Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Minimalt invasiv embryo Transfer og embryo vitrifikasjon på optimal embryo Stage i Rabbit Model

doi: 10.3791/58055 Published: May 16, 2019

Summary

Assisterte reproduksjons teknikker (ARTs) er i kontinuerlig evaluering for å forbedre resultatene og redusere de tilknyttede risikoene. Dette manuskriptet beskriver et minimalt invasiv embryo overføring prosedyre med en effektiv kryonisk bevaring protokoll som tillater bruk av kaniner som en ideell dyr modell av menneskelig reproduksjon.

Abstract

Assisterte reproduktive teknikker (ARTs), slik som in vitro embryo kultur eller embryo kryonisk bevaring, påvirker naturlige utviklingsmønstre med Perinatal og postnatal konsekvenser. For å sikre innocuousness av ART-applikasjoner, er studier i dyremodeller nødvendig. I tillegg, som et siste skritt, krever embryoutvikling studier evaluering av deres evne til å utvikle full-term sunne avkom. Her er embryo overføring til livmoren uunnværlig for å utføre noen kunst-relaterte eksperiment.

Kaninen har blitt anvendt som modell organisme å studere pattedyr reproduksjon for over et århundre. I tillegg til sin Fylogenetiske nærhet til den menneskelige arter og dens lille størrelse og lave vedlikeholdskostnader, har det viktige reproduktive egenskaper som indusert eggløsning, en kronologi for tidlig embryoutvikling ligner på mennesker og en kort svangerskap som tillater oss å studere konsekvensene av ART programmet lett. Videre er ARTs (for eksempel Intracytoplasmatisk sperm injeksjon, embryo kultur, eller kryonisk bevaring) påføres med egnet effektivitet i denne arten.

Ved hjelp av laparoskopisk embryo overføring teknikk og kryonisk bevaring protokollen som presenteres i denne artikkelen, beskriver vi 1) hvordan du overfører embryo gjennom en enkel, minimalt invasiv teknikk og 2) en effektiv protokoll for langtidslagring av kanin embryo for å gi tid-fleksible logistikk kapasiteter og evnen til å transportere prøven. Resultatene oppnådd etter overføring kanin embryo på ulike utviklingsmessige stadier tyder på at Morula er den ideelle scenen for kanin embryo utvinning og overføring. Dermed kreves en oviductal embryo overføring, rettferdiggjøre den kirurgiske prosedyren. Videre, kanin morulae er med hell vitrified og laparoskopisk forflyttet, beviser effektiviteten av det beskrevet teknikker.

Introduction

Med mål om å omgå menneskets infertilitet eller forbedre formidling av husdyr med høy genetisk verdi og bevare dyr genetiske ressurser, et sett av teknikker kollektivt betegnet assistert reproduksjon teknologier, for eksempel superovulation, i befruktning, embryo kultur eller kryonisk bevaring, ble utviklet1,2. For tiden er hormonelle behandlinger gitt for å stimulere eggstokkene og produsere et stort antall antral eggstokkene1. Oocytter samlet fra disse hårsekkene kan bli modnet, befruktet, og utviklet in vitro til de er enten embryo eller overført til surrogat mødre3. Men under disse behandlingene, kjønnscellene og zygotes utsettes for en rekke ikke-fysiologiske prosesser som kan kreve embryo tilpasning for å overleve i disse forholdene4,5. Denne tilpasningen er mulig på grunn av tidlig embryo plastisitet, som tillater embryo endringer i genuttrykk og utviklingsmessige programmering6. Imidlertid kan disse endringene påvirke den påfølgende stadier av embryoutvikling inntil voksen alder, og det er nå allment akseptert at metoder, timing, kryonisk bevaring prosedyre eller kultur forhold viser ulike utfall på embryo skjebne7 , 8. Derfor, for å belyse de spesifikke indusert virkningene av ARTs, bruk av godt preget dyremodeller er uunngåelig.

Den første dokumenterte Live fødsel som følge av overføring av pattedyr embryo fant sted i 18909. I dag er embryo overføring (ET) til en surrogat kvinne et avgjørende skritt for å studere de ART-induserte virkningene under Preimplantation på påfølgende utviklingstrinn på embryo10. ET-teknikker avhenger av størrelsen og den anatomiske strukturen til hvert dyr. Når det dreier seg om stor-tok mål dyr modeller, den har blitt mulig å utføre ET av transcervikal nonsurgical ET teknikker, bortsett fra inne mindre-størrelse Art catheterization av det cervix er flere innviklet og inngrep teknikker er hyppig anvendt11. Men kirurgisk ET kan forårsake hemorrhaging som kan svekke implantation og embryoutvikling, som blod kan invadere livmor lumen, forårsaker embryo død10. Transcervikal nonsurgical et teknikker brukes fortsatt hos mennesker, bavianer, storfe, griser og mus12,13,14,15,16,17, men kirurgisk ETs brukes fortsatt i arter som geiter, sau eller andre dyr som presenterer ytterligere vanskeligheter10,18, 19,20,21, for eksempel kaniner (to uavhengige cervices) eller mus (liten størrelse). Likevel, kirurgiske overføringsmetoder har en tendens til å ha gradvis blitt erstattet av mindre invasive metoder. Endoskopi ble brukt til å overføre embryo, for eksempel i kaniner, griser og små drøvtyggere18,19,20. Disse minimal invasiv endoskopi metoder kan brukes til å overføre embryo inn i ampulle via infundibulum, som er viktig i kaniner og har vist gunstige effekter i enkelte arter20. Dette er basert på viktigheten av riktig dialog mellom embryo og mor under tidlige embryo stadier i oviduct. Som nevnt ovenfor, embryo remodeling som finner sted i kaniner under embryo migrasjon gjennom oviduct er avgjørende for å oppnå embryo stand til implantatet22,23.

Større størrelse dyremodeller, slik som storfe, er interessant fordi den biokjemiske og Preimplantation funksjoner er lik de i menneskelige arter24. Imidlertid, stor dyrene er også dyr å bruk inne Preliminary rettssaker, og gnagere er betraktet som en ideal modell (76% modell organisere er Red) for laboratorium forskning25. Ikke desto mindre, kaninen modell skaffer noe fordeler over Red inne reproduktiv studier, idet noe reproduktiv Biological prosesser forevise av Human er flere lignende inne kanin enn dem inne mus. Human og kanin gave en lignende kronologisk embryonale Genova aktivisering, gastrulation og hemochorial placenta struktur. I tillegg, ved hjelp av kaniner er det mulig å vite det nøyaktige tidspunktet for befruktning og graviditet stadier på grunn av deres indusert ovulation25. Kanin livssykluser er korte, fullføre svangerskapet i 31 dager og nå puberteten på ca 4-5 måneder; dyret er lett å håndtere på grunn av sin føyelig og ikke-aggressiv atferd, og dens vedlikehold er svært økonomisk i forhold til bekostning av større dyr. Videre er det avgjørende å nevne at kaniner har en tosidig livmor med to uavhengige cervixes. Dette plasserer kaninen i en fortrinnsrett posisjon, som embryo fra ulike eksperimentelle grupper kan overføres til samme dyr, men i en annen livmor horn. Dette tillater oss å sammenligne både eksperimentelle effekter, redusere mors faktoren fra resultatene.

Dags dato, nonsurgical ET metoder er ikke inne bruk inne kanin. Noen studier utført på slutten av 90-tallet ved hjelp av en transcervikal et teknikk resulterte i lav leveranse priser varierer fra 5,5% til 20,0%11,26 versus 50-65% av kirurgiske metoder, blant dem laparoskopi prosedyren beskrevet av Besenfelder og Brem18. Den lave suksessen utbredelsen av disse nonsurgical ET metoder i kaniner sammenfaller med mangelen på den nødvendige embryo remodeling i oviduct, som unngås i transcervikal ET. Her beskriver vi en effektiv minimal invasiv laparoskopisk ET prosedyre med kaniner som modell organisme. Denne teknikken gir en modell for videre reproduktiv forskning i store dyr og mennesker.

Fordi kaniner har en spesielt smal tid vindu for embryo implantation, ET i denne arten krever en høy grad av Synchrony mellom utviklingsmessige stadiet av fosteret på ET og fysiologiske status for mottakeren27. I noen tilfeller, etter en reproduktiv behandling som bremser embryoutvikling (for eksempel in vitro kultur) eller endrer livmor mottakelighet (for eksempel superovulation behandlinger), er det ingen Synchrony mellom embryo og mors livmor. Disse situasjonene kan negativt påvirke utfallet. For å svare i disse sammenhenger, beskriver vi en effektiv kanin Morula vitrifikasjon protokoll som tillater oss å pause, organisere og gjenoppta eksperimenter. Denne prosessen er logistisk ønskelig for reproduktive studier og gir oss kapasitet for langtidslagring av embryo, slik at deres transport. Den laparoskopisk prosedyre og kryonisk bevaring strategier tillate bedre planlegging av studier med færre dyr. Derfor tilbyr vår metodikk hygieniske og økonomiske fordeler og er i samsvar med begrepet 3Rs (utskifting, reduksjon og raffinement) av dyre forskning med det oppgitte målet om å forbedre menneskelig behandling av forsøksdyr. Således, med disse metodene, kaniner utgjør en ideell modell organisme for in vivo reproduktive analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer som brukes i denne studien ble utført i samsvar med direktiv 2010/63/EU-EØF om dyre eksperimenter og gjennomgått og godkjent av etisk komité for eksperimentering med dyr av Universitat Politècnica de València, Spania (forsknings kode: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC og JSV innehar et Autorisasjons sertifikat utstedt av den statlige administrasjonen i Valencia for å eksperimentere med dyr. XGD er autorisert til in situ overvåke velferd og omsorg for dyrene under eksperimentet.

1. overføring av embryo

  1. Utarbeidelse av mottaker kvinner
    1. Bruk bare seksuelt modne hunner (> 4,5 måneder gammel).
    2. En uke før ET, tilpasse kvinner til en 16 h Light/8 t mørkt regime for å initiere follikulær vekst og forbedret kvinnelige mottakelighet.
    3. Velg mottaker kvinner, observere turgidity og fargen på snappe. Hvis snappe er turgid og rødlig, er den kvinnelige mottakelig.
    4. Indusere pseudopregnancy (eggløsning) ved en enkelt intramuskulær injeksjon av 1 μg buserelin acetate (syntetisk analog av gonadotropin-frigjørende hormon) uavhengig av kroppsvekt.
      Merk: normalt er 0,8 μg en passende dose for eggløsning induksjon i mellom store kaniner (4-5 kg), slik at 1 μg generelt garanterer eggløsningen.
    5. Indusere ovulation så mange dager på forhånd som en alder av embryo som skal overføres (for eksempel 70-72 h før fersk Morula ET).
  2. Anestesi og analgesi
    1. Veie kaninen og belaste det fulgte bedøvelse og smertestillende.
      1. I en 1 mL sprøyte med en 30G nål: Last xylazine (5 mg/kg) og med buprenorfin (0,03 mg/kg). I en annen 1 mL sprøyte med en 23G pericranial nål, Last ketamin hydrochloride (35 mg/kg).
    2. Avholde kaninen og injisere det xylazine-buprenorfin blanding intramuskulært.
    3. Sett inn den pericranial nålen med ketamin i den marginale øre venen, og innføre langsomt alle sprøyte innholdet intravenøst.
    4. Fest nålen og la den settes inn gjennom de resterende trinnene for å administrere mer anestesi hvis nødvendig.
    5. Avreise kaninen inne byrået (feilfri og uten alle annet dyrene) opp på en hjertelig scene.
    6. Når bevisstløs, Påfør øye salve for å unngå tørrhet i øyet og se etter fraværet av palpebral freflex.
      Merk: denne protokollen gir et kirurgisk anestesi plan for minimum 30 min. Hvis en lengre tid er nødvendig, injisere ytterligere doser med halvparten av mengden ketamin hydrochloride beskrevet i 1.2.1 etter 30 min.
    7. Overvåk dybden av anestesi ved å sjekke pedal refleks og puste bevegelse. Endringer i puste mønsteret til en uregelmessig og raskere hastighet indikerer tap av riktig planet av anestesi.
    8. Overvåk fargen på slimhinnene (øyne, lepper, etc.), respirasjonsfrekvens (30-60 pust per minutt), hjertefrekvens (120-325 slag per minutt) og rektal temperatur (38-39.6 ° c).
    9. Åtte timene tidligere forflytning, holde tilbake næringen fra dyrene å unngå det betydelig tarmen størrelse og aktivitet til det ET forarbeide er ferdig. La fri tilgang til vann.
  3. Forberedelse av embryo
    1. Varm embryo manipulasjon Media til 25 ° c: base medium (BM), bestående av Dulbecco ' s fosfat-bufret Saline (DPBS) supplert med 0,2% (w/v) av storfe serum albumin.
    2. Arbeid under en stereomikroskopet, skyll fersk eller tint (trinn 2) embryo med BM.
    3. Bruk sterile hansker, fest et riktig konfigurert 17G epidural kateter til en 1 mL sprøyte.
    4. Aspirer 1 cm av BM inn i kateteret, etterfulgt av en liten luftboble.
    5. Aspirer 5-7embryos i et volum på 10 μL av BM, etterfulgt av en annen liten luftboble.
    6. Fullfør lasting av kateteret ved aspirating 1 cm av BM.
  4. Overføring av embryo
    1. Vurder bruk av sterile hansker, kappe og maske for å sikre en aseptisk miljø.
    2. Sterilisere Kirurgiske instrumenter, rengjør overflater der kirurgi vil bli utført, og tørk dem med 70% etanol.
    3. Utfør anestesi som tidligere beskrevet (trinn 1,2), sjekke for tap av reflekser.
    4. Barbere pelsen fra ventrale magen med en elektrisk barberhøvel.
    5. Forbered ventrale magen aseptisk.
      1. Rengjør operasjonsområdet og fjern eventuelle gjenværende hår. Vask operasjonsområdet med en klorheksidin gluconate såpe. Rense området med klorheksidin oppløsning og etanol 96 º (3 ganger).
    6. Plasser dyret på en varm kirurgisk bord, i Trendelenburg posisjon (hodet ned på 45 °) for å sikre at magen og tarmene er cranially plassert. Vurdere evakuering av blæren hvis det er turgid. Hvis noen innvollene er skadet i prosessen, kan dyret dø. Det er derfor viktig å ha dem riktig plassert (figur 1).
    7. Dekk området ved hjelp av et sterilt håndkle, med et hull (fenestration) utsette barberte området, for å skille operasjonsstedet fra alle potensielle forurensende områder.
    8. Sett inn en endoskopisk trokaren 5 cm i bukhulen, 2 cm caudal til xiphoid prosessen, og insufflate gjennom den bukhulen med en trykk-regulere mekaniske insufflator.
      Merk: trykket i intra-abdomen bør være 8-12 mmHg med CO2 (figur 1a).
    9. Sett inn endoskop kameraet gjennom endoskopisk trokaren (figur 1B).
      Merk: Identifiser reproduktive skrift, bestemme status og plassering av infundibulum og ampulle før ET for å lette de neste trinnene.
    10. Sett 17-G epidural nålen inn i lysken regionen mellom 2-3 cm fra infundibulum (figur 1B).
    11. Identifiser inngangen til infundibulum (figur 2a, 2b).
    12. Sett inn det lastede kateteret (trinn 1,3) gjennom epidural nålen inn i buken (figur 1C).
    13. Finn oviduct og sett inn 1-2 cm av epidural kateteret gjennom infundibulum i ampulle (figur 2a-2C). Ikke utvikle seg veldig langt inn i oviduct for å hindre skade og blødning.
    14. Frigjør embryo i oviduct ved å trykke forsiktig på stempelet på sprøyten som er koblet til kateteret (figur 2D-2F). Begge luftboblene må gå ut av kateteret.
    15. Fjern kateteret rett etter at embryo har blitt løslatt.
    16. Skyll kateteret, aspirating og slippe manipulere medium for å sjekke fraværet av embryo og bekrefte deres vellykket overføring.
    17. Gjenta trinn 1.4.11 å 1.4.16 i den andre siden av livmoren, hvis ønskelig.
    18. Fjern epidural nålen og endoskop kameraet.
    19. Release CO2 gjennom endoskopisk trokaren. Hvis overflødig gass forblir i buken på dyret, vil det ha smerter og ubehag.
    20. Fjern endoskopisk trokaren fra bukhulen. Fjern det kirurgiske håndkleet.
    21. Avslutte anestesi.
    22. Rengjør snittet gjort av trokaren med klorheksidin løsning. Lukk snittet laget av trokaren med en mikronisert aluminium og en plast dressing.
  5. Postoperativ behandling
    1. Behandle dyrene med antibiotika: 10 mg/kg enrofloksacin, subkutant, hver 24-h for 5 dager.
    2. Administrere smertestillende: (0,03 mg/kg) buprenorfin, intramuskulært, hver 12 timer i 3 dager; Meloksikam (0,2 mg/kg), subkutant, hver 24-h for 3 dager.
    3. Monitor dyrene i minst 30 min etter operasjonen (avhengig av dyret og dosen av anestesi brukes) gjør at de gjenopprette sine fysiologiske forhold.
    4. Identifiser mottaker (f. eks øret tatovering) og husdyr individuelt i et rent bur med riktig miljø tilstand.

Figure 1
Figur 1: laparoskopisk embryo overføring assistert av laparoskopi (ekstern visning). A) innsetting av endoskopisk trokaren (en port). B) innsetting av endoskopisk kameraet og epidural nålen (svart pil). C) innsetting av embryo overførings kateter (hvit pil) gjennom epidural nålen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: laparoskopisk embryo overføring assistert av laparoskopi (intern visning). A: Innsetting av kateteret gjennom epidural nålen inn i mage sonen. Stjernen angir infundibulum. B, C, D: Kateteret lastet med embryo er satt inn i ampulle regionen over infundibulum. E, F: Release av embryo, bekreftet av visualisering av en hoven oviduct. Dette tallet er tilpasset fra Marco-Jiménez et al. 38. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. embryo vitrifikasjon og oppvarming

  1. Utfør alle manipulasjoner ved romtemperatur (ca. 22 ° c) for å redusere den vitrifikasjon løsnings toksisitet ved varmere temperaturer.
    Merk: embryo kan flyttes ved hjelp av 0,1-2 μL automatisk pipette i denne protokollen, men andre lignende enheter for å flytte embryo dra minimum volum kan være egnet.
  2. Vitrify embryo i en to-trinns tillegg prosedyre:
    1. Plasser embryo i 2 minutter i equilibrating løsning bestående av 10% (v/v) etylen glykol og 10% (v/v) dimethyl sulfoxide oppløst i BM.
    2. Flytt embryo (fra trinn 2.2.1) i 1 minutt til vitrifikasjon løsning bestående av 20% (v/v) etylen glykol og 20% (v/v) dimethyl sulfoxide oppløst i BM.
  3. Legg embryo i en 125 μL plast ministraw (som inneholder en lukket ende med en bomulls plugg og en åpen ekstrem). Prosessen er Schematized i Figur 3.
    1. Par den lukkede enden av 0,125 μL ministraw med riktig microdispenser (f.eks. Captroll III®).
    2. Aspirer BM inntil 1/3 av halm lengde, følgende av en liten luftboble.
    3. Aspirer embryo i et volum på 40 μL av vitrifikasjon løsning, etterfulgt av en annen liten luftboble.
    4. Aspirer BM til den første væske fraksjonen (trinn 2.3.2) når bomull.
    5. Lukk den åpne enden med en strå plugg.
  4. Utfør trinn 2.2.2 mens trinn 2,3 blir gjort for å sikre at ikke mer enn ett minutt går, noe som ville være giftig for embryo.
  5. Kast ministraw direkte i flytende nitrogen for å oppnå vitrifikasjon.
  6. Oppbevar ministraw i en Dewar for nitrogen for ønsket tid.
  7. Tin embryo i ett trinn.
    1. Plasser ministraw horisontalt 10 cm fra flytende nitrogendamp for 20-30 s.
    2. Når krystallisering prosessen begynner inne i ministraw, Senk ministraw i et vannbad ved 25 ° c for 10-15 s.
    3. Fjern ministraw pluggen og kutt bomulls pluggen.
    4. Med en kombinert microdispenser, utvise alt ministraw innhold i en plate som inneholder 0,33 M sukrose løsning ved 25 ° c i BM i 5 minutter.
      Merk: dette trinnet må gjøres raskt for å redusere embryo eksponering for den vitrifikasjon løsningen.
    5. Flytte embryo til en ny plate som inneholder BM løsning for ytterligere 5 min.
    6. Tenk bare ikke-skadet embryo (med intakt mucin pels og Zona pellucida) for å fortsette med ET.
      Merk: ta hensyn til at i tint embryo, asynkron overføringer (f. eks 60-62 h i Morula overføringer) kan forbedre resultatene ved å tillate en synkroniseringen mellom embryo og mors endometrium.

Figure 3
Figur 3: Schematization av riktig lastet halm. A) BM refererer til det embryo-manipulerer mediet som ble benyttet under vitrifikasjon. Embryo må lastes i vitrifikasjon løsning. B) makroskopisk utseende på det lastede halm røret med en forstørret detalj av posisjonen til fosteret. Denne store volum enheten tillater oss å vitrify stort antall embryo, i motsetning til minimum volum enheter. Videre er håndteringen av denne enheten enklere sammenlignet med minimum volum enheter, mens resultatene er like i kaniner41. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Minimalt invasiv laparoskopisk overføring av fersk eller vitrified embryo steder kaninen blant de beste modellen dyr for reproduktive studier. Tabell 1 viser resultatene av ferskt et på ulike utviklingsmessige stadier (Figur 4) av overførte embryo. Overlevelse ved fødselen (prosent av embryo som resulterer i en valp) viste effekten av laparoskopisk teknikken er beskrevet i denne utredningen. De høyere verdiene ble oppnådd når ET ble utført med embryo i Morula stadiet, enten tidlig eller kompakt morulae. Basert på disse resultatene, utførte vi et andre eksperiment for å demonstrere overlevelsesraten etter vitrifikasjon av disse embryo. Således, i tabell 2 viser vi resultatene oppnådd etter overføring vitrified kanin morulae utvinnes på samme tid, skille mellom de embryo som hadde nådd en god grad av komprimering eller ikke. Overlevelsesraten ved fødselen var forskjellig mellom de ulike embryo stadier, blir høyere i komprimerte morulae. Laparoskopisk embryo overføring er derfor en pålitelig teknikk for å overføre ferske og vitrified embryo hos kaniner

Figure 4
Figur 4: kanin embryo. A) Pronuclear. B) åtte celler. C) tidlig Morula. D) kompakt Morula. E) blastocyst. Asterisk angir de to pronuclei. Svarte piler indikerer Zona pellucida. Hvite piler indikerer mucin pels, som normalt varierer mellom embryo. ICM: indre celle Mass TE: Trophectoderm. Scale bar: 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Utviklingstrinn1 Embryo Mottakere Sted for overføring Graviditet rate (%) Implantat frekvens (%) Overlevelses hastighet ved fødselen (%)2
Pronuclear 78 for alle 7 Oviduct 7 (100) 50 (64,0)b 34 (43,6)b
8 celler 81 for alle 7 Oviduct 7 (100) 60 (74,1)b 53 (65,4)a
Tidlig Morula 81 for alle 7 Oviduct 7 (100) 80 (98,8)a 60 (74,1)a
Kompakt Morula 80 for alle 7 Oviduct 7 (100) 80 (100)a 58 (72,5)a
Blastocyst 80 for alle 7 Livmoren 7 (100) 73 (91,3)a 38 (47,5)b

Tabell 1. Effektiviteten av fersk kanin embryo overføring (in vivo avledet) av laparoskopi. 1forskjellige embryo ble gjenopprettet på 18-20h (pronuclear), 36-38h (8 celler), 60-62 h (tidlig morula), 70-72 h (kompakt morula) og 80-82 h (blastocyst) etter mating. Kompakt (> 32 celler) og ikke-kompakte morulae (≈ 32 celler) kan bli grunnlagt på 70-72 h, men bare kompakte morulae ble overført. 2 andre priser Survival rate ved fødselen fra mottakeren gravid gjør. a, b Verdier med ulike hevet skrift er statistisk forskjellig (P < 0.001).

Utviklingstrinn Overførte embryo Mottakere Graviditet rate (%) Overlevelses hastighet ved fødsel (%)1
Ikke komprimert 135 for alle 10 9 (90) 62 (45,9)b
Komprimert 150 for alle 10 10 (100,0) 98 (65,3)a
Totalt 285 for alle 20 19 (95) 160 (56,1)

Tabell 2. Levedyktigheten til ikke-komprimerte vs kompakte vitrified Morula. a, b-verdier med ulike hevet skrift er statistisk forskjellig (P < 0.001). 1 den andre Survival rate ved fødselen fra mottakeren gravid gjør. Embryo ble gjenopprettet på samme tid (70-72 h) og ble utmerker seg i kompakte (> 32 celler) og ikke-kompakte morulae (≈ 32 celler).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Siden den første dokumenterte Live fødsel sak fra overført embryo9, denne teknikken og kanin arter har blitt avgjørende i reproduktive studier. Foruten, embryo forskningsstudier som involverer manipulasjon, produksjon, kryonisk bevaring, etc. krever som et siste trinn evalueringen av embryo kapasitet til å generere sunne full-term avkom. Derfor er embryo overførings teknikk uunnværlig13,28. Gjennom årene har kirurgiske metoder i utgangspunktet ansatt for å overføre embryo inn i mors livmoren gradvis blitt erstattet av mindre invasive metoder i de aller fleste arter13,14,15, 21 priser og , 27 andre priser , 29 flere , 30. men i kaniner, intraoviductal et tidlig embryo stadier av utvikling og in vitro produsert embryo blir uunngåelig å sikre et lignende resultat til naturlige forhold. I kaniner, er intraoviductal mucin pels en avgjørende faktor som tillater embryo implantation, som det skjer etter Remodelling av embryonale belegg under blastocyst ekspansjon i livmor hornene. Men mucin pels deponering er begrenset til oviduct for 3 dager etter eggløsning, og den molekylære mekanismer av pels materiale deponering er i stor grad ukjent31. Av disse grunner, det er kjent at in vitro-utviklede blastocysts ikke overleve når overført til livmoren32,33,34, og embryo med en skadet mucin pels har en lavere overlevelse 35. likeledes, grupper som rapporterte en transcervikal embryo overføring i kaniner resulterte i svært lave Live Born priser11,26. Her presenterer vi en minimalt invasiv teknikk, tilpasset fra Besenfelder og Brem18, for å overføre embryo med vellykket fødselsrater. Ifølge resultatene i tabell 1, den Morula scenen i kanin embryo var den beste embryonale scenen for å oppnå en høy overlevelse ved fødselen. En mulig forklaring er større følsomhet for manipulering av de tidligste stadiene. Interessant, øker suksessraten som den embryonale scenen utvikler seg, muligens på grunn av større eksponering av fosteret å oviductal sekreter før utvinning sin. Men når embryo nå blastocyst scenen og er sted-konkordante overført til livmoren, verdiene reduseres drastisk. Ikke unntatt det som har blitt sagt, en mulig forklaring kan være at embryo overført til oviduct kan gjenopprette mulige skader generert i mucin lag under embryo manipulasjon. Derfor blastocysts overføres til livmoren ville bli fratatt denne mekanismen, som kan kompromittere deres implantation kapasitet.

Teknikken utføres ved hjelp av en enkelt port instrument (5 mm endoskop trokaren), med liten, kort manipulasjon. Derfor the5-mm endoskop trokaren snitt ikke krever lukking. Laparoskopisk teknikk fordeler inkluderer redusert postoperativ smerte, raskere tilbake til normal aktivitet, og færre postoperative komplikasjoner. I tillegg endoskopisk prosedyrer induserer færre abdominal adhesjon og tillate en bedre immunrespons av mottakeren sammenlignet med åpen kirurgi21,36,37. Akkumulere bevis fra vår Lab har vist effektiviteten av dette ET prosedyre i kanin modellen. Således, i de siste fem årene totalt 3 909 embryo (1 335 fersk og 2 574 vitrified embryo) ble overført gjennom prosedyren beskrevet i dagens manuskript. Som et resultat av denne teknikken, var avkom utbredelsen av ferske og vitrified overføre embryo 62,9% og 42,5%, henholdsvis38,39,40,41,42, 43 for alle , 44 for alle , 45 for alle , 46 for alle , 47. mange studier er alle basert på denne teknikken: Marco-Jiménez et al. 38 for alle , 39 for alle , 40 for alle , 41, Vicente et al. 42, Viudes-de-Castro et al. 43, Saenz-de-Juano et al. 44 for alle , 45 for alle , 47, lavara et al. i 46.

Praktiske anbefalinger for gjennomføring av denne teknikken er beskrevet nedenfor. I embryo kultur eksperimenter, er det også tilrådelig å bruke et nytt kateter for embryo overføring i stedet for den som brukes til å flytte embryo mellom kultur Media og manipulasjon Media. Dette unngår overføring av mineralolje og sikrer en optimal flyt. Under ET er det viktig å minimere håndteringen av reproduksjons veiene, da overdreven manipulering av oviduct kan føre til adhesjon. Hvis oviduct er vridd, ansette epidural sprøyten for å prøve å posisjonere den riktig, ikke kateteret, som den inneholder embryo og mekanisk manipulasjon kan føre til tap. Når kateteret passerer gjennom oviduct, glir det lett. Hvis den ikke gjør det, kan kateteret ha avviket. Når du er inne i oviduct, hvis mediene ikke flyter, flytte kateteret ut litt og prøve å sette det inn igjen. Hvis det fortsatt ikke flyte, kateteret er tilstoppet. Fjern den fra oviduct og slipp innholdet i en tallerken med et rent medium. Deretter laste embryo inn et annet kateter og prøve å sette den inn i oviduct igjen. Levering tar vanligvis steder 28-30 dager etter Morula overføring.

I tillegg er det bevis som indikerer at fosteret utviklingsmessige scenen kan være mer avansert enn livmor miljøet i pseudopregnant kvinner, men ikke det motsatte. Nærmere bestemt, embryo har evnen til å vente på den gunstige livmor miljøet, men livmor miljøet kan ikke vente på embryo på riktig stadium for implantation10. Med hensyn til vitrified embryo, etter en kort/langtidslagring er det mulig å synkronisere utviklingsmessige stadiet av fosteret med tilsvarende gunstige livmoren miljøet. Videre, hvis embryo donor er også embryo mottaker, de skadelige virkningene av superovulation på endometrium kan omgås ved hjelp av vitrifikasjon teknikk og overføring av embryo i en påfølgende syklus48. Hos kaniner, vitrified embryo overført til oviducts av mottakere indusert til har eggløsning 60-62 h forhånd (asynchrony) er en svært effektiv teknikk44,49. I slekt med dette, har det blitt antydet at oviductal embryo overgangen under 10-12 h kunne forklare gunstige effekter i restaurering av celle fysiologi og utskifting av døde celler, og sannsynligvis reparere skaden indusert i mucin pels under embryo Manipulasjon. Foruten, vitrified embryo presentere en forsinkelse i utviklingen, som de har blitt metabolically suspendert under lagring. Derfor, overføring av embryo embryo i asynkrone mottakere tillater embryo å reaktivere sin metabolske aktivitet og dermed embryo Stadium i utviklingen er synkronisert med livmor miljøet. I stedet, hvis embryo embryo overføres til synkront reseptorer, kryss-snakk mellom mor og embryo hindrer utbruddet av en vellykket graviditet. I kanin har den høyeste overlevelsesraten blitt oppnådd etter intraoviductal overføring av embryo morulae49. Våre data er i samsvar med denne rapporten, selv om Morula stadiet viser ulike overlevelses rater etter kryonisk bevaring avhengig av graden av komprimering på 70-72 h (tabell 2). Her, komprimert morulae viste høyere overlevelse ved fødselen i forhold til ikke-komprimerte morulae, som var i konkordans med tidligere rapporter som viser at hvert stadium i utviklingen hadde sin egen mekanisme i forhold til gjennomtrengning av cryoprotectants og omfanget av dehydrering under tilsetning av den kryonisk bevaring løsningen50. Underliggende disse teknikkene, har vi vist at en kombinasjon av vitrifikasjon og intraoviductal embryo overføring er en vellykket strategi for å reetablere kanin populasjoner etter 15 år med lagring i flytende nitrogen, uten negativ effekt på deres post-tine overlevelse og levende fødsel51.

Følgende detaljer bør tas i betraktning for å kunne utføre denne teknikken. Det er viktig å huske på at den økende tettheten av de påfølgende mediene som brukes for vitrifikasjon (DPBS, likevekts løsning, vitrifikasjon løsning) kan indusere embryo sammentrekning på grunn av progressive embryo dehydrering. Men det normale utseendet er gjenopprettet når fosteret er equilibrated med mediet. Videre, når fosteret er flyttet mellom økende tetthet Media, det har en tendens til å flytte til overflaten av Media på grunn av tetthet bevegelser. For å unngå embryo tap og sikre tidspunktet for vitrifikasjon, er det tilrådelig å utføre vitrifikasjon i små dråper av Media som vil holde fosteret på plass.

I konklusjonen, her vi beskriver både et et-teknikk og et embryo vitrifikasjon metode som letter fremtidige studier som bruker kaniner som modell. Basert på den nære Fylogenetiske avstanden mellom kaniner og mennesker, kan bruken av denne modellen gi resultater lett overførbar til menneskelig klinisk medisin. I tillegg tilbyr vår metode noen hygieniske og økonomiske fordeler, i samsvar med konseptet av de 3 RS av dyrevelferd (utskifting, reduksjon og raffinement), og samtidig opprettholde målet om å forbedre Human behandling av forsøksdyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av midler fra departementet for økonomi og konkurranseevne i Spania (AGL2017-85162-C2-1-R) og Generalitat Valenciana forskningsprogram (PrometeoII 2014/036). Engelsk tekstversjon revidert av N. Macowan engelsk språk service

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 332
Buprenorphine hydrochloride Alvet Escartí 626 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buserelin Acetate Sigma Aldrich B3303
Clorhexidine digluconate soap Alvet Escartí 0265DCCJ500B
Clorhexidine digluconate solution Alvet Escartí 0265DCCA500B
CO2 Air Liquide 99921 CO2 N48.
CO2 Incubator Fisher scientific 15385194
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich W387509
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) Sigma Aldrich D5773 Without calcium chloride.
Electric razor Oster Golden A5 078005-140-002
Endoscope camera Optomic Spain S.A OP-714
Endoscope trocar with silicone leaflet valve Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 30114GK Lightweight trocar model.
Enrofloxacin Alvet Escartí 9993046 To be ordered by a licensed veterinarian.
Epicraneal needle 23G Alvet Escartí 514056353 Smaller needles can be also used.
Epidural catheter Vygon corporate 187.10
Epidural needle Vygon corporate 187.10
Ethylene Glycol Sigma Aldrich 102466-M
Eye ointment Alvet Escartí 5273
Ketamine hydrochloride Alvet Escartí 184 To be ordered by a licensed veterinarian.
Laparoscopy equipment Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 26003 AA Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel.
Light source Optomic Spain S.A Fibrolux 250
Liquid Nitrogen Air Liquide P1505XXX
Mechanical CO2 insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. Endoflator®
Meloxicam Alvet Escartí 9993501 To be ordered by a licensed veterinarian.
Petri dishes, 35-mm Sigma Aldrich CLS430165-500EA
Plastic dressing (Nobecutan) IBOR medica 7140028
Plastic Straw 0.25 mL IMV - technologies 6431
Povidone iodide solution Alvet Escartí 02656DPYS500S
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
Silicone tube for insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 20400040
Stereomicroscope Leica MZ16F There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few.
Sterile Gloves Alvet Escartí 087GL010075
Sterile gown Alvet Escartí 12261501
Sterile mask Alvet Escartí 058B15924B
Straw Plug IMV - technologies 6431
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Syringe, 1-mL Fisher scientific 11750425
Syringe, 5-mL Fisher scientific 11773313
Urinary catheter IMV - technologies 17722
Waterbath RAYPA BAE-4
Xylazine Alvet Escartí 525225 To be ordered by a licensed veterinarian.
Rabbits Universitat Politècnica de València Line A Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (ART). Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8, (4), 388-402 (2017).
  2. Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo vitrification in rabbits: Consequences for progeny growth. Theriogenology. 84, (5), 674-680 (2015).
  3. Sirard, M. A. The influence of in vitro. fertilization and embryo culture on the embryo epigenetic constituents and the possible consequences in the bovine model. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8, (4), 411-417 (2017).
  4. Feuer, S. K., Rinaudo, P. F. Physiological, metabolic and transcriptional postnatal phenotypes of in vitro. fertilization (IVF) in the mouse. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8, (4), 403-410 (2017).
  5. Jiang, Z., et al. Genetic and epigenetic risks of assisted reproduction. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 44, 90-104 (2017).
  6. Fleming, T. P., Velazquez, M. A., Eckert, J. J. Embryos, DOHaD and David Barker. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 6, (5), 377-383 (2015).
  7. Sparks, A. E. Human embryo cryopreservation-methods, timing, and other considerations for optimizing an embryo cryopreservation program. Seminars in Reproductive Medicine. 33, (2), 128-144 (2015).
  8. Swain, J. E. Optimal human embryo culture. Seminars in Reproductive Medicine. 33, (2), 103-117 (2015).
  9. Heape, W. Preliminary note on the transplantation and growth of mammalian ova within a uterine foster-mother. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 48, 457-459 (1890).
  10. Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal embryo transfer and vasectomy in the mouse model. Journal of Visualized Experiments. (84), e51214 (2014).
  11. Kidder, J. D., Roberts, P. J., Simkin, M. E., Foote, R. H., Richmond, M. E. Nonsurgical collection and nonsurgical transfer of preimplantation embryos in the domestic rabbit (Oryctolagus cuniculus) and domestic ferret (Mustela putorius furo). Journal of Reproduction and Fertility. 116, (2), 235-242 (1999).
  12. Tıras, B., Cenksoy, P. O. Practice of embryo transfer: recommendations during and after. Seminars in Reproductive Medicine. 32, (4), 291-296 (2014).
  13. Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53, (3), 228-231 (2014).
  14. Moreno-Moya, J. M., et al. Complete method to obtain, culture, and transfer mouse blastocysts nonsurgically to study implantation and development. Fertility and Sterility. 101, (3), e13 (2014).
  15. Hasler, J. F. Forty years of embryo transfer in cattle: a review focusing on the journal Theriogenology, the growth of the industry in North America, and personal reminisces. Theriogenology. 81, (1), 152-169 (2014).
  16. Bauer, C. The baboon (Papio sp.) as a model for female reproduction studies. Contraception. 92, (2), 120-123 (2015).
  17. Martinez, E. A., et al. Nonsurgical deep uterine transfer of vitrified, in vivo-derived, porcine embryos is as effective as the default surgical approach. Science Reports. 5, 10587 (2015).
  18. Besenfelder, U., Brem, G. Laparoscopic embryo transfer in rabbits. Journal of Reproduction and Fertility. 99, 53-56 (1993).
  19. Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47, (5), 1051-1060 (1997).
  20. Besenfelder, U., Havlicek, V., Kuzmany, A., Brem, G. Endoscopic approaches to manage in vitro and in vivo embryo development: use of the bovine oviduct. Theriogenology. 73, (6), 768-776 (2010).
  21. Fonseca, J. F., et al. Nonsurgical embryo recovery and transfer in sheep and goats. Theriogenology. 86, (1), 144-151 (2016).
  22. Denker, H. W. Structural dynamics and function of early embryonic coats. Cells Tissues Organs. 166, 180-207 (2000).
  23. Marco-Jiménez, F., López-Bejar, M. Detection of glycosylated proteins in rabbit oviductal isthmus and uterine endometrium during early embryo development. Reproduction in Domestic Animals. 48, (6), 967-973 (2013).
  24. Ménézo, Y. J., Hérubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reproductive BioMedicine Online. 4, (2), 170-175 (2002).
  25. Fischer, B., Chavatte-Palmer, P., Viebahn, C., Navarrete Santos, A., Duranthon, V. Rabbit as a reproductive model for human health. Reproduction. 144, (1), 1-10 (2012).
  26. Besenfelder, U., Strouhal, C., Brem, G. A method for endoscopic embryo collection and transfer in the rabbit. Zentralbl Veterinarmed A. 45, (9), 577-579 (1998).
  27. Daniel, N., Renard, J. P. Embryo transfer in rabbits. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (1), (2010).
  28. Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters rabbit foetal placenta at transcriptomic and proteomic level. Reproduction. 147, (6), 789-801 (2014).
  29. Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. Biotechniques. 47, (5), 919-924 (2009).
  30. Duan, X., Li, Y., Di, K., Huang, Y., Li, X. A nonsurgical embryo transfer technique in mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 32, (4), 440-446 (2016).
  31. Denker, H. W., Gerdes, H. J. The dynamic structure of rabbit blastocyst coverings. I. Transformation during regular preimplantation development. Anatomy and Embryology. 157, 15-34 (1979).
  32. Seidel, G. E., Bowen, R. A., Kane, M. T. In vitro fertilization, culture and transfer of rabbit ova. Fertility and Sterility. 27, 861-870 (1976).
  33. Binkerd, P. E., Anderson, G. B. Transfer of cultured rabbit embryos. Gamete Research. 2, 65-73 (1979).
  34. Murakami, H., Imai, H. Successful implantation of in vitro cultured rabbit embryos after uterine transfer: a role for mucin. Molecular Reproduction and Development. 43, 167-170 (1996).
  35. Techakumphu, M., Wintenberger-Torrèsa, S., Sevelleca, C., Ménézo, Y. Survival of rabbit embryos after culture or culture/freezing. Animal Reproduction Science. 13, (3), 221-228 (1987).
  36. Gitzelmann, C. A., et al. Cell-mediated immune response is better preserved by laparoscopy than laparotomy. Surgery. 127, (1), 65-71 (2000).
  37. Huang, S. G., Li, Y. P., Zhang, Q., Redmond, H. P., Wang, J. H., Wang, J. Laparotomy and laparoscopy diversely affect macrophage-associated antimicrobial activity in a murine model. BMC Immunology. 14, 27 (2013).
  38. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Almela-Miralles, V., Vicente, J. S. Development of Cheaper Embryo Vitrification Device Using the Minimum Volume Method. Public Library of Science One. 11, (2), e0148661 (2016).
  39. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Generation of live offspring from vitrified embryos with synthetic polymers supercool X-1000 and Supercool Z-1000. CryoLetters. 35, 286-292 (2014).
  40. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Use of cyclodextrins to increase cytoplasmic cholesterol in rabbit embryos and their impact on live KITs derived from vitrified embryos. Cryoletters. 35, 320-326 (2014).
  41. Marco-Jiménez, F., Lavara, R., Jiménez-Trigos, E., Vicente, J. S. In vivo development of vitrified rabbit embryos: Effects of vitrification device, recipient genotype, and asynchrony. Theriogenology. 79, (7), 1124-1129 (2013).
  42. Vicente, J. S., et al. Rabbit morula vitrification reduces early foetal growth and increases losses throughout gestation. Cryobiology. 67, 321-326 (2013).
  43. Viudes-de-Castro, M. P., Marco-Jiménez, F., Cedano-Castro, J. I., Vicente, J. S. Effect of corifollitropin alfa supplemented with or without Lh on ovarian stimulation and embryo viability in rabbit. Theriogenology. 98, 68-74 (2017).
  44. Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters at transcriptomic and proteomic level rabbit foetal placenta. Reproduction. 147, 789-801 (2014).
  45. Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Lavara, R., Vicente, J. S. Direct comparison of the effects of slow freezing and vitrification on late blastocyst gene expression, development, implantation and offspring of rabbit morulae. Reproduction in Domestic Animals. 49, 505-511 (2014).
  46. Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Long-term and transgenerational effects of cryopreservation on rabbit embryos. Theriogenology. 81, 988-992 (2014).
  47. Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo transfer manipulation cause gene expression variation in blastocysts that disrupt implantation and offspring rates at birth in rabbit. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 207, 50-55 (2016).
  48. Roque, M., Valle, M., Kostolias, A., Sampaio, M., Geber, S. Freeze-all cycle in reproductive medicine: current perspectives. JBRA Assisted Reproduction. 21, (1), 49-53 (2017).
  49. Tsunoda, Y., Soma, T., Sugie, T. Effect of post-ovulatory age of recipient on survival of frozen-thawed rabbit morulae. Journal of Reproduction and Fertility. 65, (2), 483-487 (1982).
  50. Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17, (3), 744-751 (2002).
  51. Lavara, R., Baselga, M., Vicente, J. S. Does storage time in LN2 influence survival and pregnancy outcome of vitrified rabbit embryos? Theriogenology. 76, (4), 652-657 (2011).
Minimalt invasiv embryo Transfer og embryo vitrifikasjon på optimal embryo Stage i Rabbit Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).More

Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter