研究的概念, 明确的目标是改善人类对实验动物的治疗。因此, 有了这些方法, 兔子就成了体内生殖检测的理想模型生物。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

本研究中使用的所有实验程序都是根据关于动物实验的欧盟 eec 指令进行的, 并得到了 València Politècnica 大学动物实验伦理委员会的审查和批准。西班牙 (研究代码: 2015VSC/PEA/00号)。XGD、FMJ、MPVC 和 JSV 持有瓦伦西亚政府颁发的动物实验授权证书。XGD 被授权在实验期间对动物的福利和护理进行现场监督。

1. 胚胎移植

  1. 接受者女性的准备
    1. 仅使用性成熟的女性 (> 4.5个月大)。
    2. 在 ET 前一周, 使女性适应16小时的黑暗状态, 以启动卵泡生长和增强女性的接受度。
    3. 选择接受的女性, 观察外阴的浑浊和颜色。如果外阴是浑浊和红色的, 雌性是容易接受的。
    4. 通过肌肉注射1微克醋酸 buserelin (促性腺激素释放激素的合成类似物), 无论体重大小, 都能诱导假性假性 (排卵)。
      注: 通常情况下, 0.8 微克是中等大小家兔 (4-5 千克) 诱导排卵的合适剂量, 因此1微克通常保证排卵。
    5. 在被转移的胚胎的年龄之前的许多天进行排卵 (例如, 在新鲜的 morula et 之前的 70-72小时)。
  2. 麻醉和镇痛
    1. 称量兔子并加载以下麻醉剂和镇痛药。
      1. 在带有30G 针的1毫升注射器中: 装载 xylazine (5mg/kg) 和盐酸丁丙诺非 (0.03 mg/kg)。在另一个带有23G 周耳针的1毫升注射器中, 装载盐酸氯胺酮 (35 mg/2 kg)。
    2. 抓住兔子, 肌肉注射木糖-丁丙诺非混合物。
    3. 将含有氯胺酮的颅周针插入耳边缘静脉, 慢慢静脉注射所有注射器内装物。
    4. 修复针头, 并在剩余的步骤中将其插入, 以便在必要时进行更多麻醉。
    5. 把兔子留在笼子里 (干净, 没有任何其他动物) 在一个温暖的舞台上。
    6. 一旦不省人事, 应用眼药膏, 以避免眼睛干燥, 并检查是否没有眼睑自由。
      注: 此方案提供了至少30分钟的手术麻醉平面。如果需要更长的时间, 在30分钟后注入额外剂量, 其中一半的氯胺酮在1.2.1 中描述。
    7. 通过检查踏板反射和呼吸运动来监测麻醉深度。呼吸模式的变化, 以不规则和更快的速度表明失去了适当的麻醉平面。
    8. 监测粘膜 (眼睛、嘴唇) 的颜色、呼吸率 (每分钟30-60 次呼吸)、心率 (每分钟12-325次跳动) 和直肠温度 (38-39.6°c)。
    9. 在转移前 8小时, 向动物保留食物, 以避免更大的肠胃大小和活动, 直到 e t 过程完成。让客人免费使用水。
  3. 胚胎准备
    1. 将胚胎操作介质加热到 25°c: 培养基 (BM), 由 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 组成, 并辅以 0.2% (w/v) 的牛血清白蛋白。
    2. 在立体显微镜下工作, 用 BM 冲洗新鲜或解冻 (步骤 2) 胚胎。
    3. 使用无菌手套, 将适当配置的17G 硬膜外导管连接到1毫升注射器上。
    4. 将1厘米的 BM 浸入导管, 然后是一个小气泡。
    5. 在 BM 的体积为10μl 的情况下吸收5-7 个胚胎, 然后是另一个小气泡。
    6. 通过吸气1厘米的 BM 完成导管的加载。
  4. 胚胎移植
    1. 考虑使用无菌手套、长袍和面膜, 以确保无菌环境。
    2. 消毒手术器械, 清洁将进行手术的表面, 并用70% 的乙醇擦拭。
    3. 按照以前的详细步骤 (步骤 1.2) 执行麻醉, 检查反射丢失。
    4. 用电动剃须刀刮掉腹侧腹部的皮毛。
    5. 无菌地准备腹侧腹部。
      1. 清洁手术区域, 并删除任何剩余的头发。用葡萄糖酸氯己定肥皂清洗手术区域。用氯己定溶液和乙醇对该区域进行96度 (3次) 消毒。
    6. 将动物放在温暖的手术桌上, 位于特伦德伦堡的位置 (在45°向下向下), 以确保胃和肠道位于颅内。如果是浑浊的膀胱, 可以考虑膀胱的排空。如果在这个过程中任何内脏受损, 动物可能会死亡。因此, 正确定位它们非常重要 (图 1)。
    7. 使用无菌毛巾覆盖该区域, 并使用一个孔 (开窗) 暴露剃须区域, 以便将手术部位与任何潜在的污染区域分开。
    8. 将一个内窥镜5厘米的小车插入腹腔, 将2厘米尾端插入灵素过程, 并通过它插入腹腔, 并带有压力调节机械插入器。
      注: 腹内压力应为8-12 毫米汞柱与二氧化碳( 图 1a)。
    9. 通过内窥镜小车插入内窥镜相机 (图 1 b)。
      注: 确定生殖道, 确定内皮和壶腹的状态和位置之前的 et, 以方便下一步。
    10. 将17-G 硬膜外针头插入腹股沟区域, 距离漏斗膜2-3 厘米 (图 1 b)。
    11. 识别漏斗的入口 (图 2 a, 2A)。
    12. 通过硬膜外针将加载的导管 (步骤 1.3) 插入腹部 (图 1c)。
    13. 找到输卵管, 并通过壶腹的漏斗插入1-2 厘米的硬膜外导管 (图 2A-2A)。不要进入输卵管很远, 以防止损伤和出血。
    14. 通过轻轻按压注射器与导管耦合的柱塞, 将胚胎释放到输卵管中 (图 2d-2f)。两个气泡都必须退出导管。
    15. 就在胚胎被释放后, 取出导管。
    16. 冲洗导管, 吸气和释放操作介质, 以检查胚胎的缺失, 并确认其成功转移。
    17. 如果需要, 重复步骤1.4.11 在子宫的另一侧1.4.16。
    18. 取出硬膜外针头和内窥镜摄像头。
    19. 通过内镜车释放二氧化碳. 如果动物腹部仍有多余的气体, 就会有疼痛和不适。
    20. 从腹腔取下内窥镜上的小车。取下手术毛巾。
    21. 停止麻醉。
    22. 用氯己定溶液清洗小车制作的切口。用微型铝和塑料敷料关闭小车做的切口。
  5. 术后护理
    1. 用抗生素治疗动物:10 mg* 公斤 enroxacin, 皮下注射, 每 24小时5天。
    2. 管理镇痛药: 盐酸丁丙诺非 (0.03 mg/kg), 肌肉注射, 每次 12小时, 3天;美洛昔康 (0.2 mg/kg), 皮下, 每24小时一次, 3天。
    3. 术后对动物进行至少30分钟的监测 (取决于动物和使用的麻醉剂量), 确保它们恢复生理状况。
    4. 识别受者 (例如,耳纹身) 和将动物单独安置在一个干净的笼子里, 并具有适当的环境条件。

Figure 1
图 1: 腹腔镜辅助腹腔镜胚胎移植 (外部视图).A)插入内窥镜小车 (一个端口)。B)插入内窥镜摄像机和硬膜外针头 (黑色箭头)。C)通过硬膜外针插入胚胎移植导管 (白色箭头)。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 腹腔镜辅助腹腔镜胚胎移植 (内图).答:导管通过硬膜外针头插入腹部区域。星号表示漏斗。B、C、D:充满胚胎的导管入壶腹区域 , 穿过漏斗。英、法:胚胎的释放, 通过一个肿胀的输卵管的可视化确认。这一数字已改编自 Marco-Jiménez等人.38.请点击此处查看这一数字的较大版本.

2. 胚胎玻璃化和温暖

  1. 在室温 (约 22°C) 下进行所有操作, 以降低在温度较高的情况下的玻璃化溶液毒性。
    注: 在此协议中, 胚胎可以使用0.1-2 微米自动移液器进行移动, 但其他类似的移动胚胎拖动最小体积的设备可能是合适的。
  2. 在两步加法程序中对胚胎进行玻璃化治疗:
    1. 将胚胎置于平衡溶液中 2分钟, 溶液中含有 10% (v/v) 乙二醇和溶解在 BM 中的 10% (v/v) 二甲基亚硫氧化物。
    2. 将胚胎 (从步骤 2.2.1) 移动 1分钟, 形成玻璃化溶液, 其中包括溶解在 BM 中的20% 乙二醇和 20% (v/v) 二甲基磺酰亚硫醚。
  3. 将胚胎加载到一个125Μl 塑料区 (其中包含一个闭端, 带有棉塞和一个开放的极端)。该过程在图 3中进行了架构化。
    1. 将0.125μl 的闭合端与相应的微分配器 (例如 Captroll III®) 耦合。
    2. 吸气 BM, 直到秸秆长度的--, 随后是一个小气泡。
    3. 将胚胎吸收在40Μl 的玻璃化溶液中, 然后是另一个小气泡。
    4. 吸进 BM, 直到第一个液体分数 (步骤 2.3.2) 到达棉花。
    5. 用秸秆塞关闭开口端。
  4. 在执行步骤2.3 时执行步骤 2.2.2, 以确保经过的时间不超过一分钟, 这将对胚胎有毒。
  5. 将母量直接注入液氮, 实现玻璃化。
  6. 在所需的时间内, 将该部门存放在氮气的战争中。
  7. 只需一步就能解冻胚胎。
    1. 将从液氮蒸汽水平放置10厘米, 时间为20-30。
    2. 当结晶过程开始在委场内, 将该过程浸入25°c 的水浴中10-15。
    3. 取下电源插头, 切下棉塞。
    4. 使用耦合微分配器, 在 BM 25°c 时将所有的蔗糖含量排出一个含有 0.33 M 蔗糖溶液的板材, 时间为5分钟。
      注: 必须快速完成此步骤, 以减少胚胎接触玻璃化溶液。
    5. 将胚胎移动到包含 BM 溶液的新盘子中, 再延长5分钟。
    6. 考虑只有非受损的胚胎 (与完整的粘液涂层和透明带) 继续与 ET。
      注: 考虑到在解冻的胚胎中, 异步转移 (例如, 在 morula 移植中, 60-62小时) 可能会通过允许胚胎和母亲子宫内膜之间的重新同步来改善结果。

Figure 3
图 3: 正确加载秸秆的规划.A) bm 是指在玻璃化过程中使用的胚胎操作介质。胚胎必须装入玻璃化溶液中。B)加载秸秆的宏观外观与放大的细节的胚胎位置。这种大容量的装置使我们能够对大量的胚胎进行玻璃化, 这与最小体积的装置不同。此外, 与最小体积设备相比, 该装置的处理更容易, 而兔子4 1只的结果相似。请点击这里查看此图的较大版本.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

微创腹腔镜移植新鲜或玻璃胚胎使兔子成为生殖研究的最佳模型动物之一。表 1显示了在不同发育阶段 (图 4) 转移的胚胎的新鲜 et 的结果。出生时的存活率 (胚胎产生小狗的百分比) 证明了本文所描述的腹腔镜技术的有效性。当在早期或紧凑型莫鲁拉阶段用胚胎进行 e t 时, 获得了较高的值。基于这些结果, 我们进行了第二次实验, 以证明这些胚胎玻璃化后的存活率。因此, 在表 2中, 我们显示了在移植玻璃化兔后获得的结果, 同时, 区分那些已经达到良好的压实程度或未达到的胚胎。不同胚胎阶段的出生成活率不同, 压实膜中的成活率较高。因此, 腹腔镜胚胎移植是兔移植新鲜玻璃胚胎的可靠技术

Figure 4
图 4: 兔子胚胎.A) pr核。B) 8个细胞。C)早期的莫鲁拉。D)紧凑型 morula。E)囊胚。星号表示两个原核。黑箭表示透明带。白色箭头表示粘液涂层, 通常在胚胎之间变化。内细胞质量. te: 滋养。刻度栏: 50μm. 请点击这里查看这个数字的更大版本.

发展阶段1 胚胎 收件人 转让地点 怀孕率 (%) 植入率 (%) 出生时存活率 (%)2
Pr核 78 7。 输卵管 7 (100) 50 (64.0)b 34 (43.6)b
8个单元格 81 7。 输卵管 7 (100) 60 (74.1)b 53 (65.4)a
早期的莫鲁拉 81 7。 输卵管 7 (100) 80 (98.8)a 60 (74.1)a
紧凑型 morula 80 7。 输卵管 7 (100) 80 (100)a 58 (72.5)a
囊胚 80 7。 厄特鲁斯 7 (100) 73 (91.3)a 38 (47.5)b

表1。腹腔镜下新鲜兔胚胎移植 (体内衍生) 的效率。 1在 18-20 h (前核)、35-38小时 (8个细胞)、60-62小时 (早期莫鲁拉)、70-72小时 (紧凑型莫鲁拉) 和 80-82 h (囊胚) 交配后恢复。紧凑型 (和 gt;32 细胞) 和非紧凑型 (3 2个细胞) 可以在 7 0-7 2 小时建立, 但只转移了紧凑型。2从接受者怀孕的出生时生存率确实如此。a, b具有不同上标的值在统计上是不同的 (P<0.001)。

发展阶段 转移的胚胎 收件人 怀孕率 (%) 出生时存活率 (%)1
非压实 135 10 9 (90) 62 (45.9)b
压 实 150人 10 10 (100.0) 98 (65.3)a
285 20 19 (95) 160 (56.1)

表2。非压实与致密玻璃化的可行性。 a、b具有不同上标的值在统计上是不同的 (P<0.001)。1从接受者怀孕的出生时生存率确实如此。同时恢复了胚胎 (70-72 小时), 并分为紧凑型 (和 gt;32 细胞) 和非紧凑型细胞 (32 细胞)。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

自从第一个记录的活出生案例从转移的胚胎 9,这种技术和兔子物种已成为生殖研究的关键。此外, 涉及操纵、生产、冷冻保存的胚胎研究需要评估胚胎能力, 以产生健康的足月后代。因此, 胚胎移植技术是不可缺少的 13,28。多年来, 在绝大多数13、1415 种物种中, 最初用于将胚胎转移到母亲子宫手术方法已逐渐被侵入性较小的方法所取代。21,27,29,30. 然而, 在兔子中, 卵母管内内皮素在发育的早期阶段和体外产生的胚胎是不可避免的, 以确保与自然条件类似的结果。在兔体内, 输卵管内粘液涂层是允许胚胎植入的关键因素, 因为它发生在子宫角囊胚扩张过程中胚胎涂层的重塑之后。然而, 粘液涂层沉积仅限于排卵后3天的输卵管, 涂层物质沉积的分子机制在很大程度上是未知的31。由于这些原因, 众所周知,体外发育的囊胚在转移到子宫323334时没有存活下来, 而粘液涂层受损的胚胎的存活率较低35. 同样, 报告兔子经宫颈胚胎移植的群体导致活产率很低 11,26个。在这里, 我们提出了一个微创技术, 改编自 Besenfelder 和 Brem18, 以转移胚胎与成功的出生率。根据表 1的结果, 兔胚胎中的毛拉阶段是实现高出生成活率的最佳胚胎阶段。一个可能的解释是对最早阶段的操纵更敏感。有趣的是, 成功率随着胚胎阶段的进展而增加, 这可能是由于胚胎在恢复之前更容易接触输卵管分泌物。但当胚胎进入囊胚阶段并将胎盘协调转移到子宫时, 其价值就会大幅下降。不排除已经说过的话, 一个可能的解释可能是, 胚胎转移到输卵管可以恢复在胚胎操作过程中在粘液层可能产生的损害。因此, 转移到子宫的囊胚会被剥夺这种机制, 这可能会损害它们的植入能力。

该技术是使用单端口仪器 (5 毫米内窥镜小车), 轻微, 简短的操作。因此, 5 毫米内窥镜小车切口不需要闭合。腹腔镜技术的好处包括减少术后疼痛, 更快地恢复正常活动, 减少术后并发症。此外, 内窥镜手术诱导较少的腹部粘连, 并允许更好的免疫反应的受者相比, 开放手术21,36,37。从我们的实验室积累的证据证明了这个 ET 程序在兔子模型中的有效性。因此, 在过去五年中, 通过本手稿所述程序, 共转移了 3 909个胚胎 (1 335个新鲜胚胎和 2 574个玻璃化胚胎)。由于这项技术, 新鲜和玻璃化转移胚胎的后代率分别为62.9% 和 42.5,分别为 383940414243,44,45,46,47. 许多研究都是基于这一技术: marco-jiménez等人.38,39,40,41, vicente等人.42, Viudes-de-castro等人43, Saenz-de-juano等人44,45,47, lavara et al.46岁

实施这一技术的实际建议说明如下。在胚胎培养实验中, 也建议使用新的导管进行胚胎移植, 而不是用于在培养介质和操作介质之间移动胚胎的导管。这样可以避免矿物油的转移, 并确保最佳的流量。在 ET 期间, 重要的是尽量减少对生殖道的处理, 因为过度操纵输卵管可能会导致粘连。如果输卵管扭曲, 使用硬膜外注射器试图正确定位它, 而不是导管, 因为它包含胚胎和机械操作可能导致他们的损失。一旦导管通过输卵管, 它很容易滑倒。如果没有, 导管可能已经偏离。一旦进入输卵管, 如果介质不流动, 请稍微将导管移出, 然后再次尝试重新插入。如果仍然不流动, 导管堵塞。将其从输卵管中取出, 并将其释放到含有清洁介质的盘子中。然后, 将胚胎重新加载到另一个导管中, 然后尝试将其重新插入输卵管。运送通常发生在 morula 转移后的28-30。

此外, 有证据表明, 假女性胚胎发育阶段可能比子宫环境先进, 但与之相反。具体而言, 胚胎有能力等待良好的子宫环境, 但子宫环境不能等待胚胎在适当的阶段植入10。关于玻璃化胚胎, 经过短期的储存, 有可能使胚胎的发育阶段与相应的良好子宫环境同步。此外, 如果胚胎捐献者也是胚胎接受者, 通过使用玻璃化技术并在随后的第48周期内转移胚胎, 可以绕过超排卵对子宫内膜的有害影响。在兔体内, 玻璃化胚胎转移到受者的输卵管中, 诱导在60-62小时前排卵 (异步) 是一种高效的技术44,49。因此, 有人认为10-12 的输卵管胚胎过渡可以解释在恢复细胞生理和替换死细胞方面的有益作用, 并可能修复胚胎过程中粘液涂层所引起的损伤操纵。此外, 玻璃化胚胎在发育方面出现延误, 因为它们在储存过程中被代谢暂停。因此, 将冷冻保存的胚胎转移到异步接受者体内, 可以使胚胎恢复其代谢活动, 从而使胚胎发育阶段与子宫环境同步。相反, 如果冷冻保存的胚胎被转移到共时受体, 母亲和胚胎之间的交叉谈话会阻碍成功怀孕的开始。在兔体内, 冷冻保存的肉管内移植后, 获得了最高的存活率.我们的数据与本报告一致, 尽管在冷冻保存后, morula 阶段根据其70-72 小时的压实程度表现出不同的存活率 (表 2)。在这里, 与非压实的相比, 压实的在出生时的存活率较高, 这与以往的报告一致, 表明每个发展阶段相对于低温保护剂的渗透都有自己的机制。在冷冻保存溶液50的加入过程中脱水的程度.在这些技术的基础上, 我们已经证明, 玻璃化和输卵管内胚胎移植的结合是一种成功的策略, 可以在液氮储存15年后重建兔子种群, 而不会对其自身的数量产生不利影响。解冻后的生存和活产51

要成功执行此技术, 应考虑以下详细信息。重要的是要记住, 用于玻璃化的连续介质 (DPBS、平衡溶液、玻璃化溶液) 的密度不断增加, 可能会导致胚胎因进行性胚胎脱水而收缩。然而, 当胚胎与培养基平衡时, 它的正常外观就会恢复。此外, 当胚胎在密度增加的介质之间移动时, 由于密度运动, 它往往会移动到介质表面。为了避免胚胎丢失和确保玻璃化的时间, 建议在小滴培养基中进行玻璃化, 以保持胚胎的位置。

最后, 我们描述了 ET 技术和胚胎玻璃化方法, 以促进未来的研究, 使用兔子作为模型。基于兔子与人之间接近的系统发育距离, 该模型的使用可以很容易地转化为人类临床医学。此外, 我们的方法还提供了一些卫生和经济方面的优势, 符合动物福利的3R 概念 (更换、减少和细化), 同时保持了改善实验动物人道待遇的目标。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了西班牙经济和竞争力部 (AGL201-852-C2-R) 和 Generalitat Valenciana 研究方案 (PrometeoII 2014/3636) 的资助。N. Macowan 英语语言服务的英文版本修订

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 332
Buprenorphine hydrochloride Alvet Escartí 626 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buserelin Acetate Sigma Aldrich B3303
Clorhexidine digluconate soap Alvet Escartí 0265DCCJ500B
Clorhexidine digluconate solution Alvet Escartí 0265DCCA500B
CO2 Air Liquide 99921 CO2 N48.
CO2 Incubator Fisher scientific 15385194
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich W387509
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) Sigma Aldrich D5773 Without calcium chloride.
Electric razor Oster Golden A5 078005-140-002
Endoscope camera Optomic Spain S.A OP-714
Endoscope trocar with silicone leaflet valve Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 30114GK Lightweight trocar model.
Enrofloxacin Alvet Escartí 9993046 To be ordered by a licensed veterinarian.
Epicraneal needle 23G Alvet Escartí 514056353 Smaller needles can be also used.
Epidural catheter Vygon corporate 187.10
Epidural needle Vygon corporate 187.10
Ethylene Glycol Sigma Aldrich 102466-M
Eye ointment Alvet Escartí 5273
Ketamine hydrochloride Alvet Escartí 184 To be ordered by a licensed veterinarian.
Laparoscopy equipment Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 26003 AA Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel.
Light source Optomic Spain S.A Fibrolux 250
Liquid Nitrogen Air Liquide P1505XXX
Mechanical CO2 insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. Endoflator®
Meloxicam Alvet Escartí 9993501 To be ordered by a licensed veterinarian.
Petri dishes, 35-mm Sigma Aldrich CLS430165-500EA
Plastic dressing (Nobecutan) IBOR medica 7140028
Plastic Straw 0.25 mL IMV - technologies 6431
Povidone iodide solution Alvet Escartí 02656DPYS500S
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
Silicone tube for insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 20400040
Stereomicroscope Leica MZ16F There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few.
Sterile Gloves Alvet Escartí 087GL010075
Sterile gown Alvet Escartí 12261501
Sterile mask Alvet Escartí 058B15924B
Straw Plug IMV - technologies 6431
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Syringe, 1-mL Fisher scientific 11750425
Syringe, 5-mL Fisher scientific 11773313
Urinary catheter IMV - technologies 17722
Waterbath RAYPA BAE-4
Xylazine Alvet Escartí 525225 To be ordered by a licensed veterinarian.
Rabbits Universitat Politècnica de València Line A Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (ART). Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8, (4), 388-402 (2017).
  2. Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo vitrification in rabbits: Consequences for progeny growth. Theriogenology. 84, (5), 674-680 (2015).
  3. Sirard, M. A. The influence of in vitro. fertilization and embryo culture on the embryo epigenetic constituents and the possible consequences in the bovine model. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8, (4), 411-417 (2017).
  4. Feuer, S. K., Rinaudo, P. F. Physiological, metabolic and transcriptional postnatal phenotypes of in vitro. fertilization (IVF) in the mouse. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8, (4), 403-410 (2017).
  5. Jiang, Z., et al. Genetic and epigenetic risks of assisted reproduction. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 44, 90-104 (2017).
  6. Fleming, T. P., Velazquez, M. A., Eckert, J. J. Embryos, DOHaD and David Barker. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 6, (5), 377-383 (2015).
  7. Sparks, A. E. Human embryo cryopreservation-methods, timing, and other considerations for optimizing an embryo cryopreservation program. Seminars in Reproductive Medicine. 33, (2), 128-144 (2015).
  8. Swain, J. E. Optimal human embryo culture. Seminars in Reproductive Medicine. 33, (2), 103-117 (2015).
  9. Heape, W. Preliminary note on the transplantation and growth of mammalian ova within a uterine foster-mother. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 48, 457-459 (1890).
  10. Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal embryo transfer and vasectomy in the mouse model. Journal of Visualized Experiments. (84), e51214 (2014).
  11. Kidder, J. D., Roberts, P. J., Simkin, M. E., Foote, R. H., Richmond, M. E. Nonsurgical collection and nonsurgical transfer of preimplantation embryos in the domestic rabbit (Oryctolagus cuniculus) and domestic ferret (Mustela putorius furo). Journal of Reproduction and Fertility. 116, (2), 235-242 (1999).
  12. Tıras, B., Cenksoy, P. O. Practice of embryo transfer: recommendations during and after. Seminars in Reproductive Medicine. 32, (4), 291-296 (2014).
  13. Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53, (3), 228-231 (2014).
  14. Moreno-Moya, J. M., et al. Complete method to obtain, culture, and transfer mouse blastocysts nonsurgically to study implantation and development. Fertility and Sterility. 101, (3), e13 (2014).
  15. Hasler, J. F. Forty years of embryo transfer in cattle: a review focusing on the journal Theriogenology, the growth of the industry in North America, and personal reminisces. Theriogenology. 81, (1), 152-169 (2014).
  16. Bauer, C. The baboon (Papio sp.) as a model for female reproduction studies. Contraception. 92, (2), 120-123 (2015).
  17. Martinez, E. A., et al. Nonsurgical deep uterine transfer of vitrified, in vivo-derived, porcine embryos is as effective as the default surgical approach. Science Reports. 5, 10587 (2015).
  18. Besenfelder, U., Brem, G. Laparoscopic embryo transfer in rabbits. Journal of Reproduction and Fertility. 99, 53-56 (1993).
  19. Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47, (5), 1051-1060 (1997).
  20. Besenfelder, U., Havlicek, V., Kuzmany, A., Brem, G. Endoscopic approaches to manage in vitro and in vivo embryo development: use of the bovine oviduct. Theriogenology. 73, (6), 768-776 (2010).
  21. Fonseca, J. F., et al. Nonsurgical embryo recovery and transfer in sheep and goats. Theriogenology. 86, (1), 144-151 (2016).
  22. Denker, H. W. Structural dynamics and function of early embryonic coats. Cells Tissues Organs. 166, 180-207 (2000).
  23. Marco-Jiménez, F., López-Bejar, M. Detection of glycosylated proteins in rabbit oviductal isthmus and uterine endometrium during early embryo development. Reproduction in Domestic Animals. 48, (6), 967-973 (2013).
  24. Ménézo, Y. J., Hérubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reproductive BioMedicine Online. 4, (2), 170-175 (2002).
  25. Fischer, B., Chavatte-Palmer, P., Viebahn, C., Navarrete Santos, A., Duranthon, V. Rabbit as a reproductive model for human health. Reproduction. 144, (1), 1-10 (2012).
  26. Besenfelder, U., Strouhal, C., Brem, G. A method for endoscopic embryo collection and transfer in the rabbit. Zentralbl Veterinarmed A. 45, (9), 577-579 (1998).
  27. Daniel, N., Renard, J. P. Embryo transfer in rabbits. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (1), (2010).
  28. Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters rabbit foetal placenta at transcriptomic and proteomic level. Reproduction. 147, (6), 789-801 (2014).
  29. Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. Biotechniques. 47, (5), 919-924 (2009).
  30. Duan, X., Li, Y., Di, K., Huang, Y., Li, X. A nonsurgical embryo transfer technique in mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 32, (4), 440-446 (2016).
  31. Denker, H. W., Gerdes, H. J. The dynamic structure of rabbit blastocyst coverings. I. Transformation during regular preimplantation development. Anatomy and Embryology. 157, 15-34 (1979).
  32. Seidel, G. E., Bowen, R. A., Kane, M. T. In vitro fertilization, culture and transfer of rabbit ova. Fertility and Sterility. 27, 861-870 (1976).
  33. Binkerd, P. E., Anderson, G. B. Transfer of cultured rabbit embryos. Gamete Research. 2, 65-73 (1979).
  34. Murakami, H., Imai, H. Successful implantation of in vitro cultured rabbit embryos after uterine transfer: a role for mucin. Molecular Reproduction and Development. 43, 167-170 (1996).
  35. Techakumphu, M., Wintenberger-Torrèsa, S., Sevelleca, C., Ménézo, Y. Survival of rabbit embryos after culture or culture/freezing. Animal Reproduction Science. 13, (3), 221-228 (1987).
  36. Gitzelmann, C. A., et al. Cell-mediated immune response is better preserved by laparoscopy than laparotomy. Surgery. 127, (1), 65-71 (2000).
  37. Huang, S. G., Li, Y. P., Zhang, Q., Redmond, H. P., Wang, J. H., Wang, J. Laparotomy and laparoscopy diversely affect macrophage-associated antimicrobial activity in a murine model. BMC Immunology. 14, 27 (2013).
  38. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Almela-Miralles, V., Vicente, J. S. Development of Cheaper Embryo Vitrification Device Using the Minimum Volume Method. Public Library of Science One. 11, (2), e0148661 (2016).
  39. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Generation of live offspring from vitrified embryos with synthetic polymers supercool X-1000 and Supercool Z-1000. CryoLetters. 35, 286-292 (2014).
  40. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Use of cyclodextrins to increase cytoplasmic cholesterol in rabbit embryos and their impact on live KITs derived from vitrified embryos. Cryoletters. 35, 320-326 (2014).
  41. Marco-Jiménez, F., Lavara, R., Jiménez-Trigos, E., Vicente, J. S. In vivo development of vitrified rabbit embryos: Effects of vitrification device, recipient genotype, and asynchrony. Theriogenology. 79, (7), 1124-1129 (2013).
  42. Vicente, J. S., et al. Rabbit morula vitrification reduces early foetal growth and increases losses throughout gestation. Cryobiology. 67, 321-326 (2013).
  43. Viudes-de-Castro, M. P., Marco-Jiménez, F., Cedano-Castro, J. I., Vicente, J. S. Effect of corifollitropin alfa supplemented with or without Lh on ovarian stimulation and embryo viability in rabbit. Theriogenology. 98, 68-74 (2017).
  44. Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters at transcriptomic and proteomic level rabbit foetal placenta. Reproduction. 147, 789-801 (2014).
  45. Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Lavara, R., Vicente, J. S. Direct comparison of the effects of slow freezing and vitrification on late blastocyst gene expression, development, implantation and offspring of rabbit morulae. Reproduction in Domestic Animals. 49, 505-511 (2014).
  46. Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Long-term and transgenerational effects of cryopreservation on rabbit embryos. Theriogenology. 81, 988-992 (2014).
  47. Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo transfer manipulation cause gene expression variation in blastocysts that disrupt implantation and offspring rates at birth in rabbit. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 207, 50-55 (2016).
  48. Roque, M., Valle, M., Kostolias, A., Sampaio, M., Geber, S. Freeze-all cycle in reproductive medicine: current perspectives. JBRA Assisted Reproduction. 21, (1), 49-53 (2017).
  49. Tsunoda, Y., Soma, T., Sugie, T. Effect of post-ovulatory age of recipient on survival of frozen-thawed rabbit morulae. Journal of Reproduction and Fertility. 65, (2), 483-487 (1982).
  50. Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17, (3), 744-751 (2002).
  51. Lavara, R., Baselga, M., Vicente, J. S. Does storage time in LN2 influence survival and pregnancy outcome of vitrified rabbit embryos? Theriogenology. 76, (4), 652-657 (2011).
家兔模型最佳胚胎阶段微创胚胎移植与胚胎玻璃化
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).More

Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter