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Developmental Biology

Trasferimento embrionale minimamente invasivo e vetrificazione embrionale nella fase embrionale ottimale nel modello Rabbit

doi: 10.3791/58055 Published: May 16, 2019

Summary

Le tecniche di riproduzione assistita (ARTs) sono in continua valutazione per migliorare i risultati e ridurre i rischi associati. Questo manoscritto descrive una procedura di trasferimento dell'embrione minimamente invasiva con un efficiente protocollo di crioconservazione che consente l'uso di conigli come modello animale ideale di riproduzione umana.

Abstract

Le tecniche di riproduzione assistita (ARTs), come la coltura embrionale in vitro o la crioconservazione degli embrioni, influenzano i modelli di sviluppo naturale con conseguenze perinatale e postnatale. Per garantire l'innocuità delle applicazioni ART, sono necessari studi su modelli animali. Inoltre, come ultimo passo, gli studi sullo sviluppo degli embrioni richiedono una valutazione della loro capacità di sviluppare una progenie sana a lungo termine. Qui, il trasferimento dell'embrione nell'utero è indispensabile per eseguire qualsiasi esperimento correlato alle arti.

Il coniglio è stato usato come organismo modello per studiare la riproduzione dei mammiferi per oltre un secolo. Oltre alla sua vicinanza filogenetica alla specie umana e alle sue piccole dimensioni e ai bassi costi di manutenzione, ha importanti caratteristiche riproduttive come l'ovulazione indotta, una cronologia dello sviluppo embrionale precoce simile all'uomo e una breve gestazione che ci permettono di studiare facilmente le conseguenze dell'applicazione ART. Inoltre, le arti (come l'iniezione intracitoplasmatica dello sperma, la coltura embrionale o la crioconservazione) vengono applicate con un'adeguata efficienza in questa specie.

Utilizzando la tecnica di trasferimento dell'embrione laparoscopica e il protocollo di crioconservazione presentato in questo articolo, descriviamo 1) come trasferire gli embrioni attraverso una tecnica facile, minimamente invasiva e 2) un protocollo efficace per lo stoccaggio a lungo termine di coniglio per fornire capacità logistiche flessibili nel tempo e la capacità di trasportare il campione. I risultati ottenuti dopo il trasferimento di embrioni di coniglio in diverse fasi evolutive indicano che la morula è la fase ideale per il recupero e il trasferimento degli embrioni di coniglio. Pertanto, è necessario un trasferimento di embrioni oviductal, giustificando la procedura chirurgica. Inoltre, le morule di coniglio sono con successo vetrificata e laparoscopicamente trasferite, dimostrando l'efficacia delle tecniche descritte.

Introduction

Con l'obiettivo di bypassare l'infertilità umana o migliorare la diffusione del bestiame di alto valore genetico e preservare le risorse genetiche animali, una serie di tecniche denominate collettivamente tecnologie di riproduzione assistita, come la superovulazione, in fecondazione in vitro, coltura embrionale, o crioconservazione, sono stati sviluppati1,2. Attualmente, vengono somministrati trattamenti ormonali per stimolare le ovaie e produrre un gran numero di follicoli ovarici antrici1. Gli ovociti raccolti da questi follicoli possono essere maturati, fertilizzati e sviluppati in vitro fino a quando non sono criopriservati o trasferiti alle madri surrogato3. Tuttavia, durante questi trattamenti, gameti e zigoti sono esposti a una serie di processi non fisiologici che potrebbero richiedere l'adattamento dell'embrione per sopravvivere in queste condizioni4,5. Questo adattamento è possibile a causa della plasticità embrionale precoce, che consente cambiamenti embrionali nell'espressione genica e nella programmazione dello sviluppo6. Tuttavia, queste modifiche possono influenzare le fasi successive dello sviluppo embrionale fino all'età adulta, ed è ora ampiamente accettata che metodi, tempi, procedure di crioconservazione o condizioni di coltura mostrano risultati diversi sul destino dell'embrione7 , 8. Pertanto, per chiarire gli effetti specifici indotti delle arti, l'uso di modelli animali ben caratterizzati è inevitabile.

La prima nascita documentata dal vivo risultante dal trasferimento di embrioni di mammiferi ha avuto luogo nel 18909. Oggi, il trasferimento di embrioni (ET) a una femmina surrogata è un passo cruciale nello studio degli effetti indotti dall'arte durante il preimpianto nelle successive fasi di sviluppo dell'embrione10. Le tecniche ET dipendono dalle dimensioni e dalla struttura anatomica di ogni animale. Nel caso di modelli animali di grandi dimensioni, è stato possibile eseguire ET con tecniche di ET non chirurgiche transcervicali, ma in specie di dimensioni più ridotte la cateterizzazione della cervice è più complessa e le tecniche chirurgiche sono frequentemente utilizzate11. Tuttavia, l'ET chirurgico può causare emorragie che potrebbero compromettere lo sviluppo dell'impianto e dell'embrione, poiché il sangue può invadere il lume uterino, causando la morte embrionale10. Le tecniche di et non chirurgiche transcervicali sono ancora applicate in esseri umani, babooni, bovini, suini e topi12,13,14,15,16,17, ma chirurgico Gli ETS sono ancora utilizzati in specie come capre, ovini o altri animali che presentano ulteriori difficoltà10,18,19,20,21, come i conigli (due indipendenti) o topi (di piccole dimensioni). Tuttavia, i metodi di trasferimento chirurgico tendono ad essere gradualmente sostituiti da metodi meno invasivi. L'endoscopia è stata utilizzata per trasferire embrioni, ad esempio, in conigli, suini e piccoli ruminanti18,19,20. Questi metodi endoscopici minimamente invasivi possono essere utilizzati per trasferire embrioni nell'Anulla attraverso l'infundibulum, che è essenziale nei conigli e ha dimostrato effetti benefici in alcune specie20. Ciò si basa sull'importanza del corretto dialogo tra embrione e madre durante i primi stadi embrionali nell'ovidotto. Come accennato in precedenza, il rimodellamento embrionale che si svolge nei conigli durante la migrazione embrionale attraverso l'ovidotto è essenziale per ottenere embrioni in grado di impiantare22,23.

Modelli animali di dimensioni maggiori, come i bovini, sono interessanti perché le caratteristiche biochimiche e preimpiantanti sono simili a quelle della specie umana24. Tuttavia, gli animali di grandi dimensioni sono troppo costosi da usare nelle prove preliminari, e i roditori sono considerati un modello ideale (76 gli organismi modello% sono roditori) per la ricerca di laboratorio25. Tuttavia, il modello di coniglio fornisce alcuni vantaggi rispetto ai roditori negli studi sulla riproduzione, poiché alcuni processi biologici riproduttivi esposti dagli esseri umani sono più simili nei conigli rispetto a quelli nei topi. L'uomo e i conigli presentano un'attivazione del genoma embrionale cronologico simile, la gastrulazione e la struttura della placenta hemochorial. Inoltre, utilizzando conigli è possibile conoscere l'esatta tempistica di fecondazione e fasi di gravidanza a causa della loro ovulazione indotta25. I cicli di vita dei conigli sono brevi, completando la gestazione in 31 giorni e raggiungendo la pubertà a circa 4-5 mesi; l'animale è facile da maneggiare grazie al suo comportamento docile e non aggressivo, e il suo mantenimento è molto economico rispetto alle spese degli animali più grandi. Inoltre, è fondamentale ricordare che i conigli hanno un utero duplex con due cervidi indipendenti11,25. Questo colloca il coniglio in una posizione preferenziale, poiché gli embrioni provenienti dai diversi gruppi sperimentali possono essere trasferiti nello stesso animale, ma in un altro corno uterino. Questo ci permette di confrontare entrambi gli effetti sperimentali, riducendo il fattore materno dai risultati.

Oggi, i metodi ET non chirurgici non sono in uso nel coniglio. Alcuni studi condotti alla fine degli anni '90 utilizzando una tecnica transcervicale hanno portato a bassi tassi di consegna che vanno da 5,5% a 20,0%11,26 contro 50-65% con metodi chirurgici, tra cui la procedura di laparoscopia descritta da Besenfelder e Brem18. I bassi tassi di successo di questi metodi ET non chirurgici nei conigli coincidono con la mancanza del necessario rimodellamento dell'embrione nell'ovidotto, che viene evitato nell'ET transcervicale. Qui, descriviamo un'efficace procedura laparoscopica ET minimamente invasiva utilizzando conigli come organismo modello. Questa tecnica fornisce un modello per ulteriori ricerche sulla riproduzione in animali di grandi dimensioni e umani.

Poiché i conigli hanno una finestra temporale particolarmente ristretta per l'impianto embrionale, l'ET in questa specie richiede un alto grado di sincronia tra la fase evolutiva dell'embrione all'ET e lo stato fisiologico del ricevente27. In alcuni casi, dopo un trattamento riproduttivo che rallenta lo sviluppo dell'embrione (come la coltura in vitro ) o altera la ricettività endometriale (come i trattamenti di superovulazione), non vi è alcuna sincronia tra l'embrione e l'utero materno. Queste situazioni possono influire negativamente sui risultati. Per rispondere in questi contesti, descriviamo un efficace protocollo di vitrificazione del coniglio morula che ci permette di mettere in pausa, organizzare e riprendere gli esperimenti. Questo processo è logisticamente auspicabile per gli studi sulla riproduzione e ci dà la capacità di stoccaggio a lungo termine di embrioni, permettendo il loro trasporto. La procedura laparoscopica e le strategie di criopriservazione consentono una migliore pianificazione degli studi con meno animali. Così, la nostra metodologia offre vantaggi igienici ed economici ed è conforme al concetto di 3Rs (sostituzione, riduzione e perfezionamento) della ricerca animale con l'obiettivo dichiarato di migliorare il trattamento umano degli animali da esperimento. Così, con questi metodi, i conigli costituiscono un organismo modello ideale per saggi riproduttivi in vivo .

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Protocol

Tutte le procedure sperimentali utilizzate in questo studio sono state eseguite in conformità alla direttiva 2010/63/UE CEE per gli esperimenti sugli animali e riviste e approvate dal comitato etico per la sperimentazione con gli animali dell'Universitat Politècnica de València, Spagna (codice di ricerca: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC e JSV detiene un certificato di autorizzazione emesso dall'amministrazione governativa Valenciana per sperimentare sugli animali. XGD è autorizzata a sorvegliare in situ il benessere e la cura degli animali durante l'esperimento.

1. trasferimento degli embrioni

  1. Preparazione delle femmine riceventi
    1. Utilizzare solo femmine sessualmente mature (> 4,5 mesi di età).
    2. Una settimana prima di ET, adattare le femmine a un regime di 16 ore di luce/8 h scuro per avviare la crescita follicolare e una maggiore ricettività femminile.
    3. Selezionare le femmine destinatarie, osservando la turgidità e il colore della vulva. Se la vulva è turgida e rossastra, la femmina è ricettiva.
    4. Indurre pseudogravidanza (ovulazione) da una singola iniezione intramuscolare di 1 μg di buserelin acetato (analogo sintetico dell'ormone di rilascio di gonadotropina) indipendentemente dal peso corporeo.
      Nota: normalmente, 0,8 μg è una dose adatta per l'induzione dell'ovulazione in conigli di medie dimensioni (4-5 kg), quindi 1 μg generalmente garantisce l'ovulazione.
    5. Indurre l'ovulazione come molti giorni prima dell'età degli embrioni da trasferire (ad esempio, 70-72 h dopo la morula fresca ET).
  2. Anestesia e analgesia
    1. Pesare il coniglio e caricare i seguenti anestetici e analgesici.
      1. In una siringa da 1 ml con un ago 30g: carico xilazina (5mg/kg) e buprenorfina cloridrato (0,03 mg/kg). In un'altra siringa da 1 mL con un ago pericranico 23G, il carico di chetamina cloridrato (35 mg/kg).
    2. Tenga il coniglio e inietti la miscela di Xylazine-buprenorfina per via intramuscolare.
    3. Inserire l'ago pericranico con ketamina nella vena marginale dell'orecchio, introducendo lentamente tutti i contenuti della siringa per via endovenosa.
    4. Fissare l'ago e lasciarlo inserito in tutti i passaggi rimanenti per somministrare più anestesia, se necessario.
    5. Lasciare il coniglio nella gabbia (pulito e senza altri animali) su un palco caldo.
    6. Una volta incosciente, applicare l'unguento oculare per evitare la secchezza dell'occhio e controllare l'assenza del freflex palpebrale.
      Nota: questo protocollo fornisce un piano di anestesia chirurgico per un minimo di 30 min. Se è necessario un tempo più lungo, iniettare ulteriori dosaggi con la metà della quantità di chetamina cloridrato descritta in 1.2.1 dopo 30 min.
    7. Monitorare la profondità dell'anestesia controllando il riflesso del pedale e il movimento respiratorio. Cambiamenti nel modello di respirazione ad un tasso irregolare e più veloce indicano la perdita del piano corretto di anestesia.
    8. Monitorare il colore delle membrane mucose (occhi, labbra, ecc.), la frequenza respiratoria (30-60 respiratori al minuto), la frequenza cardiaca (120-325 battute al minuto) e la temperatura rettale (38-39,6 ° c).
    9. Otto ore prima del trasferimento, trattenere il cibo dagli animali per evitare la maggiore dimensione dell'intestino e l'attività fino a quando il processo ET è finito. Lasciare libero l'accesso all'acqua.
  3. Preparazione embrionale
    1. Riscaldare il supporto di manipolazione dell'embrione a 25 ° c: base medium (BM), costituito da soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) integrata con 0,2% (p/v) di albumina sierica bovina.
    2. Lavorando sotto uno stereomicroscopio, risciacquare gli embrioni freschi o scongelati (fase 2) con BM.
    3. Utilizzando guanti sterili, collegare un catetere epidurale 17G opportunamente configurato a una siringa da 1 mL.
    4. Aspirate 1 cm di BM nel catetere, seguita da una piccola bolla d'aria.
    5. Aspirare 5-7embrioni in un volume di 10 μL di BM, seguita da un'altra piccola bolla d'aria.
    6. Terminare il caricamento del catetere aspirando 1 cm di BM.
  4. Trasferimento embrionale
    1. Si consideri l'uso di guanti sterili, abito e maschera per garantire un ambiente asettico.
    2. Sterilizzare gli strumenti chirurgici, pulire le superfici in cui verrà eseguita la chirurgia, e pulirli con 70% etanolo.
    3. Eseguire l'anestesia come precedentemente dettagliato (passo 1,2), controllando la perdita di riflessi.
    4. Radersi la pelliccia dall'addome ventrale con un rasoio elettrico.
    5. Preparare l'addome ventrale in modo asettico.
      1. Pulire l'area chirurgica e rimuovere i peli residui. Lavare l'area chirurgica con un sapone gluconato di clorexidina. Disinfettare l'area con la soluzione di clorexidina ed etanolo 96 º (3 volte).
    6. Posizionare l'animale su un tavolo chirurgico caldo, nella posizione di Trendelenburg (testa in giù a 45 °) per garantire che lo stomaco e l'intestino si trovano cranialmente. Considerare l'evacuazione della vescica se è turgida. Se qualche visceri sono danneggiati nel processo, l'animale può morire. È quindi importante averli posizionati correttamente (Figura 1).
    7. Coprire l'area utilizzando un asciugamano sterile, con un foro (Fenestration) esponendo la zona rasata, per separare il sito chirurgico da eventuali aree contaminanti potenziali.
    8. Inserire un trocar endoscopico di 5 cm nella cavità addominale, 2 cm di caudale al processo xifoideo, e Insuflaggio attraverso di essa la cavità peritoneale con un insufflatore meccanico di regolazione della pressione.
      Nota: la pressione intra-addominale deve essere 8-12 mmHg con CO2 (Figura 1a).
    9. Inserire la fotocamera dell'endoscopio attraverso il trocar endoscopico (Figura 1B).
      Nota: identificare il tratto riproduttivo, determinando lo stato e la posizione dell'infundibulum e dell'ampolla prima di et per facilitare i passi successivi.
    10. Inserire l'ago epidurale da 17 G nella regione inguinali tra 2-3 cm di profondità (Figura 1B).
    11. Identificare l'ingresso dell'infundibulum (Figura 2a, 2B).
    12. Inserire il catetere caricato (passo 1,3) attraverso l'ago epidurale nell'addome (Figura 1C).
    13. Individuare l'ovidotto e inserire 1-2 cm di catetere epidurale attraverso l'infundibulum nell'ampolla (Figura 2a-2C). Non progredire molto lontano nell'ovidotto per prevenire danni ed emorragie.
    14. Rilasciare gli embrioni nell'ovidotto premendo delicatamente lo stantuffo della siringa accoppiato al catetere (Figura 2D-2F). Entrambe le bolle d'aria devono uscire dal catetere.
    15. Rimuovere il catetere subito dopo che gli embrioni sono stati rilasciati.
    16. Sciacquare il catetere, aspirando e rilasciando il mezzo di manipolazione per verificare l'assenza degli embrioni e confermare il trasferimento di successo.
    17. Ripetere i passaggi 1.4.11 a 1.4.16 nell'altro lato dell'utero, se lo si desidera.
    18. Rimuovere l'ago epidurale e la fotocamera endoscopio.
    19. Rilasciare CO2 attraverso il trocar endoscopico. Se il gas in eccesso rimane nell'addome dell'animale, avrà dolore e disagio.
    20. Rimuovere il trocar endoscopico dalla cavità addominale. Rimuovere l'asciugamano chirurgico.
    21. Interrompere l'anestesia.
    22. Pulire l'incisione fatta dal trocar con la soluzione di clorexidina. Chiudere l'incisione fatta dal trocar con un alluminio micronizzato e una medicazione in plastica.
  5. Assistenza postoperatoria
    1. Trattare gli animali con antibiotici: 10 mg/kg di enrofloxacina, per via sottocutanea, ogni 24 ore per 5 giorni.
    2. Somministrare analgesici: buprenorfina cloridrato (0,03 mg/kg), intramuscolarmente, ogni 12 ore per 3 giorni; Meloxicam (0,2 mg/kg), per via sottocutanea, ogni 24 ore per 3 giorni.
    3. Monitorare gli animali per almeno 30 minuti dopo l'intervento chirurgico (a seconda dell'animale e la dose di anestesia utilizzata) assicurandosi che recuperano le loro condizioni fisiologiche.
    4. Identificare il destinatario (ad esempio, il tatuaggio dell'orecchio) e gli animali domestici singolarmente in una gabbia pulita con le condizioni ambientali appropriate.

Figure 1
Figura 1: trasferimento di embrioni laparoscopici assistito da laparoscopia (Vista esterna). A) inserimento del trocar endoscopico (una porta). B) inserimento della telecamera endoscopica e dell'ago epidurale (freccia nera). C) inserimento del catetere di trasferimento embrionale (freccia bianca) attraverso l'ago epidurale. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figure 2
Figura 2: trasferimento di embrioni laparoscopici assistito da laparoscopia (vista interna). A: Inserimento del catetere attraverso l'ago epidurale nella zona addominale. Asterisco indica l'infundibulum. B, C, D: Il catetere caricato con gli embrioni viene inserito nella regione dell'Anulla attraverso l'infundibulum. e, F: Rilascio degli embrioni, confermata dalla visualizzazione di un ovidotto gonfio. Questa cifra è stata adattata da Marco-Jiménez et al. 38. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

2. vetrificazione e riscaldamento dell'embrione

  1. Eseguire tutte le manipolazioni a temperatura ambiente (circa 22 ° c) per ridurre la tossicità della soluzione di vetrificazione a temperature più calde.
    Nota: gli embrioni possono essere spostati utilizzando la pipetta automatica 0.1-2 μL in questo protocollo, ma altri dispositivi simili per muovere gli embrioni trascinando il volume minimo possono essere adatti.
  2. Vitrify gli embrioni in una procedura di addizione in due fasi:
    1. Collocare gli embrioni per 2 minuti in una soluzione equilibrando costituita da glicole etilenico al 10% (v/v) e 10% (v/v) dimetilsolfossido disciolto in BM.
    2. Spostare gli embrioni (dal punto 2.2.1) per 1 minuto in soluzione di vetrificazione costituita da glicole etilenico al 20% (v/v) e 20% (v/v) dimetilsolfossido disciolto in BM.
  3. Caricare gli embrioni in un 125 μL di plastica ministraw (che contiene un terminale chiuso con un tappo di cotone e uno aperto estremo). Il processo viene schematizzato in Figura 3.
    1. Accoppiare l'estremità chiusa di 0,125 μL con il microdispenser appropriato (ad esempio Captroll III®).
    2. Aspirate BM fino a 1/3 della lunghezza della paglia, seguendo una piccola bolla d'aria.
    3. Aspirare gli embrioni in un volume di 40 μL di soluzione di vetrificazione, seguita da un'altra piccola bolla d'aria.
    4. Aspirate BM fino a quando la prima frazione liquida (Step 2.3.2) raggiunge il cotone.
    5. Chiudere l'estremità aperta con una spina di paglia.
  4. Eseguire il passaggio 2.2.2 mentre si sta facendo il passo 2,3 per garantire che non siano trascorsi più di un minuto, il che sarebbe tossico per gli embrioni.
  5. Immergere il ministraw direttamente in azoto liquido per ottenere la vetrificazione.
  6. Conservare il ministero in un Dewar per l'azoto per il tempo desiderato.
  7. Scongelare gli embrioni in un unico passaggio.
    1. Posizionare il ministraw orizzontalmente di 10 cm dal vapore di azoto liquido per 20-30 s.
    2. Quando il processo di cristallizzazione inizia all'interno del ministraw, immergere il ministero in un bagno d'acqua a 25 ° c per 10-15 s.
    3. Togliere la spina del ministero e tagliare il tappo di cotone.
    4. Con un microdispenser accoppiato, espellere tutto il contenuto di ministrazione in una piastra contenente 0,33 M di saccarosio in soluzione a 25 ° c in BM per 5 minuti.
      Nota: questo passaggio deve essere fatto rapidamente per ridurre l'esposizione embrionale alla soluzione di vetrificazione.
    5. Spostare gli embrioni in una nuova lastra contenente la soluzione BM per altri 5 min.
    6. Si consideri solo embrioni non danneggiati (con pelo di mucina intatto e zona pellucida) per continuare con l'ET.
      Nota: prendere in considerazione che negli embrioni scongelati, i trasferimenti asincroni (ad esempio, 60-62 h nei trasferimenti di morula) possono migliorare i risultati consentendo una risincronizzazione tra l'embrione e l'endometrio materno.

Figure 3
Figura 3: schematizzazione della paglia caricata correttamente. A) BM si riferisce al mezzo di manipolazione dell'embrione impiegato durante la vetrificazione. Gli embrioni devono essere caricati in soluzione di vetrificazione. B) aspetto macroscopico della paglia caricata con un dettaglio ingrandito della posizione embrionale. Questo dispositivo di grande volume ci permette di vitrifichiamo grande numero di embrioni, a differenza dei dispositivi di volume minimo. Inoltre, la manipolazione di questo dispositivo è più facile rispetto ai dispositivi di volume minimo, mentre i risultati sono simili nei conigli41. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

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Representative Results

Il trasferimento laparoscopico minimamente invasivo di embrioni freschi o vetrificati pone il coniglio tra i migliori modelli di animali per gli studi riproduttivi. La tabella 1 Mostra i risultati dell'et fresco in diverse fasi evolutive (Figura 4) degli embrioni trasferiti. Il tasso di sopravvivenza alla nascita (percentuale di embrioni risultanti in un cucciolo) ha dimostrato l'efficacia della tecnica laparoscopica descritta in questo documento. I valori più alti sono stati raggiunti quando l'ET è stato eseguito con embrioni nello stadio della morula, o morulae precoce o compatta. Sulla base di questi risultati, abbiamo eseguito un secondo esperimento per dimostrare il tasso di sopravvivenza dopo la vetrificazione di questi embrioni. Così, nella tabella 2 , mostriamo i risultati ottenuti dopo il trasferimento di morulae di coniglio vetrificato recuperate allo stesso tempo, differenziando tra quegli embrioni che avevano raggiunto un buon grado di compattazione o meno. Il tasso di sopravvivenza alla nascita era differente tra le diverse fasi embrionali, essendo più alto nelle morule compattate. Pertanto, il trasferimento di embrioni laparoscopici è una tecnica affidabile per trasferire embrioni freschi e vetrificati nei conigli

Figure 4
Figura 4: embrioni di coniglio. A) pronuclear. B) otto celle. C) morula precoce. D) Morula compatta. E) blastocisti. Asterisco indica i due pronuclei. Le frecce nere indicano la zona pellucida. Frecce bianche indicano il cappotto di mucina, che normalmente varia tra gli embrioni. ICM: massa cellulare interna. TE: Trophectoderm. Barra di scala: 50 μm. fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Fase evolutiva1 Embrioni Destinatari Luogo del trasferimento Tasso di gravidanza (%) Tasso di impianto (%) Tasso di sopravvivenza alla nascita (%)2
Sopravvivenza 78 a 7 Ovidotto 7 (100) 50 (64,0)b 34 (43,6)b
8 cellule 81 a 7 Ovidotto 7 (100) 60 (74,1)b 53 (65,4)a
Morula precoce 81 a 7 Ovidotto 7 (100) 80 (98,8)a 60 (74,1)a
Morula compatta 80 a 7 Ovidotto 7 (100) 80 (100)a 58 (72,5)a
Blastocisti 80 a 7 utero 7 (100) 73 (91,3)a 38 (47,5)b

Tabella 1. Efficienza del trasferimento di embrioni di coniglio fresco (in vivo derivato) da laparoscopia. 1embrioni diversi sono stati recuperati a 18-20h (pronuclear), 36-38H (8 cellule), 60-62 h (precoce morula), 70-72 h (Morula compatta) e 80-82 h (blastocisti) dopo l'accoppiamento. Le cellule compatte (> 32) e le morule non compatte (≈ 32) possono essere fondate a 70-72 h, ma solo le morule compatte sono state trasferite. 2 il Tasso di sopravvivenza alla nascita da ricevente incinta fa. a, b I valori con diversi superscript sono statisticamente diversi (P < 0,001).

Fase evolutiva Embrioni trasferiti Destinatari Tasso di gravidanza (%) Tasso di sopravvivenza alla nascita (%)1
Non compattato 135 a 10 9 (90) 62 (45,9)b
Compattato 150 a 10 10 (100,0) 98 (65,3)a
totale 285 a 20 19 (95) 160 (56,1)

Tabella 2. Vitalità di morula vetrificata non compattata vs compatta. i valori a, bcon diversi superscript sono statisticamente diversi (P < 0,001). 1 il Tasso di sopravvivenza alla nascita da ricevente incinta fa. Gli embrioni sono stati recuperati contemporaneamente (70-72 h) e sono stati distinti in cellule compatte (> 32) e morulae non compatte (≈ 32 celle).

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Discussion

Dal primo caso documentato di nascita dal vivo degli embrioni trasferiti9, questa tecnica e le specie di coniglio sono diventate cruciali negli studi sulla riproduzione. Inoltre, gli studi di ricerca sull'embrione che coinvolgono manipolazione, produzione, crioconservazione, ecc. richiedono come ultimo passo la valutazione della capacità embrionale per generare una progenie sana a pieno termine. Pertanto, la tecnica di trasferimento degli embrioni è indispensabile13,28. Nel corso degli anni, i metodi chirurgici inizialmente impiegati per trasferire gli embrioni nell'utero materno sono stati gradualmente sostituiti da metodi meno invasivi nella stragrande maggioranza delle specie13,14,15, 21 anni di , 27 il , 29 il , 30. Tuttavia, nei conigli, l'et intraoviductal nei primi stadi embrionali di sviluppo e gli embrioni prodotti in vitro diventa inevitabile per garantire un risultato simile alle condizioni naturali. Nei conigli, il cappotto di mucina intraoviductal è un fattore cruciale che consente l'impianto embrionale, come avviene dopo il rimodellamento dei rivestimenti embrionali durante l'espansione di blastocisti nelle corna uterina. Tuttavia, la deposizione della mucina è limitata all'ovidotto per 3 giorni dopo l'ovulazione, e i meccanismi molecolari di deposizione del materiale del cappotto sono in gran parte sconosciuti31. Per questi motivi, è noto che i blastocisti sviluppati in vitronon sopravvivono quando trasferiti all'utero32,33,34ed embrioni con un pelo di mucina danneggiato hanno un tasso di sopravvivenza inferiore 35. Analogamente, i gruppi che hanno riferito un trasferimento di embrioni transcervicali nei conigli hanno provocato tassi di origine vivi molto bassi11,26. Qui, vi presentiamo una tecnica minimamente invasiva, adattata da Besenfelder e Brem18, per trasferire gli embrioni con successo tassi di natalità. Secondo i risultati della tabella 1, la fase morula negli embrioni di coniglio è stata la migliore fase embrionale per raggiungere un alto tasso di sopravvivenza alla nascita. Una possibile spiegazione è la maggiore sensibilità alla manipolazione delle prime fasi. È interessante notare che il tasso di successo aumenta con l'avanzare della fase embrionale, probabilmente a causa della maggiore esposizione dell'embrione alle secrezioni oviductali prima del suo recupero. Ma quando gli embrioni raggiungono lo stadio di blastocisti e sono trasferiti all'utero, i valori diminuiscono drasticamente. Non escludendo ciò che è stato detto, una possibile spiegazione potrebbe essere che gli embrioni trasferiti nell'ovidotto possono ripristinare i possibili danni generati nello strato di mucina durante la manipolazione dell'embrione. Pertanto, le blastocisti trasferite nell'utero sarebbero private di questo meccanismo, che potrebbe compromettere la loro capacità di impianto.

La tecnica viene eseguita utilizzando uno strumento a singola porta (trocar endoscopio da 5 mm), con una lieve e breve manipolazione. Pertanto, l'incisione di trocar endoscopio the5-mm non richiede la chiusura. Vantaggi di tecnica laparoscopica includono diminuzione del dolore postoperatorio, ritorno più veloce alla normale attività, e meno complicazioni postoperatorie. Inoltre, le procedure endoscopiche inducono meno Aderenze addominali e consentono una migliore risposta immunitaria da parte del ricevente rispetto alla chirurgia aperta21,36,37. Accumulando prove dal nostro laboratorio ha dimostrato l'efficacia di questa procedura ET nel modello di coniglio. Così, negli ultimi cinque anni, un totale di 3.909 embrioni (1.335 embrioni freschi e 2.574 vetrificati) sono stati trasferiti attraverso la procedura descritta nel presente manoscritto. Come risultato di questa tecnica, i tassi di discendenti di embrioni di trasferimento freschi e vetrificati erano 62,9% e 42,5%, rispettivamente38,39,40,41,42, 43 a , 44 a , 45 a , 46 a , 47. molti studi sono tutti basati su questa tecnica: Marco-Jiménez et al. 38 a , 39 a , 40 a , 41, Vicente et al. 42, Viudes-de-Castro et al. 43, Saenz-de-Juano et al. 44 a , 45 a , 47, lavara et al. 46.

Le raccomandazioni pratiche per l'esecuzione di questa tecnica sono descritte di seguito. Negli esperimenti di coltura embrionale, è anche consigliabile utilizzare un nuovo catetere per il trasferimento degli embrioni invece di quello utilizzato per spostare gli embrioni tra i media di coltura e i mezzi di manipolazione. Questo evita il trasferimento di olio minerale e garantisce un flusso ottimale. Durante l'ET è importante minimizzare la manipolazione del tratto riproduttivo, poiché un'eccessiva manipolazione dell'ovidotto potrebbe comportare aderenze. Se l'ovidotto è attorcigliato, impiegare la siringa epidurale per cercare di posizionarlo correttamente, non il catetere, in quanto contiene gli embrioni e la manipolazione meccanica potrebbe causare la loro perdita. Una volta che il catetere passa attraverso l'ovidotto, scivola facilmente. In caso contrario, il catetere potrebbe essersi deviato. Una volta all'interno dell'ovidotto, se il supporto non scorre, spostare leggermente il catetere e tentare di reinserirlo nuovamente. Se ancora non scorre, il catetere è intasato. Rimuoverlo dall'ovidotto e liberare il contenuto in un piatto con un mezzo pulito. Quindi, ricaricare gli embrioni in un altro catetere e cercare di reinserirlo nell'ovidotto di nuovo. La consegna di solito avviene 28-30 giorni dopo il trasferimento di morula.

Inoltre, ci sono prove che indicano che la fase di sviluppo embrionale può essere più avanzata rispetto all'ambiente uterino nelle femmine pseudopregnanti, ma non il contrario. In particolare, gli embrioni hanno la capacità di attendere l'ambiente favorevole dell'utero, ma l'ambiente dell'utero non può attendere che gli embrioni siano nella fase giusta per l'impianto10. Per quanto riguarda gli embrioni vetrificati, dopo una conservazione a breve/lungo termine è possibile sincronizzare la fase evolutiva dell'embrione con il corrispondente ambiente dell'utero favorevole. Inoltre, se il donatore di embrioni è anche il ricevente dell'embrione, gli effetti dannosi della superovulazione sull'endometrio possono essere bypassati utilizzando la tecnica di vetrificazione e trasferendo gli embrioni in un successivo ciclo48. Nei conigli, gli embrioni vetrificati trasferiti in ovidotti di destinatari indotti a ovulazione 60-62 h in anticipo (asincrista) è una tecnica altamente efficiente44,49. Correlato con questo, è stato suggerito che la transizione embrionale oviductal durante 10-12 h potrebbe spiegare gli effetti benefici nel ripristino della fisiologia cellulare e la sostituzione delle cellule morte, e probabilmente riparare il danno indotto in pelo di mucina durante l'embrione Manipolazione. Inoltre, gli embrioni vetrificati presentano un ritardo nello sviluppo, poiché sono stati metabolicamente sospesi durante lo stoccaggio. Pertanto, il trasferimento di embrioni criopriservati in destinatari asincroni consente all'embrione di riattivare la sua attività metabolica e quindi la fase embrionale dello sviluppo è sincronizzata con l'ambiente dell'utero. Invece, se gli embrioni criopriservati vengono trasferiti in recettori sincroni, il cross-talk tra la madre e l'embrione ostacola l'insorgenza di una gravidanza di successo. Nel coniglio, il tasso di sopravvivenza più alto è stato ottenuto dopo il trasferimento intraoviductal di morulae crioriservati49. I nostri dati sono coerenti con questo rapporto, anche se la fase morula esibisce diversi tassi di sopravvivenza a seguito di crioconservazione a seconda del loro grado di compattazione a 70-72 h (tabella 2). Qui, le morule compatte hanno mostrato tassi di sopravvivenza più elevati alla nascita rispetto alle morule non compattate, che era in concordanza con precedenti relazioni che dimostrano che ogni fase dello sviluppo aveva un proprio meccanismo relativo alla permeazione di crioprotectants e l'estensione della disidratazione durante l'aggiunta della soluzione di crioconservazione50. Alla base di queste tecniche, abbiamo dimostrato che una combinazione di vetrificazione e trasferimento embrionale intraoviducale è una strategia di successo per ristabilire la popolazione di conigli dopo 15 anni di stoccaggio in azoto liquido, senza effetti negativi sulla loro sopravvivenza post-scongelamento e nascita dal vivo51.

I seguenti dettagli devono essere presi in considerazione per eseguire con successo questa tecnica. È importante tenere presente che la crescente densità dei mezzi consecutivi utilizzati per la vetrificazione (DPBS, soluzione di equilibrazione, soluzione di vetrificazione) potrebbe indurre la contrazione dell'embrione a causa della progressiva disidratazione embrionale. Tuttavia, il suo aspetto normale viene recuperato quando l'embrione viene equilibrato con il mezzo. Inoltre, quando l'embrione viene spostato tra l'aumento della densità media, tende a spostarsi sulla superficie del supporto a causa di movimenti di densità. Per evitare la perdita di embrioni e garantire il tempo di vetrificazione, si consiglia di eseguire la vetrificazione in piccole gocce di media che manterrà l'embrione in posizione.

In conclusione, qui descriviamo sia una tecnica ET e un metodo di vetrificazione embrionale che facilitano gli studi futuri che utilizzano i conigli come modello. Sulla base della stretta distanza filogenetica tra conigli e umani, l'uso di questo modello potrebbe fornire risultati facilmente trasferibili alla medicina clinica umana. Inoltre, il nostro metodo offre alcuni vantaggi igienici ed economici, conformi al concetto delle 3 RS di benessere degli animali (sostituzione, riduzione e raffinatezza), pur mantenendo l'obiettivo di migliorare il trattamento umano degli animali da esperimento.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi del Ministero dell'economia e della competitività della Spagna (AGL2017-85162-C2-1-R) e del programma di ricerca Generalitat Valenciana (PrometeoII 2014/036). Versione testuale inglese riveduta da N. MacOwan English Language Service

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 332
Buprenorphine hydrochloride Alvet Escartí 626 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buserelin Acetate Sigma Aldrich B3303
Clorhexidine digluconate soap Alvet Escartí 0265DCCJ500B
Clorhexidine digluconate solution Alvet Escartí 0265DCCA500B
CO2 Air Liquide 99921 CO2 N48.
CO2 Incubator Fisher scientific 15385194
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich W387509
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) Sigma Aldrich D5773 Without calcium chloride.
Electric razor Oster Golden A5 078005-140-002
Endoscope camera Optomic Spain S.A OP-714
Endoscope trocar with silicone leaflet valve Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 30114GK Lightweight trocar model.
Enrofloxacin Alvet Escartí 9993046 To be ordered by a licensed veterinarian.
Epicraneal needle 23G Alvet Escartí 514056353 Smaller needles can be also used.
Epidural catheter Vygon corporate 187.10
Epidural needle Vygon corporate 187.10
Ethylene Glycol Sigma Aldrich 102466-M
Eye ointment Alvet Escartí 5273
Ketamine hydrochloride Alvet Escartí 184 To be ordered by a licensed veterinarian.
Laparoscopy equipment Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 26003 AA Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel.
Light source Optomic Spain S.A Fibrolux 250
Liquid Nitrogen Air Liquide P1505XXX
Mechanical CO2 insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. Endoflator®
Meloxicam Alvet Escartí 9993501 To be ordered by a licensed veterinarian.
Petri dishes, 35-mm Sigma Aldrich CLS430165-500EA
Plastic dressing (Nobecutan) IBOR medica 7140028
Plastic Straw 0.25 mL IMV - technologies 6431
Povidone iodide solution Alvet Escartí 02656DPYS500S
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
Silicone tube for insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 20400040
Stereomicroscope Leica MZ16F There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few.
Sterile Gloves Alvet Escartí 087GL010075
Sterile gown Alvet Escartí 12261501
Sterile mask Alvet Escartí 058B15924B
Straw Plug IMV - technologies 6431
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Syringe, 1-mL Fisher scientific 11750425
Syringe, 5-mL Fisher scientific 11773313
Urinary catheter IMV - technologies 17722
Waterbath RAYPA BAE-4
Xylazine Alvet Escartí 525225 To be ordered by a licensed veterinarian.
Rabbits Universitat Politècnica de València Line A Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used.

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Trasferimento embrionale minimamente invasivo e vetrificazione embrionale nella fase embrionale ottimale nel modello Rabbit
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Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).More

Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).

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