Minimalt invasiv embryo Transfer og embryo vitrifikasjon på optimal embryo Stage i Rabbit Model

Summary

Assisterte reproduksjons teknikker (ARTs) er i kontinuerlig evaluering for å forbedre resultatene og redusere de tilknyttede risikoene. Dette manuskriptet beskriver et minimalt invasiv embryo overføring prosedyre med en effektiv kryonisk bevaring protokoll som tillater bruk av kaniner som en ideell dyr modell av menneskelig reproduksjon.

Abstract

Assisterte reproduktive teknikker (ARTs), slik som in vitro embryo kultur eller embryo kryonisk bevaring, påvirker naturlige utviklingsmønstre med Perinatal og postnatal konsekvenser. For å sikre innocuousness av ART-applikasjoner, er studier i dyremodeller nødvendig. I tillegg, som et siste skritt, krever embryoutvikling studier evaluering av deres evne til å utvikle full-term sunne avkom. Her er embryo overføring til livmoren uunnværlig for å utføre noen kunst-relaterte eksperiment.

Kaninen har blitt anvendt som modell organisme å studere pattedyr reproduksjon for over et århundre. I tillegg til sin Fylogenetiske nærhet til den menneskelige arter og dens lille størrelse og lave vedlikeholdskostnader, har det viktige reproduktive egenskaper som indusert eggløsning, en kronologi for tidlig embryoutvikling ligner på mennesker og en kort svangerskap som tillater oss å studere konsekvensene av ART programmet lett. Videre er ARTs (for eksempel Intracytoplasmatisk sperm injeksjon, embryo kultur, eller kryonisk bevaring) påføres med egnet effektivitet i denne arten.

Ved hjelp av laparoskopisk embryo overføring teknikk og kryonisk bevaring protokollen som presenteres i denne artikkelen, beskriver vi 1) hvordan du overfører embryo gjennom en enkel, minimalt invasiv teknikk og 2) en effektiv protokoll for langtidslagring av kanin embryo for å gi tid-fleksible logistikk kapasiteter og evnen til å transportere prøven. Resultatene oppnådd etter overføring kanin embryo på ulike utviklingsmessige stadier tyder på at Morula er den ideelle scenen for kanin embryo utvinning og overføring. Dermed kreves en oviductal embryo overføring, rettferdiggjøre den kirurgiske prosedyren. Videre, kanin morulae er med hell vitrified og laparoskopisk forflyttet, beviser effektiviteten av det beskrevet teknikker.

Introduction

Med mål om å omgå menneskets infertilitet eller forbedre formidling av husdyr med høy genetisk verdi og bevare dyr genetiske ressurser, et sett av teknikker kollektivt betegnet assistert reproduksjon teknologier, for eksempel superovulation, i befruktning, embryo kultur eller kryonisk bevaring, ble utviklet^1,2. For tiden er hormonelle behandlinger gitt for å stimulere eggstokkene og produsere et stort antall antral eggstokkene¹. Oocytter samlet fra disse hårsekkene kan bli modnet, befruktet, og utviklet in vitro til de er enten embryo eller overført til surrogat mødre³. Men under disse behandlingene, kjønnscellene og zygotes utsettes for en rekke ikke-fysiologiske prosesser som kan kreve embryo tilpasning for å overleve i disse forholdene^4,5. Denne tilpasningen er mulig på grunn av tidlig embryo plastisitet, som tillater embryo endringer i genuttrykk og utviklingsmessige programmering⁶. Imidlertid kan disse endringene påvirke den påfølgende stadier av embryoutvikling inntil voksen alder, og det er nå allment akseptert at metoder, timing, kryonisk bevaring prosedyre eller kultur forhold viser ulike utfall på embryo skjebne^{7 , 8}. Derfor, for å belyse de spesifikke indusert virkningene av ARTs, bruk av godt preget dyremodeller er uunngåelig.

Den første dokumenterte Live fødsel som følge av overføring av pattedyr embryo fant sted i 1890⁹. I dag er embryo overføring (ET) til en surrogat kvinne et avgjørende skritt for å studere de ART-induserte virkningene under Preimplantation på påfølgende utviklingstrinn på embryo¹⁰. ET-teknikker avhenger av størrelsen og den anatomiske strukturen til hvert dyr. Når det dreier seg om stor-tok mål dyr modeller, den har blitt mulig å utføre ET av transcervikal nonsurgical ET teknikker, bortsett fra inne mindre-størrelse Art catheterization av det cervix er flere innviklet og inngrep teknikker er hyppig anvendt¹¹. Men kirurgisk ET kan forårsake hemorrhaging som kan svekke implantation og embryoutvikling, som blod kan invadere livmor lumen, forårsaker embryo død¹⁰. Transcervikal nonsurgical et teknikker brukes fortsatt hos mennesker, bavianer, storfe, griser og mus¹²,¹³,^14,15,16,17, men kirurgisk ETs brukes fortsatt i arter som geiter, sau eller andre dyr som presenterer ytterligere vanskeligheter^{10,18, 19,20,21}, for eksempel kaniner (to uavhengige cervices) eller mus (liten størrelse). Likevel, kirurgiske overføringsmetoder har en tendens til å ha gradvis blitt erstattet av mindre invasive metoder. Endoskopi ble brukt til å overføre embryo, for eksempel i kaniner, griser og små drøvtyggere^18,19,20. Disse minimal invasiv endoskopi metoder kan brukes til å overføre embryo inn i ampulle via infundibulum, som er viktig i kaniner og har vist gunstige effekter i enkelte arter²⁰. Dette er basert på viktigheten av riktig dialog mellom embryo og mor under tidlige embryo stadier i oviduct. Som nevnt ovenfor, embryo remodeling som finner sted i kaniner under embryo migrasjon gjennom oviduct er avgjørende for å oppnå embryo stand til implantatet^22,23.

Større størrelse dyremodeller, slik som storfe, er interessant fordi den biokjemiske og Preimplantation funksjoner er lik de i menneskelige arter²⁴. Imidlertid, stor dyrene er også dyr å bruk inne Preliminary rettssaker, og gnagere er betraktet som en ideal modell (76% modell organisere er Red) for laboratorium forskning²⁵. Ikke desto mindre, kaninen modell skaffer noe fordeler over Red inne reproduktiv studier, idet noe reproduktiv Biological prosesser forevise av Human er flere lignende inne kanin enn dem inne mus. Human og kanin gave en lignende kronologisk embryonale Genova aktivisering, gastrulation og hemochorial placenta struktur. I tillegg, ved hjelp av kaniner er det mulig å vite det nøyaktige tidspunktet for befruktning og graviditet stadier på grunn av deres indusert ovulation²⁵. Kanin livssykluser er korte, fullføre svangerskapet i 31 dager og nå puberteten på ca 4-5 måneder; dyret er lett å håndtere på grunn av sin føyelig og ikke-aggressiv atferd, og dens vedlikehold er svært økonomisk i forhold til bekostning av større dyr. Videre er det avgjørende å nevne at kaniner har en tosidig livmor med to uavhengige cervixes. Dette plasserer kaninen i en fortrinnsrett posisjon, som embryo fra ulike eksperimentelle grupper kan overføres til samme dyr, men i en annen livmor horn. Dette tillater oss å sammenligne både eksperimentelle effekter, redusere mors faktoren fra resultatene.

Dags dato, nonsurgical ET metoder er ikke inne bruk inne kanin. Noen studier utført på slutten av 90-tallet ved hjelp av en transcervikal et teknikk resulterte i lav leveranse priser varierer fra 5,5% til 20,0%^11,26 versus 50-65% av kirurgiske metoder, blant dem laparoskopi prosedyren beskrevet av Besenfelder og Brem¹⁸. Den lave suksessen utbredelsen av disse nonsurgical ET metoder i kaniner sammenfaller med mangelen på den nødvendige embryo remodeling i oviduct, som unngås i transcervikal ET. Her beskriver vi en effektiv minimal invasiv laparoskopisk ET prosedyre med kaniner som modell organisme. Denne teknikken gir en modell for videre reproduktiv forskning i store dyr og mennesker.

Fordi kaniner har en spesielt smal tid vindu for embryo implantation, ET i denne arten krever en høy grad av Synchrony mellom utviklingsmessige stadiet av fosteret på ET og fysiologiske status for mottakeren²⁷. I noen tilfeller, etter en reproduktiv behandling som bremser embryoutvikling (for eksempel in vitro kultur) eller endrer livmor mottakelighet (for eksempel superovulation behandlinger), er det ingen Synchrony mellom embryo og mors livmor. Disse situasjonene kan negativt påvirke utfallet. For å svare i disse sammenhenger, beskriver vi en effektiv kanin Morula vitrifikasjon protokoll som tillater oss å pause, organisere og gjenoppta eksperimenter. Denne prosessen er logistisk ønskelig for reproduktive studier og gir oss kapasitet for langtidslagring av embryo, slik at deres transport. Den laparoskopisk prosedyre og kryonisk bevaring strategier tillate bedre planlegging av studier med færre dyr. Derfor tilbyr vår metodikk hygieniske og økonomiske fordeler og er i samsvar med begrepet 3Rs (utskifting, reduksjon og raffinement) av dyre forskning med det oppgitte målet om å forbedre menneskelig behandling av forsøksdyr. Således, med disse metodene, kaniner utgjør en ideell modell organisme for in vivo reproduktive analyser.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer som brukes i denne studien ble utført i samsvar med direktiv 2010/63/EU-EØF om dyre eksperimenter og gjennomgått og godkjent av etisk komité for eksperimentering med dyr av Universitat Politècnica de València, Spania (forsknings kode: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC og JSV innehar et Autorisasjons sertifikat utstedt av den statlige administrasjonen i Valencia for å eksperimentere med dyr. XGD er autorisert til in situ overvåke velferd og omsorg for dyrene under eksperimentet.</…

Representative Results

Minimalt invasiv laparoskopisk overføring av fersk eller vitrified embryo steder kaninen blant de beste modellen dyr for reproduktive studier. Tabell 1 viser resultatene av ferskt et på ulike utviklingsmessige stadier (Figur 4) av overførte embryo. Overlevelse ved fødselen (prosent av embryo som resulterer i en valp) viste effekten av laparoskopisk teknikken er beskrevet i denne utredningen. De høyere verdiene ble oppnådd når ET ble ut…

Discussion

Siden den første dokumenterte Live fødsel sak fra overført embryo⁹, denne teknikken og kanin arter har blitt avgjørende i reproduktive studier. Foruten, embryo forskningsstudier som involverer manipulasjon, produksjon, kryonisk bevaring, etc. krever som et siste trinn evalueringen av embryo kapasitet til å generere sunne full-term avkom. Derfor er embryo overførings teknikk uunnværlig^13,28. Gjennom årene har kirurgiske met…

Materials

Bovine Serum Albumin (BSA)	VWR	332
Buprenorphine hydrochloride	Alvet Escartí	626	To be ordered by a licensed veterinarian.
Buserelin Acetate	Sigma Aldrich	B3303
Clorhexidine digluconate soap	Alvet Escartí	0265DCCJ500B
Clorhexidine digluconate solution	Alvet Escartí	0265DCCA500B
CO2	Air Liquide	99921	CO2 N48.
CO2 Incubator	Fisher scientific	15385194
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	W387509
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)	Sigma Aldrich	D5773	Without calcium chloride.
Electric razor	Oster Golden A5	078005-140-002
Endoscope camera	Optomic Spain S.A	OP-714
Endoscope trocar with silicone leaflet valve	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	30114GK	Lightweight trocar model.
Enrofloxacin	Alvet Escartí	9993046	To be ordered by a licensed veterinarian.
Epicraneal needle 23G	Alvet Escartí	514056353	Smaller needles can be also used.
Epidural catheter	Vygon corporate	187.10
Epidural needle	Vygon corporate	187.10
Ethylene Glycol	Sigma Aldrich	102466-M
Eye ointment	Alvet Escartí	5273
Ketamine hydrochloride	Alvet Escartí	184	To be ordered by a licensed veterinarian.
Laparoscopy equipment	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	26003 AA	Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel.
Light source	Optomic Spain S.A	Fibrolux 250
Liquid Nitrogen	Air Liquide	P1505XXX
Mechanical CO2 insufflator	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	Endoflator®
Meloxicam	Alvet Escartí	9993501	To be ordered by a licensed veterinarian.
Petri dishes, 35-mm	Sigma Aldrich	CLS430165-500EA
Plastic dressing (Nobecutan)	IBOR medica	7140028
Plastic Straw 0.25 mL	IMV – technologies	6431
Povidone iodide solution	Alvet Escartí	02656DPYS500S
Scissors	ROBOZ	RS-5880	Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
Silicone tube for insufflator	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	20400040
Stereomicroscope	Leica	MZ16F	There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few.
Sterile Gloves	Alvet Escartí	087GL010075
Sterile gown	Alvet Escartí	12261501
Sterile mask	Alvet Escartí	058B15924B
Straw Plug	IMV – technologies	6431
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
Syringe, 1-mL	Fisher scientific	11750425
Syringe, 5-mL	Fisher scientific	11773313
Urinary catheter	IMV – technologies	17722
Waterbath	RAYPA	BAE-4
Xylazine	Alvet Escartí	525225	To be ordered by a licensed veterinarian.
Rabbits	Universitat Politècnica de València	Line A	Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used.