Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

העברת העובר פולשני המינימלי העובר ויטריפיקציה בשלב העובר אופטימלית במודל ארנב

doi: 10.3791/58055 Published: May 16, 2019

Summary

טכניקות הרבייה בסיוע (אמנויות) הן בהערכה רציפה כדי לשפר את התוצאות ולהפחית את הסיכונים הקשורים. כתב יד זה מתאר הליך מינימלית פולשני העברת העובר עם פרוטוקול הקריוגנית יעיל המאפשר שימוש בארנבים כמודל בעלי חיים אידיאלי של רבייה אנושית.

Abstract

טכניקות הרבייה בסיוע (אמנויות), כגון תרבות העובר מחוץ לאדמה או קריוגנית העובר, להשפיע על דפוסי התפתחות טבעית עם השלכות לאחר הלידה ולידה. כדי להבטיח את innocuousness של יישומי אמנות, מחקרים במודלים של בעלי חיים נחוצים. בנוסף, כצעד אחרון, מחקרי פיתוח העובר דורשים הערכה של היכולת שלהם לפתח צאצאים בריאים לטווח מלא. כאן, העברת העובר אל הרחם הוא הכרחי לבצע כל ניסוי הקשורות לאומנויות.

הארנב שימש כאורגניזם מודל לחקר הרבייה של היונקים במשך יותר ממאה שנה. בנוסף הקרבה פילוגנטי שלו למין האנושי הגודל הקטן שלה ועלות תחזוקה נמוכה, יש לו מאפיינים הרבייה חשוב כגון ביוץ המושרה, כרונולוגיה של התפתחות עובריים מוקדם דומה לבני אדם הריון קצר המאפשרים לנו ללמוד את ההשלכות של יישום האמנות בקלות. יתר על כן, אמנויות (כגון הזרקת זרע תאיים, העובר תרבות, או הקפאה) מוחלים עם יעילות מתאימה במין הזה.

השימוש בטכניקת המעבר לפרוסקופי ובפרוטוקול הקריוגנית המוצג במאמר זה, אנו מתארים 1) כיצד להעביר עוברים דרך טכניקה קלה, פולשנית ומינימלית ו -2, פרוטוקול אפקטיבי לאחסון לטווח ארוך של ארנבים עוברים לספק יכולות לוגיסטיות זמן גמישות ויכולת להעביר את המדגם. התוצאות שהתקבלו לאחר העברת עוברי ארנבים בשלבים התפתחותיים שונים מצביעים על כך morula הוא השלב האידיאלי עבור התאוששות העובר הארנב והעברה. לפיכך, נדרשת העברה של עובר האובידיוס, המצדיקים את ההליך הכירורגי. יתר על כן, הארנב מורולאי בהצלחה מועברים והועבר לפרואו, ומוכיחים את האפקטיביות של הטכניקות המתוארות.

Introduction

עם מטרות של עקיפת פוריות האדם או שיפור הפצת בעלי חיים של ערך גנטי גבוה ושמירה על משאבים גנטיים בעלי חיים, סט של טכניקות שנקרא באופן קולקטיבי טכנולוגיות רבייה, כגון סופר ביוץ, ב הפריה חוץ גופית , תרבות העובר, או הקפאה,פותחו 1,2. כיום, מקבלים טיפולים הורמונליים כדי לעורר את השחלות ולייצר מספר רב של זקיקי השחלות העאליים1. Oocytes שנאסף מזקיקי אלה יכול להיות התבגר, מופרית, ופיתח בתוך מבחנה עד שהם הקפאה או הועבר אמהות פונדקאית3. עם זאת, במהלך טיפולים אלה, המשחק והזיטים חשופים לסדרה של תהליכים לא פיזיולוגיים שיכולים לדרוש הסתגלות העובר כדי לשרוד בתנאים אלה4,5. הסתגלות זו אפשרית עקב הפלסטיות המוקדמת של העובר, המאפשר שינויי העובר בביטוי הגנים ובתכנות התפתחותי6. עם זאת, שינויים אלה יכולים להשפיע על השלבים הבאים של התפתחות העובר עד לבגרות, ועכשיו הוא מקובל באופן נרחב כי שיטות, תזמון, הליך הקפאה או תנאי תרבות להראות תוצאות שונות על גורל העובר7 , 8. לכן, כדי להבהיר את ההשפעות הנובעות של אומנויות, השימוש במודלים של בעלי חיים מאופיין הוא בלתי נמנע.

הלידה הראשונה שתועדה כתוצאה מהעברת עוברי יונקים התקיימה ב-18909. היום, העברת העובר (ET) לנקבה פונדקאית היא צעד מכריע בלימוד השפעות האמנות המושרה במהלך טרום ההשתלה על שלבים לפיתוח העובר הבאים10. טכניקות ET תלויות בגודל ובמבנה האנטומי של כל חיה. במקרה של דגמים גדולים של בעלי חיים, זה היה אפשרי לבצע ET על ידי שיטות ET שאינן כירורגית, אבל בגודל קטן יותר צנתור מיני של צוואר הרחם הוא מורכב יותר טכניקות כירורגי משמשות לעתים קרובות11. עם זאת, ET כירורגית יכול לגרום לדימום שעלול לפגוע השרשה והתפתחות העובר, כמו דם יכול לפלוש לומן הרחם, גרימת מוות העובר10. שיטות שאינן כירורגיות ו-ET מיושמים עדיין בבני אדם, בבונים, שור, חזירים ועכברים12,13,14,15,16,17, אבל כירורגי מינים אלה עדיין נמצאים בשימוש במינים כגון עיזים, כבשים או בעלי חיים אחרים אשר מציגים קשיים נוספים10,18,19,20,21, כגון ארנבים (שניים קרוקס עצמאיים) או עכברים (בגודל קטן). עם זאת, שיטות העברה כירורגית נוטים להיות הוחלף בהדרגה על ידי שיטות פחות פולשנית. אנדוסקופיה שימש להעברת עוברים, למשל, בארנבים, חזירים ומעלי גירה קטנים18,19,20. אלה שיטות מינימלית פולשנית אנדוסקופיה ניתן להשתמש כדי להעביר עוברים אל ampulla באמצעות infundibulum, אשר חיוני ארנבים הפגינו השפעות מועילות במינים מסוימים20. הדבר מתבסס על חשיבות הדיאלוג הנכון בין העובר לבין האם בשלבי העובר המוקדמים בתעלת ההטלה. כפי שהוזכר לעיל, שיפוץ העובר המתרחשים בארנבים במהלך העברת העובר דרך תעלת ההטלה חיונית להשגת עוברים המסוגלים להשתיל22,23.

מודלים בעלי חיים גדולים יותר, כגון שור, מעניינים משום שהתכונות הביוכימי והשהשתלה דומות לאלה שבמין האנושי24. עם זאת, בעלי חיים גדולים הם יקרים מדי לשימוש בניסויים ראשוניים, ומכרסמים נחשבים מודל אידיאלי (76% אורגניזמים מודל הם מכרסמים) למחקר מעבדה25. עם זאת, מודל הארנב מספק כמה יתרונות על פני מכרסמים בלימודי הרבייה, כמו כמה תהליכים ביולוגיים הרבייה על ידי בני אדם דומים יותר ארנבים מאשר אלה בעכברים. האדם והארנבים להציג הפעלה דומה כרונולוגי הגנום העובריים, מבנה השליה והמניפולציה. בנוסף, שימוש בארנבים ניתן לדעת את העיתוי המדויק של הפריה ושלבי היריון בשל הביוץ המושרה25. מחזורי חיים בארנבות קצרים, השלמת ההריון במשך 31 ימים והגיעו לבגרות בסביבות 4-5 חודשים; החיה קלה לטיפול בשל התנהגותו הצייתנים והלא-אגרסיבית, והאחזקה שלה חסכונית מאוד בהשוואה להוצאות של בעלי חיים גדולים יותר. כמו-כן, חשוב לציין שבארנבים יש רחם דופלקס עם שני cervixes עצמאיים11,25. זה מציב את הארנב בעמדה מועדף, כמו עוברים מן הקבוצות הנסיוניות השונות ניתן להעביר לאותה חיה, אבל לתוך קרן רחם אחרת. זה מאפשר לנו להשוות בין ההשפעות הנסיוניות, הפחתת הגורם האימהי מהתוצאות.

כיום, לא כירורגי שיטות ET אינם בשימוש ארנב. מחקרים מסוימים שבוצעו בסוף שנות ה-90 באמצעות טכניקת העברת הדואר הביאו לשיעורי משלוח נמוכים החל מ-5.5% עד 20.0%11,26 לעומת 50-65% בשיטות כירורגיות, ביניהן הליך הלפרוסקופיה המתואר על ידי בסננפלדר וברים18. שיעורי ההצלחה הנמוכים של שיטות ET אלה שאינם כירורגיים בארנבים חופפים עם חוסר שיפוץ העובר הדרוש בתעלת ההטלה, אשר נמנעת במהלך הניתוח. כאן, אנו מתארים הליך אפקטיבי מינימלית לפרוסקופי ET באמצעות ארנבים כאורגניזם מודל. טכניקה זו מספקת מודל לחקר הרבייה נוסף בבעלי חיים גדולים ובבני אדם.

מכיוון שלארנבים יש חלון זמן צר במיוחד להשרשת העובר, ET במין זה מחייב מידה גבוהה של סנכרון בין השלב ההתפתחותי של העובר ב-ET והמצב הפיזיולוגי של הנמען27. במקרים מסוימים, לאחר טיפול הרבייה המאט את התפתחות העובר (כגון בתרבות מבחנה ) או משנה את הקבלה של רירית הרחם (כגון טיפולים ביוץ), אין סנכרון בין העובר והרחם האימהי. מצבים אלה יכולים להשפיע לרעה על התוצאה. כדי להגיב בהקשרים אלה, אנו מתארים ויטריפיקציה הארנב יעיל מורולה הפרוטוקול המאפשר לנו להשהות, לארגן ולחדש את הניסויים. תהליך זה הוא באופטימיות רצוי ללימודי הרבייה ונותן לנו את היכולת לאחסון לטווח ארוך של עוברים, המאפשר הובלה שלהם. הליך הלפרוסקופי ואסטרטגיות הקריוסקופיות מאפשרים תכנון טוב יותר של מחקרים עם פחות בעלי חיים. לפיכך, המתודולוגיה שלנו מציעה יתרונות היגיוניים וכלכליים ומתאימים לקונספט של שלושה ר' (החלפה, הפחתה ועידון) של מחקר בעלי חיים במטרה לשפר את הטיפול האנושי בבעלי חיים ניסיוניים. כך, עם שיטות אלה, הארנבים מהווים אורגניזם מודל אידיאלי עבור vivo הרבייה .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים המשמשים במחקר זה בוצעו בהתאם להנחיה 2010/63/האיחוד האירופי לניסויים בבעלי חיים ולביקורת ואושר על ידי הוועדה האתית לניסויים עם בעלי חיים של הפוליטטיניקה דה ואלטק, ספרד (קוד מחקר: 2015/VSC/אפונה/00170). XGD, FMJ, MPVC ו-JSV מחזיקה אישור הרשאה שהונפק על ידי הממשל הממשלות ולנסיה להתנסות בבעלי חיים. XGD מוסמכת לפקח על הרווחה והטיפול בבעלי החיים במהלך הניסוי.

1. העברת עובר

  1. הכנת נקבות הנמען
    1. השתמש רק נשים בוגרות מינית (> 4.5 חודשים בן).
    2. שבוע לפני ET, להתאים נקבות ל 16 h אור/8 h משטר כהה כדי ליזום צמיחה פוליקולרית ומוגברת קבלה נשית.
    3. בחר את הנקבות הנמען, התבוננות בטורגיקות ובצבע של הפות. אם הפות הוא טורד ואדמדם, הנקבה היא פתוחה.
    4. לגרום פסבדו-אקראי (ביוץ) על ידי הזרקה בודדת שרירית של 1 μg של אצטט buserelin (אנלוגי סינתטי של הורמון משחרר Gonadotropin) ללא קשר למשקל הגוף.
      הערה: בדרך כלל, 0.8 μg היא מינון מתאים עבור הביוץ בתוך שפנים בגודל בינוני (4-5 ק"ג), כך 1 μg בדרך כלל מבטיח את הביוץ.
    5. לגרום הביוץ כמה ימים רבים מראש כמו גיל העוברים להיות הועבר (למשל, 70-72 h לפני מורולה ET טריים).
  2. הרדמה וחוסר כאבים
    1. שוקלים את הארנב ומעמיסים את ההרדמה הבאה ומשככי כאבים.
      1. ב 1 מזרק mL עם מחט 30g: לטעון xylazine (5mg/ק"ג) ו בופרנורפין הידרוכלוריד (0.03 מ"ג/ק"ג). בעוד מזרק 1 מ ל עם מחט pericranial 23G, טען קטמין הידרוכלוריד (35 מ"ג/ק"ג).
    2. החזיקו את הארנב והזבו את התערובת הבופרזטין-בופריפין.
    3. הכניסו את המחט הpericranial עם קטמין בווריד האוזן השולי והציגו לאט את כל תכני המזרק.
    4. תקן את המחט ולהשאיר אותו מוכנס לאורך השלבים הנותרים כדי לנהל הרדמה יותר במידת הצורך.
    5. השאר את הארנב בכלוב (נקי ובלי כל בעלי חיים אחרים) על הבמה החם.
    6. פעם מחוסרת הכרה, להחיל משחה העין כדי למנוע יובש של העין ולבדוק את העדר palpebral freflex.
      הערה: פרוטוקול זה מספק מטוס הרדמה כירורגית למינימום של 30 דקות. אם נדרש זמן רב יותר, הכנס מינונים נוספים עם מחצית מכמות הקטמין ההידרוכלוריד המתואר בשנת 1.2.1 לאחר 30 דקות.
    7. עקוב אחר עומק ההרדמה על ידי בדיקת התנועה רפלקס הדוושה ונשימה. שינויים בתבנית הנשימה לקצב לא סדיר ומהיר יותר מצביעים על אובדן המישור התקין של ההרדמה.
    8. הצג את צבע הקרומים הריריות (עיניים, שפתיים וכו '), קצב נשימה (30-60 נשימות לדקה), קצב הלב (120-325 פעימות לדקה) וטמפרטורת הרקטום (38-39.6 ° c).
    9. שמונה שעות לפני ההעברה, מניעת מזון מבעלי חיים כדי למנוע את הגודל והפעילות הגדולים יותר עד לסיום תהליך ה-ET. . תשאירו גישה חופשית למים
  3. הכנה לעובר
    1. חם העובר מניפולציה מדיה ל 25 ° צ': בסיס בינוני (BM), המורכב של מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS) שיושלם עם 0.2% (w/v) של סרום של בקר של שור.
    2. עבודה תחת stereomicroscope, לשטוף טרי או להפשיר (שלב 2) עוברים עם BM.
    3. באמצעות כפפות סטרילי, לצרף את הצנתר התקין 17G מוגדר למזרק של 1 מ"ל.
    4. מנושף 1 ס מ של BM לתוך הצנתר, ואחריו בועה אוויר קטן.
    5. מנושף 5-7embryos בנפח של 10 μL של BM, ואחריו בועת אוויר קטנה אחרת.
    6. לסיים את טעינת הקטטר על ידי מבסת 1 ס מ של BM.
  4. העברת עובר
    1. שקול את השימוש של כפפות סטרילי, שמלה ומסכה כדי להבטיח סביבה אספטי.
    2. לעקר כלים כירורגיים, לנקות את המשטחים שבהם הניתוח יבוצע, ולנגב אותם עם 70% אתנול.
    3. לבצע הרדמה כפי שמפורט בעבר (שלב 1.2), בדיקת אובדן רפלקסים.
    4. מגלחים את הפרווה מהבטן הגגעלת. עם תער חשמלי
    5. הכינו את הבטן הגסית באופן כאוטית.
      1. לנקות את האזור כירורגי ולהסיר את כל השיער הנותר. שטוף את האזור הכירורגי עם סבון גלוקונקסטין. האזור עם תמיסת כלורקסדין ואתנול 96 º (3 פעמים).
    6. מניחים את החיה על שולחן כירורגי חם, בעמדת טרדלינבורג (ראש למטה ב 45 °) כדי להבטיח כי הקיבה והמעיים ממוקמים בגולגולת. שקול את פינוי שלפוחית. השתן אם זה מטורד אם נפגעו מעיים כלשהי בתהליך, החיה עלולה למות. לכן חשוב לקבל אותם ממוקם כראוי (איור 1).
    7. לכסות את האזור באמצעות מגבת סטרילית, עם חור (הגדר) חשיפת האזור מגולח, כדי להפריד את האתר הכירורגי מאזורים פוטנציאליים מזהם.
    8. הכנס מכונית אנדוסקופית אחת 5 ס מ לתוך חלל הבטן, 2 ס מ caudal לתהליך xiphoid, וinsufflate דרכו את החלל הצפק עם הלחץ והוויסות insufflator מכני.
      הערה: לחץ פנים-בטן צריך להיות 8-12 mmHg עם CO2 (איור 1a).
    9. הכנס את המצלמה אנדוסקופ דרך המכונית אנדוסקופית (איור 1B).
      הערה: לזהות את מערכת הרבייה, קביעת הסטטוס והמיקום של שפך ו ampulla לפני ET כדי להקל על השלבים הבאים.
    10. הכנס את המחט 17-G אפידורל לתוך האזור האינטינומי בין 2-3 ס מ מ שפך (איור 1b).
    11. זהה את הכניסה של שפך (איור 2a, 2a).
    12. הכנס את הקטטר טעון (שלב 1.3) דרך מחט אפידורל לתוך הבטן (איור 1C).
    13. אתר את צינור ההטלה והוסף 1-2 ס מ של קטטר האפידורל דרך שפך ב ampulla (איור 2a-2a). אל תתקדם רחוק מאוד לתוך תעלת ההטלה כדי למנוע נזק ודימום.
    14. שחררו את העוברים לצינור ההטלה על ידי לחיצה עדינה על הבוכנה של המזרק ביחד לצנתר (איור 2D-2d). שתי בועות האוויר חייב לצאת הקטטר.
    15. להסיר את הצנתר רק לאחר העוברים שוחרר.
    16. שטפו את הקטטר, מנשפת ומשחררים את המדיום כדי לבדוק את העדר העוברים ולאשר את העברתו המוצלחת.
    17. חזור על שלבים ה1.4.11 ל1.4.16 בצד השני של הרחם, אם תרצה.
    18. הסר את המחט אפידורל ומצלמה אנדוסקופ.
    19. שחרר CO2 דרך המכונית אנדוסקופית. אם הגזים העודפים יישארו בבטן החיה, יהיה לו כאב וחוסר נוחות.
    20. הסר את המכונית האנדוסקופית מחלל הבטן. . תסיר את המגבת הכירורגית
    21. . להפסיק את ההרדמה
    22. לנקות את החתך שנעשו על ידי נקז עם פתרון כלורהקדין. סגרו את החתך שנעשה על ידי הטרוקאר עם אלומיניום מיקרומי ורוטב פלסטי.
  5. טיפול פוסט-פעיל
    1. לטפל בבעלי חיים עם אנטיביוטיקה: 10 מ"ג/ק"ג של enrofloxacin, תת-עורי, כל 24-h עבור 5 ימים.
    2. ניהול משככי כאבים: בופרנורפין הידרוכלוריד (0.03 מ"ג/ק"ג), בפנים, כל 12 שעות במשך 3 ימים; מלוקסיעם (0.2 מ"ג/ק"ג), תת-עורי, כל 24-h במשך 3 ימים.
    3. ניטור בעלי החיים לפחות 30 דקות לאחר הניתוח (בהתאם לבעל החיים ומינון ההרדמה בשימוש) לוודא שהם לשחזר את התנאים הפיזיולוגיים שלהם.
    4. זהה את הנמען (למשל, קעקוע האוזן) וחיות הבית בנפרד בכלוב נקי עם המצב הסביבתי המתאים.

