Summary

Minimalt invasiv embryo Transfer og embryo vitrifikasjon på optimal embryo Stage i Rabbit Model

Published: May 16, 2019
doi:

Summary

Assisterte reproduksjons teknikker (ARTs) er i kontinuerlig evaluering for å forbedre resultatene og redusere de tilknyttede risikoene. Dette manuskriptet beskriver et minimalt invasiv embryo overføring prosedyre med en effektiv kryonisk bevaring protokoll som tillater bruk av kaniner som en ideell dyr modell av menneskelig reproduksjon.

Abstract

Assisterte reproduktive teknikker (ARTs), slik som in vitro embryo kultur eller embryo kryonisk bevaring, påvirker naturlige utviklingsmønstre med Perinatal og postnatal konsekvenser. For å sikre innocuousness av ART-applikasjoner, er studier i dyremodeller nødvendig. I tillegg, som et siste skritt, krever embryoutvikling studier evaluering av deres evne til å utvikle full-term sunne avkom. Her er embryo overføring til livmoren uunnværlig for å utføre noen kunst-relaterte eksperiment.

Kaninen har blitt anvendt som modell organisme å studere pattedyr reproduksjon for over et århundre. I tillegg til sin Fylogenetiske nærhet til den menneskelige arter og dens lille størrelse og lave vedlikeholdskostnader, har det viktige reproduktive egenskaper som indusert eggløsning, en kronologi for tidlig embryoutvikling ligner på mennesker og en kort svangerskap som tillater oss å studere konsekvensene av ART programmet lett. Videre er ARTs (for eksempel Intracytoplasmatisk sperm injeksjon, embryo kultur, eller kryonisk bevaring) påføres med egnet effektivitet i denne arten.

Ved hjelp av laparoskopisk embryo overføring teknikk og kryonisk bevaring protokollen som presenteres i denne artikkelen, beskriver vi 1) hvordan du overfører embryo gjennom en enkel, minimalt invasiv teknikk og 2) en effektiv protokoll for langtidslagring av kanin embryo for å gi tid-fleksible logistikk kapasiteter og evnen til å transportere prøven. Resultatene oppnådd etter overføring kanin embryo på ulike utviklingsmessige stadier tyder på at Morula er den ideelle scenen for kanin embryo utvinning og overføring. Dermed kreves en oviductal embryo overføring, rettferdiggjøre den kirurgiske prosedyren. Videre, kanin morulae er med hell vitrified og laparoskopisk forflyttet, beviser effektiviteten av det beskrevet teknikker.

Introduction

Med mål om å omgå menneskets infertilitet eller forbedre formidling av husdyr med høy genetisk verdi og bevare dyr genetiske ressurser, et sett av teknikker kollektivt betegnet assistert reproduksjon teknologier, for eksempel superovulation, i befruktning, embryo kultur eller kryonisk bevaring, ble utviklet1,2. For tiden er hormonelle behandlinger gitt for å stimulere eggstokkene og produsere et stort antall antral eggstokkene1. Oocytter samlet fra disse hårsekkene kan bli modnet, befruktet, og utviklet in vitro til de er enten embryo eller overført til surrogat mødre3. Men under disse behandlingene, kjønnscellene og zygotes utsettes for en rekke ikke-fysiologiske prosesser som kan kreve embryo tilpasning for å overleve i disse forholdene4,5. Denne tilpasningen er mulig på grunn av tidlig embryo plastisitet, som tillater embryo endringer i genuttrykk og utviklingsmessige programmering6. Imidlertid kan disse endringene påvirke den påfølgende stadier av embryoutvikling inntil voksen alder, og det er nå allment akseptert at metoder, timing, kryonisk bevaring prosedyre eller kultur forhold viser ulike utfall på embryo skjebne7 , 8. Derfor, for å belyse de spesifikke indusert virkningene av ARTs, bruk av godt preget dyremodeller er uunngåelig.

Den første dokumenterte Live fødsel som følge av overføring av pattedyr embryo fant sted i 18909. I dag er embryo overføring (ET) til en surrogat kvinne et avgjørende skritt for å studere de ART-induserte virkningene under Preimplantation på påfølgende utviklingstrinn på embryo10. ET-teknikker avhenger av størrelsen og den anatomiske strukturen til hvert dyr. Når det dreier seg om stor-tok mål dyr modeller, den har blitt mulig å utføre ET av transcervikal nonsurgical ET teknikker, bortsett fra inne mindre-størrelse Art catheterization av det cervix er flere innviklet og inngrep teknikker er hyppig anvendt11. Men kirurgisk ET kan forårsake hemorrhaging som kan svekke implantation og embryoutvikling, som blod kan invadere livmor lumen, forårsaker embryo død10. Transcervikal nonsurgical et teknikker brukes fortsatt hos mennesker, bavianer, storfe, griser og mus12,13,14,15,16,17, men kirurgisk ETs brukes fortsatt i arter som geiter, sau eller andre dyr som presenterer ytterligere vanskeligheter10,18, 19,20,21, for eksempel kaniner (to uavhengige cervices) eller mus (liten størrelse). Likevel, kirurgiske overføringsmetoder har en tendens til å ha gradvis blitt erstattet av mindre invasive metoder. Endoskopi ble brukt til å overføre embryo, for eksempel i kaniner, griser og små drøvtyggere18,19,20. Disse minimal invasiv endoskopi metoder kan brukes til å overføre embryo inn i ampulle via infundibulum, som er viktig i kaniner og har vist gunstige effekter i enkelte arter20. Dette er basert på viktigheten av riktig dialog mellom embryo og mor under tidlige embryo stadier i oviduct. Som nevnt ovenfor, embryo remodeling som finner sted i kaniner under embryo migrasjon gjennom oviduct er avgjørende for å oppnå embryo stand til implantatet22,23.

Større størrelse dyremodeller, slik som storfe, er interessant fordi den biokjemiske og Preimplantation funksjoner er lik de i menneskelige arter24. Imidlertid, stor dyrene er også dyr å bruk inne Preliminary rettssaker, og gnagere er betraktet som en ideal modell (76% modell organisere er Red) for laboratorium forskning25. Ikke desto mindre, kaninen modell skaffer noe fordeler over Red inne reproduktiv studier, idet noe reproduktiv Biological prosesser forevise av Human er flere lignende inne kanin enn dem inne mus. Human og kanin gave en lignende kronologisk embryonale Genova aktivisering, gastrulation og hemochorial placenta struktur. I tillegg, ved hjelp av kaniner er det mulig å vite det nøyaktige tidspunktet for befruktning og graviditet stadier på grunn av deres indusert ovulation25. Kanin livssykluser er korte, fullføre svangerskapet i 31 dager og nå puberteten på ca 4-5 måneder; dyret er lett å håndtere på grunn av sin føyelig og ikke-aggressiv atferd, og dens vedlikehold er svært økonomisk i forhold til bekostning av større dyr. Videre er det avgjørende å nevne at kaniner har en tosidig livmor med to uavhengige cervixes. Dette plasserer kaninen i en fortrinnsrett posisjon, som embryo fra ulike eksperimentelle grupper kan overføres til samme dyr, men i en annen livmor horn. Dette tillater oss å sammenligne både eksperimentelle effekter, redusere mors faktoren fra resultatene.

Dags dato, nonsurgical ET metoder er ikke inne bruk inne kanin. Noen studier utført på slutten av 90-tallet ved hjelp av en transcervikal et teknikk resulterte i lav leveranse priser varierer fra 5,5% til 20,0%11,26 versus 50-65% av kirurgiske metoder, blant dem laparoskopi prosedyren beskrevet av Besenfelder og Brem18. Den lave suksessen utbredelsen av disse nonsurgical ET metoder i kaniner sammenfaller med mangelen på den nødvendige embryo remodeling i oviduct, som unngås i transcervikal ET. Her beskriver vi en effektiv minimal invasiv laparoskopisk ET prosedyre med kaniner som modell organisme. Denne teknikken gir en modell for videre reproduktiv forskning i store dyr og mennesker.

Fordi kaniner har en spesielt smal tid vindu for embryo implantation, ET i denne arten krever en høy grad av Synchrony mellom utviklingsmessige stadiet av fosteret på ET og fysiologiske status for mottakeren27. I noen tilfeller, etter en reproduktiv behandling som bremser embryoutvikling (for eksempel in vitro kultur) eller endrer livmor mottakelighet (for eksempel superovulation behandlinger), er det ingen Synchrony mellom embryo og mors livmor. Disse situasjonene kan negativt påvirke utfallet. For å svare i disse sammenhenger, beskriver vi en effektiv kanin Morula vitrifikasjon protokoll som tillater oss å pause, organisere og gjenoppta eksperimenter. Denne prosessen er logistisk ønskelig for reproduktive studier og gir oss kapasitet for langtidslagring av embryo, slik at deres transport. Den laparoskopisk prosedyre og kryonisk bevaring strategier tillate bedre planlegging av studier med færre dyr. Derfor tilbyr vår metodikk hygieniske og økonomiske fordeler og er i samsvar med begrepet 3Rs (utskifting, reduksjon og raffinement) av dyre forskning med det oppgitte målet om å forbedre menneskelig behandling av forsøksdyr. Således, med disse metodene, kaniner utgjør en ideell modell organisme for in vivo reproduktive analyser.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer som brukes i denne studien ble utført i samsvar med direktiv 2010/63/EU-EØF om dyre eksperimenter og gjennomgått og godkjent av etisk komité for eksperimentering med dyr av Universitat Politècnica de València, Spania (forsknings kode: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC og JSV innehar et Autorisasjons sertifikat utstedt av den statlige administrasjonen i Valencia for å eksperimentere med dyr. XGD er autorisert til in situ overvåke velferd og omsorg for dyrene under eksperimentet.</…

Representative Results

Minimalt invasiv laparoskopisk overføring av fersk eller vitrified embryo steder kaninen blant de beste modellen dyr for reproduktive studier. Tabell 1 viser resultatene av ferskt et på ulike utviklingsmessige stadier (Figur 4) av overførte embryo. Overlevelse ved fødselen (prosent av embryo som resulterer i en valp) viste effekten av laparoskopisk teknikken er beskrevet i denne utredningen. De høyere verdiene ble oppnådd når ET ble ut…

Discussion

Siden den første dokumenterte Live fødsel sak fra overført embryo9, denne teknikken og kanin arter har blitt avgjørende i reproduktive studier. Foruten, embryo forskningsstudier som involverer manipulasjon, produksjon, kryonisk bevaring, etc. krever som et siste trinn evalueringen av embryo kapasitet til å generere sunne full-term avkom. Derfor er embryo overførings teknikk uunnværlig13,28. Gjennom årene har kirurgiske met…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av midler fra departementet for økonomi og konkurranseevne i Spania (AGL2017-85162-C2-1-R) og Generalitat Valenciana forskningsprogram (PrometeoII 2014/036). Engelsk tekstversjon revidert av N. Macowan engelsk språk service

Materials

Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 332
Buprenorphine hydrochloride Alvet Escartí 626 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buserelin Acetate Sigma Aldrich B3303
Clorhexidine digluconate soap Alvet Escartí 0265DCCJ500B
Clorhexidine digluconate solution Alvet Escartí 0265DCCA500B
CO2 Air Liquide 99921 CO2 N48.
CO2 Incubator Fisher scientific 15385194
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich W387509
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) Sigma Aldrich D5773 Without calcium chloride.
Electric razor Oster Golden A5 078005-140-002
Endoscope camera Optomic Spain S.A OP-714
Endoscope trocar with silicone leaflet valve Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 30114GK Lightweight trocar model.
Enrofloxacin Alvet Escartí 9993046 To be ordered by a licensed veterinarian.
Epicraneal needle 23G Alvet Escartí 514056353 Smaller needles can be also used.
Epidural catheter Vygon corporate 187.10
Epidural needle Vygon corporate 187.10
Ethylene Glycol Sigma Aldrich 102466-M
Eye ointment Alvet Escartí 5273
Ketamine hydrochloride Alvet Escartí 184 To be ordered by a licensed veterinarian.
Laparoscopy equipment Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 26003 AA Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel.
Light source Optomic Spain S.A Fibrolux 250
Liquid Nitrogen Air Liquide P1505XXX
Mechanical CO2 insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. Endoflator®
Meloxicam Alvet Escartí 9993501 To be ordered by a licensed veterinarian.
Petri dishes, 35-mm Sigma Aldrich CLS430165-500EA
Plastic dressing (Nobecutan) IBOR medica 7140028
Plastic Straw 0.25 mL IMV – technologies 6431
Povidone iodide solution Alvet Escartí 02656DPYS500S
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
Silicone tube for insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 20400040
Stereomicroscope Leica MZ16F There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few.
Sterile Gloves Alvet Escartí 087GL010075
Sterile gown Alvet Escartí 12261501
Sterile mask Alvet Escartí 058B15924B
Straw Plug IMV – technologies 6431
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Syringe, 1-mL Fisher scientific 11750425
Syringe, 5-mL Fisher scientific 11773313
Urinary catheter IMV – technologies 17722
Waterbath RAYPA BAE-4
Xylazine Alvet Escartí 525225 To be ordered by a licensed veterinarian.
Rabbits Universitat Politècnica de València Line A Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used.

References

  1. Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (ART). Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 388-402 (2017).
  2. Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo vitrification in rabbits: Consequences for progeny growth. Theriogenology. 84 (5), 674-680 (2015).
  3. Sirard, M. A. The influence of in vitro. fertilization and embryo culture on the embryo epigenetic constituents and the possible consequences in the bovine model. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 411-417 (2017).
  4. Feuer, S. K., Rinaudo, P. F. Physiological, metabolic and transcriptional postnatal phenotypes of in vitro. fertilization (IVF) in the mouse. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 403-410 (2017).
  5. Jiang, Z., et al. Genetic and epigenetic risks of assisted reproduction. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 44, 90-104 (2017).
  6. Fleming, T. P., Velazquez, M. A., Eckert, J. J. Embryos, DOHaD and David Barker. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 6 (5), 377-383 (2015).
  7. Sparks, A. E. Human embryo cryopreservation-methods, timing, and other considerations for optimizing an embryo cryopreservation program. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (2), 128-144 (2015).
  8. Swain, J. E. Optimal human embryo culture. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (2), 103-117 (2015).
  9. Heape, W. Preliminary note on the transplantation and growth of mammalian ova within a uterine foster-mother. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 48, 457-459 (1890).
  10. Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal embryo transfer and vasectomy in the mouse model. Journal of Visualized Experiments. (84), e51214 (2014).
  11. Kidder, J. D., Roberts, P. J., Simkin, M. E., Foote, R. H., Richmond, M. E. Nonsurgical collection and nonsurgical transfer of preimplantation embryos in the domestic rabbit (Oryctolagus cuniculus) and domestic ferret (Mustela putorius furo). Journal of Reproduction and Fertility. 116 (2), 235-242 (1999).
  12. Tıras, B., Cenksoy, P. O. Practice of embryo transfer: recommendations during and after. Seminars in Reproductive Medicine. 32 (4), 291-296 (2014).
  13. Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).
  14. Moreno-Moya, J. M., et al. Complete method to obtain, culture, and transfer mouse blastocysts nonsurgically to study implantation and development. Fertility and Sterility. 101 (3), e13 (2014).
  15. Hasler, J. F. Forty years of embryo transfer in cattle: a review focusing on the journal Theriogenology, the growth of the industry in North America, and personal reminisces. Theriogenology. 81 (1), 152-169 (2014).
  16. Bauer, C. The baboon (Papio sp.) as a model for female reproduction studies. Contraception. 92 (2), 120-123 (2015).
  17. Martinez, E. A., et al. Nonsurgical deep uterine transfer of vitrified, in vivo-derived, porcine embryos is as effective as the default surgical approach. Science Reports. 5, 10587 (2015).
  18. Besenfelder, U., Brem, G. Laparoscopic embryo transfer in rabbits. Journal of Reproduction and Fertility. 99, 53-56 (1993).
  19. Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47 (5), 1051-1060 (1997).
  20. Besenfelder, U., Havlicek, V., Kuzmany, A., Brem, G. Endoscopic approaches to manage in vitro and in vivo embryo development: use of the bovine oviduct. Theriogenology. 73 (6), 768-776 (2010).
  21. Fonseca, J. F., et al. Nonsurgical embryo recovery and transfer in sheep and goats. Theriogenology. 86 (1), 144-151 (2016).
  22. Denker, H. W. Structural dynamics and function of early embryonic coats. Cells Tissues Organs. 166, 180-207 (2000).
  23. Marco-Jiménez, F., López-Bejar, M. Detection of glycosylated proteins in rabbit oviductal isthmus and uterine endometrium during early embryo development. Reproduction in Domestic Animals. 48 (6), 967-973 (2013).
  24. Ménézo, Y. J., Hérubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reproductive BioMedicine Online. 4 (2), 170-175 (2002).
  25. Fischer, B., Chavatte-Palmer, P., Viebahn, C., Navarrete Santos, A., Duranthon, V. Rabbit as a reproductive model for human health. Reproduction. 144 (1), 1-10 (2012).
  26. Besenfelder, U., Strouhal, C., Brem, G. A method for endoscopic embryo collection and transfer in the rabbit. Zentralbl Veterinarmed A. 45 (9), 577-579 (1998).
  27. Daniel, N., Renard, J. P. Embryo transfer in rabbits. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (1), (2010).
  28. Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters rabbit foetal placenta at transcriptomic and proteomic level. Reproduction. 147 (6), 789-801 (2014).
  29. Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. Biotechniques. 47 (5), 919-924 (2009).
  30. Duan, X., Li, Y., Di, K., Huang, Y., Li, X. A nonsurgical embryo transfer technique in mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 32 (4), 440-446 (2016).
  31. Denker, H. W., Gerdes, H. J. The dynamic structure of rabbit blastocyst coverings. I. Transformation during regular preimplantation development. Anatomy and Embryology. 157, 15-34 (1979).
  32. Seidel, G. E., Bowen, R. A., Kane, M. T. In vitro fertilization, culture and transfer of rabbit ova. Fertility and Sterility. 27, 861-870 (1976).
  33. Binkerd, P. E., Anderson, G. B. Transfer of cultured rabbit embryos. Gamete Research. 2, 65-73 (1979).
  34. Murakami, H., Imai, H. Successful implantation of in vitro cultured rabbit embryos after uterine transfer: a role for mucin. Molecular Reproduction and Development. 43, 167-170 (1996).
  35. Techakumphu, M., Wintenberger-Torrèsa, S., Sevelleca, C., Ménézo, Y. Survival of rabbit embryos after culture or culture/freezing. Animal Reproduction Science. 13 (3), 221-228 (1987).
  36. Gitzelmann, C. A., et al. Cell-mediated immune response is better preserved by laparoscopy than laparotomy. Surgery. 127 (1), 65-71 (2000).
  37. Huang, S. G., Li, Y. P., Zhang, Q., Redmond, H. P., Wang, J. H., Wang, J. Laparotomy and laparoscopy diversely affect macrophage-associated antimicrobial activity in a murine model. BMC Immunology. 14, 27 (2013).
  38. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Almela-Miralles, V., Vicente, J. S. Development of Cheaper Embryo Vitrification Device Using the Minimum Volume Method. Public Library of Science One. 11 (2), e0148661 (2016).
  39. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Generation of live offspring from vitrified embryos with synthetic polymers supercool X-1000 and Supercool Z-1000. CryoLetters. 35, 286-292 (2014).
  40. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Use of cyclodextrins to increase cytoplasmic cholesterol in rabbit embryos and their impact on live KITs derived from vitrified embryos. Cryoletters. 35, 320-326 (2014).
  41. Marco-Jiménez, F., Lavara, R., Jiménez-Trigos, E., Vicente, J. S. In vivo development of vitrified rabbit embryos: Effects of vitrification device, recipient genotype, and asynchrony. Theriogenology. 79 (7), 1124-1129 (2013).
  42. Vicente, J. S., et al. Rabbit morula vitrification reduces early foetal growth and increases losses throughout gestation. Cryobiology. 67, 321-326 (2013).
  43. Viudes-de-Castro, M. P., Marco-Jiménez, F., Cedano-Castro, J. I., Vicente, J. S. Effect of corifollitropin alfa supplemented with or without Lh on ovarian stimulation and embryo viability in rabbit. Theriogenology. 98, 68-74 (2017).
  44. Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters at transcriptomic and proteomic level rabbit foetal placenta. Reproduction. 147, 789-801 (2014).
  45. Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Lavara, R., Vicente, J. S. Direct comparison of the effects of slow freezing and vitrification on late blastocyst gene expression, development, implantation and offspring of rabbit morulae. Reproduction in Domestic Animals. 49, 505-511 (2014).
  46. Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Long-term and transgenerational effects of cryopreservation on rabbit embryos. Theriogenology. 81, 988-992 (2014).
  47. Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo transfer manipulation cause gene expression variation in blastocysts that disrupt implantation and offspring rates at birth in rabbit. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 207, 50-55 (2016).
  48. Roque, M., Valle, M., Kostolias, A., Sampaio, M., Geber, S. Freeze-all cycle in reproductive medicine: current perspectives. JBRA Assisted Reproduction. 21 (1), 49-53 (2017).
  49. Tsunoda, Y., Soma, T., Sugie, T. Effect of post-ovulatory age of recipient on survival of frozen-thawed rabbit morulae. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 483-487 (1982).
  50. Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
  51. Lavara, R., Baselga, M., Vicente, J. S. Does storage time in LN2 influence survival and pregnancy outcome of vitrified rabbit embryos?. Theriogenology. 76 (4), 652-657 (2011).

Play Video

Cite This Article
Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).

View Video