Figure 1
איור 1: העברת העובר לפרוסקופ בסיוע לפרוסקופיה (מבט חיצוני). A) החדרת מכונית אנדוסקופית (יציאה אחת). ב) החדרת המצלמה האנדוסקופית והמחט האפידורל (חץ שחור). ג) החדרת קטטר העברת העובר (חץ לבן) דרך המחט אפידורל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: העברת העובר לפרוסקופ בסיוע לפרוסקופיה (מבט פנימי). א: החדרת הקטטר דרך המחט אפידורל לתוך אזור הבטן. כוכבית מציין את infundibulum. B, C, D: הקטטר הטעון עם העוברים מוכנס לאזור ampulla ברחבי infundibulum. E, F: שחרור העוברים, אושר על ידי ויזואליזציה של צינור ההטלה נפוח. דמות זו הותאמה מרקו-חימנס אל. 38. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. ויטריפיקציה העובר והתחממות

  1. בצע את כל המניפולציות בטמפרטורת החדר (סביב 22 ° c) כדי להפחית את רעילות הפתרון הויטריפיקציה בטמפרטורות חמות יותר.
    הערה: ניתן להזיז עוברים באמצעות הצינורות האוטומטיים של 0.1-2 μL בפרוטוקול זה, אך התקנים דומים אחרים להזזת העוברים הגוררים את אמצעי האחסון המינימלי יכולים להיות מתאימים.
  2. העבר את העוברים בתהליך נוסף של שני שלבים:
    1. מניחים את העוברים 2 דקות בתמיסה הכוללת של 10% (v/v) אתילן גליקול 10% (v/v) diמתיל סולפוקסיד הומס ב BM.
    2. הזיזו את העוברים (משלב 2.2.1) לדקה אחת לפתרון ויטריפיקציה המורכב מ -20% (v/v) אתילן גליקול ו -20% (v/v) diמתיל סולפוקסיד הומס ב-BM.
  3. לטעון את העוברים לתוך 125 μL פלסטיק מיני (אשר מכיל קצה סגור אחד עם תקע כותנה ואקסטרים אחד פתוח). התהליך מחושב באיור 3.
    1. זוג הקצה הסגור של 0.125 μL ministraw עם המיקרומינפק המתאים (למשל Captroll III®).
    2. משוף מוניטור עד 1/3 של אורך הקש, לאחר בועת אוויר קטנה.
    3. מנושף את העוברים בנפח של 40 μL של פתרון ויטריפיקציה, ואחריו בועת אוויר קטנה אחרת.
    4. משומת מוניטור עד שבר הנוזל הראשון (שלב 2.3.2) מגיע כותנה.
    5. סגור את הקצה הפתוח באמצעות תקע קש.
  4. בצע את שלב 2.2.2 בזמן שלב 2.3 נעשה כדי להבטיח כי לא יותר מדקה אחת חולף, אשר יהיה רעיל לעוברים.
  5. לצלול המיניקש ישירות לתוך חנקן נוזלי כדי להשיג ויטריפיקציה.
  6. לאחסן את המיניקש בבית מלחמה לחנקן בזמן הרצוי.
  7. הפשרת העוברים בצעד אחד.
    1. מניחים את המיניקש אופקית 10 ס מ מהחנקן הנוזלי עבור 20-30 s.
    2. כאשר תהליך התגבשות מתחיל בתוך ministraw, לטבול את המיניקש באמבט מים ב 25 ° c עבור 10-15 s.
    3. תסיר את התקע של המיניקש. ותחתוך את תקע הכותנה
    4. עם מיקרומנפק מצמידים, לגרש את כל התוכן ministraw לתוך צלחת המכילה 0.33 M הפתרון בשעה 25 ° c ב BM עבור 5 דקות.
      הערה: יש לבצע פעולה זו במהירות על-מנת לצמצם את החשיפה של העובר לפתרון הויטריפיקציה.
    5. להעביר את העוברים לצלחת חדשה המכילה את הפתרון BM עבור 5 דקות נוספות.
    6. שקול רק עוברים שאינם פגומים (עם מעיל ריריות שלמים וסונה pellucida) כדי להמשיך עם ET.
      הערה: קח בחשבון כי העוברים המופששים, העברות אסינכרוני (למשל, 60-62 h ב העברות morula) עשוי לשפר את התוצאות על ידי מתן סנכרון מחדש בין העובר ואת האנדורירית האימהית.

Figure 3
איור 3: שייטיזציה של קש שנטען כראוי. A) BM מתייחס העובר מניפולציה מדיה המועסקים במהלך ויטריפיקציה. העוברים חייבים להיות טעונים בפתרון ויטריפיקציה. ב) המראה המקסקופי של הקש הטעון עם פירוט מוגדל של מיקום העובר. התקן זה של נפח גדול מאפשר לנו להתקשות מספר רב של עוברים, בניגוד התקני נפח מינימלי. יתר על כן, הטיפול במכשיר זה קל יותר לעומת התקנים מינימלי נפח, בעוד התוצאות דומות ארנבים41. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

העברה פולשנית לפרוסקופי של עוברים רעננים או מבתרים את הארנב בקרב חיות המופת הטובות ביותר ללימודי הרבייה. טבלה 1 מראה את התוצאות של ET חדש בשלבים התפתחותיים שונים (איור 4) של עוברים הועברו. שיעור ההישרדות בלידה (אחוז העוברים הנובעים גור) הוכיחה את היעילות של טכניקת הפרוסקופי המתוארת במאמר זה. הערכים הגבוהים יותר הושגו כאשר ה-ET בוצעה עם עוברים בשלב מורולה, או מוקדם או קומפקטי. בהתבסס על תוצאות אלה, ביצעו ניסוי שני כדי להדגים את שיעור ההישרדות לאחר ויטריפיקציה של עוברים אלה. כך, בטבלה 2 אנו מראים את התוצאות שהתקבלו לאחר העברת ארנבת מורופיליות הארנב התאושש באותו זמן, הבחנה בין העוברים שהגיעו לרמה טובה של הדחיסה או לא. שיעור ההישרדות בלידה היה שונה בין שלבי העובר השונים, להיות גבוה יותר בתוך המורפיליות הדחוסה. לכן, העברת העובר לפרוסקופי היא טכניקה אמינה להעברת עוברים חדשים ומהימנים בארנבים

Figure 4
איור 4: עוברי ארנב. A) . ב) שמונה תאים. C) מורולה הקדומה. ד) קומפקטית מורולה. E) בלסטוציסטה. כוכבית מציינת את שני הצדדים. חיצים שחורים מצביעים. על הסונה פללוצידה חיצים לבנים מציינים את מעיל ריריות, אשר בדרך כלל משתנה בין עוברים. ICM: מיסת התא הפנימי. TE: עור. סרגל קנה מידה: 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

שלב התפתחותי1 עוברים נמענים מקום העברה שיעור היריון (%) שיעור השרשה (%) שיעור ההישרדות בלידה (%)
ברור למדי 78 7 תעלת ההטלה 7 (100) 50 (64.0)b 34 (43.6)b
שמונה תאים 81 7 תעלת ההטלה 7 (100) 60 (74.1)b 53 (65.4)מ
מורולה הקדומה 81 7 תעלת ההטלה 7 (100) 80 (98.8)מ 60 (74.1)מ
מורולה קומפקטית 80 7 תעלת ההטלה 7 (100) 80 (100)מ 58 (72.5)מ
בלסטוציסט 80 7 רחם 7 (100) 73 (91.3)מ 38 (47.5)b

. שולחן 1 יעילות של העברת העובר ארנב טרי (in vivo נגזרות) על ידי לפרוסקופיה. 1עוברים שונים התגלו ב 18-20h (ברור), 36-38h (8 תאים), 60-62 h (ראשית morula), 70-72 h (קומפקטי morula) ו 80-82 h (blastocyst) לאחר ההזדווגות. קומפקטי (> 32 תאים) ולא קומפקטי morulae (≈ 32 תאים) ניתן להקים ב 70-72 h, אבל רק מורפיליות קומפקטי הועברו. מיכל השני שיעור ההישרדות בלידה של הנמען בהריון עושה. a, b ערכים עם כתב עילי שונה הם שונים מבחינה סטטיסטית (P < 0.001).

שלב התפתחותי עוברים שהועברו נמענים שיעור היריון (%) שיעור ההישרדות בלידה (%)
לא דחוס 135 10 9 (90) 62 (45.9)b
דחוס 150 10 10 (100.0) 98 (65.3)מ
כולל 285 20 19 (95) 160 (56.1)

. שולחן 2 הכדאיות של חוסר דחיסה לעומת קומפקטי מוראולה. a, ערכי bעם כתב עילי שונה הם שונים מבחינה סטטיסטית (P < 0.001). מיכל בן שיעור ההישרדות בלידה של הנמען בהריון עושה. עוברים התגלו באותו זמן (70-72 h) והיינו מפורסמים לתוך קומפקטי (> 32 תאים) ו מורופיליות לא קומפקטי (≈ 32 תאים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאז המתועד הראשון של מקרה הלידה החיה מעוברים הועברו9, טכניקה זו ומינים הארנב הפכו קריטיים בלימודי הרבייה. חוץ מזה, מחקרי מחקר עובר מעורבים, ייצור, הקפאה, וכו ' דורשים כצעד האחרון הערכה של יכולת העובר ליצור צאצאים בריאים לטווח מלא. לכן, טכניקת העברת העובר היא הכרחית13,28. במהלך השנים, השיטות הכירוגרפיות המועסקים בתחילה כדי להעביר עוברים אל הרחם האימהי הוחלפו בהדרגה על ידי שיטות פולשנית פחות ברוב המכריע של מינים13,14,15, מיכל בן 21 , בן 27 , בן 29 , 30. עם זאת, בארנבים, במהלך בשלבי העובר המוקדמים של התפתחות ובעוברי חוץ-גופית הופכים לבלתי נמנעים כדי להבטיח תוצאה דומה לתנאים טבעיים. בארנבים, מעיל ריריות הפנים הוא גורם מכריע המאפשר השתלת העובר, כפי שהוא מתרחש לאחר שיפוץ של ציפויים עובריים במהלך התרחבות בלסטוציסט בקרנות הרחם. עם זאת, התצהיר של ריריות מעיל מוגבל לתעלת ההטלה במשך 3 ימים לאחר הביוץ, והמנגנונים המולקולריים של התצהיר בחומר מעיל אינם ידועים ברובו31. מסיבות אלה, ידוע כי ב- מבחנהשפותחה blastocysts לא שרדו כאשר הועברו הרחם32,33,34, ועוברים עם מעיל ריריות פגום יש שיעור הישרדות נמוך יותר 35. כמו כן, קבוצות שדיווחו על העברת עובר בעבר בארנבים הביאו לשפל מאוד בחיים שיעור11,26. כאן, אנו מציגים טכניקה מינימלית פולשנית, המותאמת לבסננפלדר ו-Brem18, כדי להעביר עוברים עם שיעורי לידה מוצלחים. על פי התוצאות בטבלה 1, השלב מורולה בעוברי ארנבות היה השלב העובריים הטוב ביותר כדי להשיג שיעור הישרדות גבוה בלידה. הסבר אפשרי אחד הוא רגישות גבוהה יותר למניפולציות של השלבים המוקדמים ביותר. מעניין, שיעור ההצלחה עולה כמו השלב העובריים מתקדם, אולי בשל החשיפה הגדולה יותר של העובר הפרשות האובידיוס לפני ההתאוששות שלה. אבל כאשר עוברים מגיעים לשלב בלסטוציסטה ומconcordant הועברו לרחם, הערכים יורדים באופן דרסטי. לא כולל את מה שנאמר, הסבר אפשרי יכול להיות כי העוברים המועברים לתוך צינור ההטלה יכולים לשחזר את הנזק האפשרי שנוצר בשכבת ריריות במהלך מניפולציה העובר. לכן, בלסטוציסטות המועברות לרחם יהיה משולל מנגנון זה, אשר עלול לפגוע ביכולת ההשתלה שלהם.

הטכניקה מבוצעת באמצעות כלי יציאה יחיד (5 מילימטר האנדוסקופ trocar), עם מניפולציה קלה, קצרה. לכן, the5-mm אנדוסקופ נקז החתך אינו דורש סגירת מעגל. יתרונות הטכניקה לפרוסקופי כוללים כאבים שלאחר הניתוח הצטמצמה, חזרה מהירה יותר לפעילות נורמלית, ופחות סיבוכים לאחר הניתוח. בנוסף, הליכים אנדוסקופיים מאפשרים פחות הידעיות בטן ומאפשרות תגובה חיסונית טובה יותר על ידי המטופל לעומת הניתוח הפתוח21,36,37. צבירת ראיות מהמעבדה שלנו הוכיחה את האפקטיביות של הליך זה ET במודל הארנב. כך, בחמש השנים האחרונות סך של 3,909 עוברים (1,335 העוברים החדשים 2,574 והאחרים) הועברו באמצעות ההליך המתואר בכתב היד הנוכחי. כתוצאה מטכניקה זו, שיעורי הצאצאים של עוברי העברה טריים ומויטריתיים היו 62.9% ו 42.5%, בהתאמה38,39,40,41,42, 43 , 44 , 45 , 46 , 47. מחקרים רבים מבוססים על טכניקה זו: מרקו-חימנס אל. 38 , 39 , 40 , 41, ויסנטה ואח '. 42, ויודס-דה-קסטרו אל. 43, סאז-דה-ג'ואנו ואח ' אל. 44 , 45 , 47, lavara et al. 46.

המלצות מעשיות לביצוע טכניקה זו מתוארות להלן. בניסויים בתרבות העובר, מומלץ גם להשתמש קטטר חדש להעברת העובר במקום האחד המשמש להעברת העוברים בין התקשורת התרבותית והמדיה מניפולציה. זה מונע העברה של שמן מינרלי ומבטיח זרימה אופטימלית. במהלך ET חשוב למזער את הטיפול במערכת הרבייה, כאשר מניפולציה מוגזמת של תעלת ההטלה עלולה לגרום לחוסר הסדר. אם צינור ההטלה הוא מעוות, להעסיק את המזרק אפידורל לנסות למקם אותו נכון, לא את הקטטר, כפי שהוא מכיל את העוברים ומניפולציה מכנית יכול לגרום לאובדן שלהם. , ברגע שקטטר עובר דרך תעלת ההטלה. הוא מחליק בקלות אם לא, הקטטר אולי חרג. ברגע שבתוך תעלת ההטלה, אם המדיה אינה זורמת, הזז את הקטטר מעט ונסה להכניס אותו שוב. אם זה עדיין לא זורם, הקטטר הוא סתום. הסר אותו מצינור ההטלה ושחרר את התוכן לתוך צלחת בינונית נקיה. ואז, לטעון מחדש את העוברים לתוך קטטר אחר ולנסות להכניס אותו שוב לתוך תעלת ההטלה. משלוחים בדרך כלל לוקח מקומות 28-30 ימים לאחר העברת morula.

בנוסף, יש ראיות המציינות כי השלב ההתפתחותי של העובר יכול להיות מתקדם יותר מאשר סביבת הרחם בנקבות pseudopregnant, אך לא ההיפך. במיוחד, עוברים יש את היכולת לחכות לסביבה הרחם חיובית, אבל הסביבה הרחם לא יכול לחכות העוברים בשלב הנכון עבור השרשה10. ביחס לעוברים המושכרים, לאחר אחסון לטווח קצר/ארוך, ניתן לסנכרן את השלב ההתפתחותי של העובר עם סביבת הרחם המתאימה. יתר על כן, אם תורם העובר הוא גם מקבל העובר, את ההשפעות המזיק של ביוץ על רירית המערכת יכול להיות עקף באמצעות הטכניקה ויטריפיקציה והעברת העוברים במחזור הבאים48. בארנבים, עוברים ויטמינים שהועברו לתוך מקבלי המובסים של הנמענים המושרה ל-60-62 h מראש (היום) היא טכניקה יעילה מאוד44,49. בהקשר זה, הוצע כי המעבר ההטלה במהלך 10-12 h יכול להסביר את ההשפעות מועילות בשיקום של הפיזיולוגיה התא והחלפת תאים מתים, וכנראה לתקן את הנזק הנגרם במעיל ריריות במהלך העובר ניפולציה. מלבד זאת, עוברים ויטשנים מציגים עיכוב בפיתוח, מאחר שmetabolically הושעו במהלך האחסון. לכן, העברה של העוברים הקפאה לנמענים אסינכרוניים מאפשר לעובר להפעיל מחדש את פעילותה המטבולית ולכן שלב העובר של הפיתוח מסונכרן עם סביבת הרחם. במקום, אם העוברים הקפאת שמורים מועברים לתוך קולטני סינכרוניים, הצלב בין האם לבין העובר מעכבת את תחילתה של הריון מוצלח. בתוך הארנב, שיעור ההישרדות הגבוה ביותר הושג לאחר העברת באמצעות העברה של הקריופיליות מורולאי49. הנתונים שלנו תואמים את הדו ח הזה, למרות שהבמה morula מציג שיעורי הישרדות שונים בעקבות הקפאה בהתאם למידת הדחיסה שלהם ב 70-72 h (שולחן 2). כאן, מבוקר דחוס הראה שיעורי הישרדות גבוה יותר בלידה לעומת מורופיליות לא דחוס, אשר היה בקונקורדנציה עם דיווחים קודמים מראה כי כל שלב של הפיתוח היה מנגנון משלו ביחס לחדירות של cryoprotectants ו את היקף ההתייבשות במהלך התוספת של הפתרון הקריוגנית50. בבסיס טכניקות אלה, הדגמנו כי שילוב של העברת העובר הויטריפיקציה והפנים הוא אסטרטגיה מוצלחת להקים מחדש את אוכלוסיית הארנבים לאחר 15 שנות אחסון בחנקן נוזלי, ללא השפעה שלילית על לאחר ההפשרה הישרדות הלידה חי51.

יש לקחת בחשבון את הפרטים הבאים כדי לבצע שיטה זו בהצלחה. חשוב לזכור כי הצפיפות הגוברת של המדיומים העוקבים המשמשים לויטריפיקציה (DPBS, פתרון equilibration, פתרון ויטריפיקציה) יכול לגרום להתכווצות העובר עקב התייבשות העובר פרוגרסיבי. עם זאת, מראהו הרגיל הוא התאושש כאשר העובר הוא משוכן עם המדיום. יתר על כן, כאשר העובר מועבר בין התקשורת הצפיפות הגוברת, הוא נוטה לעבור אל פני השטח של התקשורת בשל תנועות צפיפות. כדי למנוע אובדן העובר ולהבטיח את זמן הויטריפיקציה, recommendable לבצע את הויטריפיקציה בטיפות קטנות של אמצעי התקשורת שימנעו את העובר במקומו.

לסיכום, אנו מתארים גם טכניקת ET וגם שיטה ויטריפיקציה העובר המאפשרים מחקרים עתידיים אשר משתמשים בארנבים כמודל. בהתבסס על המרחק הקרוב פילוגנטי בין ארנבים ובני אדם, השימוש במודל זה יכול לספק תוצאות בקלות להעברה לרפואה קלינית אנושית. בנוסף, השיטה שלנו מציעה יתרונות היגיוניים וכלכליים, התואמים לרעיון של 3 ר' לרווחת בעלי חיים (החלפה, הפחתה ועידון), תוך שמירה על המטרה של שיפור הטיפול האנושי בבעלי חיים ניסיוניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי כספים ממשרד הכלכלה והתחרותיות של ספרד (AGL2017-85162-C2-1-R) ו הכלטאת ולנסיה תוכנית מחקר (PrometeoII 2014/036). גרסת טקסט באנגלית שתוקנה על-ידי נ. מאקאן שירות לשפות אנגלית

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 332
Buprenorphine hydrochloride Alvet Escartí 626 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buserelin Acetate Sigma Aldrich B3303
Clorhexidine digluconate soap Alvet Escartí 0265DCCJ500B
Clorhexidine digluconate solution Alvet Escartí 0265DCCA500B
CO2 Air Liquide 99921 CO2 N48.
CO2 Incubator Fisher scientific 15385194
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich W387509
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) Sigma Aldrich D5773 Without calcium chloride.
Electric razor Oster Golden A5 078005-140-002
Endoscope camera Optomic Spain S.A OP-714
Endoscope trocar with silicone leaflet valve Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 30114GK Lightweight trocar model.
Enrofloxacin Alvet Escartí 9993046 To be ordered by a licensed veterinarian.
Epicraneal needle 23G Alvet Escartí 514056353 Smaller needles can be also used.
Epidural catheter Vygon corporate 187.10
Epidural needle Vygon corporate 187.10
Ethylene Glycol Sigma Aldrich 102466-M
Eye ointment Alvet Escartí 5273
Ketamine hydrochloride Alvet Escartí 184 To be ordered by a licensed veterinarian.
Laparoscopy equipment Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 26003 AA Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel.
Light source Optomic Spain S.A Fibrolux 250
Liquid Nitrogen Air Liquide P1505XXX
Mechanical CO2 insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. Endoflator®
Meloxicam Alvet Escartí 9993501 To be ordered by a licensed veterinarian.
Petri dishes, 35-mm Sigma Aldrich CLS430165-500EA
Plastic dressing (Nobecutan) IBOR medica 7140028
Plastic Straw 0.25 mL IMV - technologies 6431
Povidone iodide solution Alvet Escartí 02656DPYS500S
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
Silicone tube for insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 20400040
Stereomicroscope Leica MZ16F There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few.
Sterile Gloves Alvet Escartí 087GL010075
Sterile gown Alvet Escartí 12261501
Sterile mask Alvet Escartí 058B15924B
Straw Plug IMV - technologies 6431
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Syringe, 1-mL Fisher scientific 11750425
Syringe, 5-mL Fisher scientific 11773313
Urinary catheter IMV - technologies 17722
Waterbath RAYPA BAE-4
Xylazine Alvet Escartí 525225 To be ordered by a licensed veterinarian.
Rabbits Universitat Politècnica de València Line A Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (ART). Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8, (4), 388-402 (2017).
  2. Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo vitrification in rabbits: Consequences for progeny growth. Theriogenology. 84, (5), 674-680 (2015).
  3. Sirard, M. A. The influence of in vitro. fertilization and embryo culture on the embryo epigenetic constituents and the possible consequences in the bovine model. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8, (4), 411-417 (2017).
  4. Feuer, S. K., Rinaudo, P. F. Physiological, metabolic and transcriptional postnatal phenotypes of in vitro. fertilization (IVF) in the mouse. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8, (4), 403-410 (2017).
  5. Jiang, Z., et al. Genetic and epigenetic risks of assisted reproduction. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 44, 90-104 (2017).
  6. Fleming, T. P., Velazquez, M. A., Eckert, J. J. Embryos, DOHaD and David Barker. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 6, (5), 377-383 (2015).
  7. Sparks, A. E. Human embryo cryopreservation-methods, timing, and other considerations for optimizing an embryo cryopreservation program. Seminars in Reproductive Medicine. 33, (2), 128-144 (2015).
  8. Swain, J. E. Optimal human embryo culture. Seminars in Reproductive Medicine. 33, (2), 103-117 (2015).
  9. Heape, W. Preliminary note on the transplantation and growth of mammalian ova within a uterine foster-mother. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 48, 457-459 (1890).
  10. Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal embryo transfer and vasectomy in the mouse model. Journal of Visualized Experiments. (84), e51214 (2014).
  11. Kidder, J. D., Roberts, P. J., Simkin, M. E., Foote, R. H., Richmond, M. E. Nonsurgical collection and nonsurgical transfer of preimplantation embryos in the domestic rabbit (Oryctolagus cuniculus) and domestic ferret (Mustela putorius furo). Journal of Reproduction and Fertility. 116, (2), 235-242 (1999).
  12. Tıras, B., Cenksoy, P. O. Practice of embryo transfer: recommendations during and after. Seminars in Reproductive Medicine. 32, (4), 291-296 (2014).
  13. Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53, (3), 228-231 (2014).
  14. Moreno-Moya, J. M., et al. Complete method to obtain, culture, and transfer mouse blastocysts nonsurgically to study implantation and development. Fertility and Sterility. 101, (3), e13 (2014).
  15. Hasler, J. F. Forty years of embryo transfer in cattle: a review focusing on the journal Theriogenology, the growth of the industry in North America, and personal reminisces. Theriogenology. 81, (1), 152-169 (2014).
  16. Bauer, C. The baboon (Papio sp.) as a model for female reproduction studies. Contraception. 92, (2), 120-123 (2015).
  17. Martinez, E. A., et al. Nonsurgical deep uterine transfer of vitrified, in vivo-derived, porcine embryos is as effective as the default surgical approach. Science Reports. 5, 10587 (2015).
  18. Besenfelder, U., Brem, G. Laparoscopic embryo transfer in rabbits. Journal of Reproduction and Fertility. 99, 53-56 (1993).
  19. Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47, (5), 1051-1060 (1997).
  20. Besenfelder, U., Havlicek, V., Kuzmany, A., Brem, G. Endoscopic approaches to manage in vitro and in vivo embryo development: use of the bovine oviduct. Theriogenology. 73, (6), 768-776 (2010).
  21. Fonseca, J. F., et al. Nonsurgical embryo recovery and transfer in sheep and goats. Theriogenology. 86, (1), 144-151 (2016).
  22. Denker, H. W. Structural dynamics and function of early embryonic coats. Cells Tissues Organs. 166, 180-207 (2000).
  23. Marco-Jiménez, F., López-Bejar, M. Detection of glycosylated proteins in rabbit oviductal isthmus and uterine endometrium during early embryo development. Reproduction in Domestic Animals. 48, (6), 967-973 (2013).
  24. Ménézo, Y. J., Hérubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reproductive BioMedicine Online. 4, (2), 170-175 (2002).
  25. Fischer, B., Chavatte-Palmer, P., Viebahn, C., Navarrete Santos, A., Duranthon, V. Rabbit as a reproductive model for human health. Reproduction. 144, (1), 1-10 (2012).
  26. Besenfelder, U., Strouhal, C., Brem, G. A method for endoscopic embryo collection and transfer in the rabbit. Zentralbl Veterinarmed A. 45, (9), 577-579 (1998).
  27. Daniel, N., Renard, J. P. Embryo transfer in rabbits. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (1), (2010).
  28. Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters rabbit foetal placenta at transcriptomic and proteomic level. Reproduction. 147, (6), 789-801 (2014).
  29. Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. Biotechniques. 47, (5), 919-924 (2009).
  30. Duan, X., Li, Y., Di, K., Huang, Y., Li, X. A nonsurgical embryo transfer technique in mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 32, (4), 440-446 (2016).
  31. Denker, H. W., Gerdes, H. J. The dynamic structure of rabbit blastocyst coverings. I. Transformation during regular preimplantation development. Anatomy and Embryology. 157, 15-34 (1979).
  32. Seidel, G. E., Bowen, R. A., Kane, M. T. In vitro fertilization, culture and transfer of rabbit ova. Fertility and Sterility. 27, 861-870 (1976).
  33. Binkerd, P. E., Anderson, G. B. Transfer of cultured rabbit embryos. Gamete Research. 2, 65-73 (1979).
  34. Murakami, H., Imai, H. Successful implantation of in vitro cultured rabbit embryos after uterine transfer: a role for mucin. Molecular Reproduction and Development. 43, 167-170 (1996).
  35. Techakumphu, M., Wintenberger-Torrèsa, S., Sevelleca, C., Ménézo, Y. Survival of rabbit embryos after culture or culture/freezing. Animal Reproduction Science. 13, (3), 221-228 (1987).
  36. Gitzelmann, C. A., et al. Cell-mediated immune response is better preserved by laparoscopy than laparotomy. Surgery. 127, (1), 65-71 (2000).
  37. Huang, S. G., Li, Y. P., Zhang, Q., Redmond, H. P., Wang, J. H., Wang, J. Laparotomy and laparoscopy diversely affect macrophage-associated antimicrobial activity in a murine model. BMC Immunology. 14, 27 (2013).
  38. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Almela-Miralles, V., Vicente, J. S. Development of Cheaper Embryo Vitrification Device Using the Minimum Volume Method. Public Library of Science One. 11, (2), e0148661 (2016).
  39. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Generation of live offspring from vitrified embryos with synthetic polymers supercool X-1000 and Supercool Z-1000. CryoLetters. 35, 286-292 (2014).
  40. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Use of cyclodextrins to increase cytoplasmic cholesterol in rabbit embryos and their impact on live KITs derived from vitrified embryos. Cryoletters. 35, 320-326 (2014).
  41. Marco-Jiménez, F., Lavara, R., Jiménez-Trigos, E., Vicente, J. S. In vivo development of vitrified rabbit embryos: Effects of vitrification device, recipient genotype, and asynchrony. Theriogenology. 79, (7), 1124-1129 (2013).
  42. Vicente, J. S., et al. Rabbit morula vitrification reduces early foetal growth and increases losses throughout gestation. Cryobiology. 67, 321-326 (2013).
  43. Viudes-de-Castro, M. P., Marco-Jiménez, F., Cedano-Castro, J. I., Vicente, J. S. Effect of corifollitropin alfa supplemented with or without Lh on ovarian stimulation and embryo viability in rabbit. Theriogenology. 98, 68-74 (2017).
  44. Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters at transcriptomic and proteomic level rabbit foetal placenta. Reproduction. 147, 789-801 (2014).
  45. Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Lavara, R., Vicente, J. S. Direct comparison of the effects of slow freezing and vitrification on late blastocyst gene expression, development, implantation and offspring of rabbit morulae. Reproduction in Domestic Animals. 49, 505-511 (2014).
  46. Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Long-term and transgenerational effects of cryopreservation on rabbit embryos. Theriogenology. 81, 988-992 (2014).
  47. Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo transfer manipulation cause gene expression variation in blastocysts that disrupt implantation and offspring rates at birth in rabbit. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 207, 50-55 (2016).
  48. Roque, M., Valle, M., Kostolias, A., Sampaio, M., Geber, S. Freeze-all cycle in reproductive medicine: current perspectives. JBRA Assisted Reproduction. 21, (1), 49-53 (2017).
  49. Tsunoda, Y., Soma, T., Sugie, T. Effect of post-ovulatory age of recipient on survival of frozen-thawed rabbit morulae. Journal of Reproduction and Fertility. 65, (2), 483-487 (1982).
  50. Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17, (3), 744-751 (2002).
  51. Lavara, R., Baselga, M., Vicente, J. S. Does storage time in LN2 influence survival and pregnancy outcome of vitrified rabbit embryos? Theriogenology. 76, (4), 652-657 (2011).
העברת העובר פולשני המינימלי העובר ויטריפיקציה בשלב העובר אופטימלית במודל ארנב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).More

Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter