Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

En düşük Invaziv embriyo transferi ve tavşan modelinde optimum embriyo aşamasında embriyo vitrifikasyon

doi: 10.3791/58055 Published: May 16, 2019

Summary

Destekli üreme teknikleri (ARTs) sonuçları geliştirmek ve ilişkili riskleri azaltmak için sürekli değerlendirme içindedir. Bu yazıda, tavşanların insan üreme açısından ideal bir hayvan modeli olarak kullanımına izin veren, verimli bir ağoprezervasyon protokolüyle minimal invaziv bir embriyo transfer prosedürü açıklanmaktadır.

Abstract

İn vitro embriyo kültürü veya embriyo ağaloprezervasyon gibi destekli üreme teknikleri (ARTs), perinatal ve postnatal sonuçları ile doğal gelişim desenlerini etkiler. Sanat uygulamalarının zararsız olmasını sağlamak için hayvan modellerinde çalışmalar gereklidir. Buna ek olarak, son bir adım olarak, embriyo geliştirme çalışmaları tam vadeli sağlıklı yavru geliştirmek için kapasitelerinin değerlendirilmesi gerekir. Burada, rahim için embriyo transferi herhangi bir sanat ile ilgili deney gerçekleştirmek için vazgeçilmez.

Tavşan bir yüzyıl boyunca meme üreme çalışması için bir model organizma olarak kullanılmıştır. İnsan türü ve küçük boyutu ve düşük bakım maliyeti onun fitogenetik yakınlığı ek olarak, bu indüklenen yumurtlama gibi önemli üreme özelliklerine sahip, erken embriyonik gelişim bir kronolojisi insanlara benzer ve kısa bir gebelik bize kolayca ART uygulamasının sonuçlarını incelemek için izin. Dahası, sanat (örneğin intrakitoplazmik sperm enjeksiyonu, embriyo kültürü veya ağoprezervasyon) bu türe uygun verimlilik ile uygulanır.

Bu yazıda sunulan laparoskopik embriyo transfer tekniğinin ve ağoprezervasyon protokolünün kullanılması, 1) embriyoları kolay, minimal invazif bir teknik ve 2) tavşan uzun süreli depolanması için etkili bir protokol aracılığıyla nasıl aktarmayı tarif ediyoruz. embriyo zaman esnek lojistik kapasiteleri ve örnek taşıma yeteneği sağlamak için. Tavşan embriyoları farklı gelişimsel aşamalarında aktardıktan sonra elde edilen sonuçlar, Morula 'nın tavşan embriyo kurtarma ve transfer için ideal bir aşama olduğunu göstermektedir. Böylece, cerrahi prosedürü haklı olarak, bir oviduktal embriyo transferi gereklidir. Ayrıca, tavşan morulları başarıyla vitrifiye ve laparoskopik olarak aktarılan, açıklanan teknikleri etkinliğini kanıtlamak.

Introduction

İnsan infertilitesini atlayarak veya yüksek genetik değer ve hayvan genetik kaynaklarını koruyan Hayvancılık yaygınlaştırılması amaçlarıyla, teknik bir dizi topluca yardımcı üreme teknolojileri olarak adlandırılan, süperovülasyon gibi, içinde vitro fertilizasyon, embriyo kültürü veya ağoprezervasyon,1,2geliştirilmiştir. Şu anda, yumurtalıkları uyarmak ve çok sayıda antral ovaryalı folikülleri üretmek için hormonal tedaviler verilir1. Bu foliküllerden toplanan oositler olgunlaşabilir, döllenmiş ve in vitro olarak geliştirilmiştir ya kriokonservirovannogo ya da vekil annelere transfer edilinceye kadar3. Ancak, bu tedaviler sırasında, gamet ve zigotları bu koşullarda hayatta kalmak için embriyo adaptasyon gerektirebilir fizyolojik olmayan süreçler bir dizi maruz4,5. Bu adaptasyon erken embriyo plastisite nedeniyle mümkündür, hangi gen ifade ve gelişimsel programlama embriyo değişiklikleri sağlar6. Ancak, bu değişiklikler yetişkinliğe kadar embriyo gelişiminin sonraki aşamalarını etkileyebilir, ve şimdi yaygın olarak kabul edilir ki Yöntemler, zamanlama, ağkısızlık prosedürü veya kültür koşulları embriyo kaderi farklı sonuçlar göstermek7 , 8. bu nedenle, sanat spesifik indüklenen etkileri aydınlatmak, iyi karakterize hayvan modellerinin kullanımı kaçınılmazdır.

Meme embriyoları transferinden kaynaklanan ilk belgelenmiş canlı Doğum 1890 yılında gerçekleşti9. Bugün, bir vekil dişi embriyo transferi (ET) sonraki embriyo gelişimi aşamalarında Preimplantasyon sırasında sanat kaynaklı etkileri okuyan önemli bir adımdır10. ET teknikleri her hayvanın büyüklüğü ve anatomik yapısına bağlıdır. Büyük ölçekli hayvan modelleri durumunda, transservikal cerrahi dışı ET teknikleri ile ET gerçekleştirmek mümkün olmuştur, ancak daha küçük boyutlu türler serviks kateterizasyon daha karmaşık ve cerrahi teknikler sık kullanılan11. Ancak, cerrahi ET, implantasyon ve embriyo gelişimini zarar verebilecek kanama neden olabilir, kan uterus lümen istila edebilir gibi, embriyo ölümü10neden. Transservikal cerrahi dışı et teknikleri hala insanlarda, babunların, sığır, domuz ve fareler12,13,14,15,16,17, ancak cerrahi uygulanır Etler hala keçiler, koyun veya diğer hayvanlar gibi tür,10,18,19,20,21, tavşan gibi ek zorluklar mevcut kullanılmaktadır (iki bağımsız sertifikalar) veya fareler (küçük boyut). Yine de, cerrahi transfer yöntemleri giderek daha az invaziv yöntemler ile değiştirildi eğilimindedir. Embriyoları transfer etmek için endoskopi kullanıldı, örneğin, tavşan, domuz ve küçük ruminantlarda18,19,20. Bu minimal invaziv endoskopi yöntemleri embriyoları ampulla içine infundibulum üzerinden aktarmak için kullanılabilir, hangi tavşan önemlidir ve bazı türler yararlı etkileri göstermiştir20. Bu oviduct erken embriyo aşamalarında embriyo ve anne arasındaki doğru diyalog önemini dayanır. Yukarıda belirtildiği gibi, ovduct aracılığıyla embriyo göçü sırasında tavşanlar içinde yer alan embriyo remodeling,22,23implant edilebilir embriyolar elde etmek için esastır.

Büyük boyutlu hayvan modelleri, sığır gibi, biyokimyasal ve Preimplantasyon özellikleri insan türlerinin24benzer çünkü ilginç. Ancak, büyük hayvanlar ön denemeler kullanmak için çok pahalıdır, ve kemirgenler ideal bir model olarak kabul edilir (76% model organizmalar kemirgenler) laboratuar araştırması için25. Yine de, tavşan modeli üreme çalışmalarında kemirgenler üzerinde bazı avantajlar sağlar, insanlar tarafından sergilenen bazı üreme Biyolojik süreçler fareler bu daha tavşan benzer. İnsan ve tavşanlar benzer bir kronolojik embriyonik genom aktivasyonu, gastrülasyon ve hemochorial plasenta yapısını sunar. Buna ek olarak, tavşan kullanarak döllenme ve gebelik aşamalarında tam zamanlamasını bilmek mümkündür nedeniyle onların indüklenen yumurtlama25. Tavşan yaşam döngüleri kısa, 31 gün içinde gebelik tamamlama ve yaklaşık 4-5 ay içinde ergenliğe ulaşan; hayvan onun uysal ve agresif olmayan davranışları nedeniyle işlemek kolaydır, ve onun bakım büyük hayvanların pahasına kıyasla çok ekonomiktir. Ayrıca, tavşanların iki bağımsız serviks11,25ile Dubleks rahim var söz önemlidir. Bu, farklı deneysel grupların embriyoları aynı hayvana aktarılabilir, ancak farklı bir uterus boynuz içine, tercihli bir pozisyonda tavşan yerleştirir. Bu, hem deneysel etkileri karşılaştırmak için, sonuçları maternal faktörü azaltarak bize izin verir.

Günümüzde cerrahi olmayan ET yöntemleri tavşan içinde kullanımda değildir. 90 ' ların sonlarında bir transservikal et tekniği kullanılarak yürütülen bazı çalışmalar, cerrahi yöntemlerle% 5,5-20,0%11,26 VERSUS 50-65% arasında değişen düşük teslimat oranlarında sonuçlanan, bunların arasında laparoskopik prosedür Besenfelder ve Brem18. Tavşanların bu ameliyatsız ET yöntemlerinin düşük başarı oranları, transservikal ET 'te önlenmiş olan oviduct 'de gerekli embriyo remodeling eksikliği ile örtüşür. Burada, bir model organizma olarak tavşan kullanarak etkili bir minimal invaziv laparoskopik ET prosedürü tarif. Bu teknik, büyük hayvanların ve insanlarda daha fazla üreme araştırması için bir model sağlar.

Tavşanların embriyo implantasyonu için özellikle dar bir zaman penceresi olduğu için, bu türdeki ET, ET 'de embriyonun gelişimsel aşaması ile alıcı27' nin fizyolojik durumu arasında yüksek düzeyde senkron gerektirir. Bazı durumlarda, embriyo gelişimini yavaşlatan bir üreme tedavisinden sonra ( In vitro Culture gibi) veya endometrial reseptüsü (superovülasyon tedavileri gibi) değiştirir, embriyo ve maternal uterusun arasında senkron yoktur. Bu durumlar sonucu olumsuz etkileyebilir. Bu bağlamlarda yanıt vermek için, bizi duraklatmak, düzenlemek ve deneyler devam sağlayan etkili bir tavşan Morula vitrifikasyon Protokolü açıklanmaktadır. Bu süreç üreme çalışmaları için Lojistik olarak arzu edilir ve bize embriyoların uzun süreli depolanması için kapasite verir, onların taşıma izin. Laparoskopik prosedür ve ağoprezervasyon stratejileri daha az hayvan ile çalışmaların daha iyi planlamasına olanak sağlar. Böylece, metodolojimiz hijyen ve ekonomik avantajlar sunar ve deneysel hayvanların insan tedavisinin iyileştirilmesi amacı ile hayvan araştırmalarının 3Rs (yedek, azaltma ve arıtma) konseptine uygundur. Böylece, bu yöntemlerle, tavşan in vivo üreme amaçlı ideal bir model organizma oluşturmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışmada kullanılan tüm deneysel prosedürler, hayvan deneyleri için 2010/63/EU EEC Direktifi uyarınca yapılmıştır ve Universitat Politècnica de València hayvanlarıyla deneyler için Etik Komite tarafından incelenip onaylanmıştır. İspanya (araştırma kodu: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC ve JSV hayvanlar üzerinde deney için Valencian devlet idaresi tarafından verilen bir yetkilendirme belgesi tutar. XGD, deney sırasında hayvanların refahı ve bakımını denetlemek için yetkilidir.

1. embriyo transferi

  1. Alıcı kadınların hazırlanması
    1. Sadece cinsel Olgun kadın kullanın (> 4,5 ay).
    2. ET 'den bir hafta önce, kadınların foliküler büyüme ve geliştirilmiş kadın reseptifinin başlatılması için 16 h ışık/8 h karanlık rejime adapte edilmesi.
    3. Vulva 'nın türinliği ve rengini gözlemlemek için alıcı kadınları seçin. Vulva abartılı ve kırmızımsı ise, dişi çok anlayışlı.
    4. 1 μg buserelin asetat (gonadotropin-serbest hormon sentetik analog) ne olursa olsun vücut ağırlığı tek bir intramusküler enjeksiyon tarafından pseudohamilelik (yumurtlama) neden.
      Not: normal olarak, 0,8 μg orta boy tavşanlar (4-5 kg) yumurtlama indüksiyonu için uygun bir dozdur, bu nedenle 1 μg genellikle yumurtlama garantisi verir.
    5. Embriyolar yaşı olarak önceden (örneğin, taze Morula ET önce 70-72 h) transfer edilecek birçok gün olarak yumurtlama neden.
  2. Anestezi ve analjezi
    1. Tavşan tartmak ve aşağıdaki anestezik ve analjezikler yükleyin.
      1. 30G iğne ile 1 mL şırınga: yük xylazine (5mg/kg) ve buprenorfik hidroklorür (0,03 mg/kg). Bir başka 1 mL şırınga ile 23G Perikranial iğne, yük ketamin hidroklorür (35 mg/kg).
    2. Tavşan tutun ve xylazine-buprenorfik karışımı intramuscularly enjekte.
    3. Marjinal kulak damarında ketamin ile Perikranial iğne takın, yavaş yavaşça tüm şırınga içeriği intravenöz olarak tanıtmak.
    4. İğne düzeltmek ve gerekirse daha fazla anestezi yönetmek için kalan adımlar boyunca takılı bırakın.
    5. Sıcak bir aşamada (temiz ve başka hayvanlar olmadan) kafeste tavşan bırakın.
    6. Bir kez bilinçsiz, göz kuruluğu önlemek ve palpebral Freflex yokluğunda kontrol etmek için göz merhem uygulayın.
      Not: Bu protokol en az 30 dakika boyunca cerrahi anestezi uçağı sağlar. Daha uzun bir süre gerekiyorsa, 30 dakika sonra 1.2.1 'de açıklanan ketamin hidroklorür miktarının yarısında ek dozajlar enjekte.
    7. Pedallı refleks ve solunum hareketini kontrol ederek anestezi derinliğini izleyin. Solunum düzeninde düzensiz ve daha hızlı bir hızda yapılan değişiklikler, uygun anestezi düzleminin kaybını gösterir.
    8. Mukoza zarlarının rengini (gözler, dudaklar, vb.), solunum hızı (dakika başına 30-60 nefes), kalp hızı (dakika başına 120-325 Beats) ve rektal sıcaklığa (38-39,6 °c) izleyin.
    9. Transferden sekiz saat önce, ET süreci bitene kadar daha fazla bağırsak boyutunu ve etkinliğini önlemek için hayvanlardan yiyecek tutma. Suya ücretsiz erişim bırakın.
  3. Embriyo hazırlama
    1. Embriyo manipülasyon medyasını 25 °C ' ye ısıtın: Dulbecco 'nun fosfat-tamponlu tuzlu (DPBS) ' den oluşan temel Orta (BM), Sığır serum albumin% 0,2 (w/v) ile desteklenmektedir.
    2. Stereomikoskop altında çalışmak, taze veya çözülmüş (adım 2) embriyoları BM ile durulayın.
    3. Steril eldiven kullanarak, 1 mL şırıngaya uygun şekilde yapılandırılmış 17G epidural kateter takın.
    4. Kateter içine 1 cm BM aspirate, küçük bir hava balonu izledi.
    5. 10 μL BM hacmi içinde 5-7embriyo aspirate, başka bir küçük hava balonu izledi.
    6. 1 cm BM aspirasyon ile kateteri yüklemeyi tamamlayın.
  4. Embriyo transferi
    1. Aseptik bir ortam sağlamak için steril eldiven, elbise ve maske kullanımını düşünün.
    2. Cerrahi aletleri sterilize edin, ameliyatın gerçekleştirileceği yüzeyleri temizleyin ve% 70 etanol ile silin.
    3. Daha önce ayrıntılı olarak anestezi gerçekleştirin (adım 1,2), refleksleri kaybı kontrol.
    4. Bir elektrikli jilet ile ventral karın kürk tıraş.
    5. Ventral karın aseptically hazırlayın.
      1. Cerrahi alanı temizleyin ve kalan saçları çıkarın. Cerrahi bölgeyi bir klorhekidin glukonat sabunuyla yıkayın. Klorheksisin çözeltisi ve etanol 96 º (3 kez) ile alanı sanitize.
    6. Mide ve bağırsak kranikal bulunduğundan emin olmak için Trendelenburg pozisyonu (45 ° aşağı baş), sıcak bir cerrahi masaya hayvan yerleştirin. Eğer turgid ise mesane tahliyesini düşünün. Eğer bu süreçte herhangi bir iç organlar zarar görürse, hayvan ölebilir. Bu nedenle, düzgün bir şekilde bulunabilmesi önemlidir (Şekil 1).
    7. Steril bir havlu kullanarak alanı koruyun, bir delik ile (fenestrasyon) tıraş alanı açığa, herhangi bir potansiyel kontamine alanlardan cerrahi site ayırmak için.
    8. Karın boşluğuna bir endoskopik trokar 5 cm, ksifoid sürecine 2 cm kaudal ve basınç düzenleyen mekanik bir yetersiz periton boşluğu ile üflemek yerleştirin.
      Not: abdominal basınç, CO2 (Şekil 1a) ile 8-12 mmHg olmalıdır.
    9. Endoskopik trokar (Şekil 1B) ile endoskop Kamerayı takın.
      Not: bir sonraki adımları kolaylaştırmak için ET önce infundibulum ve ampulla durumunu ve konumunu belirlemek, üreme yolu belirleyin.
    10. 17-G Epidural İğne infundibulum 2-3 cm arasında inguinal bölgeye yerleştirin (Şekil 1B).
    11. İnfundibulumun girişini belirleyin (Şekil 2a, 2B).
    12. Yüklü kateter (adım 1,3), epidural iğne ile karın içine yerleştirin (Şekil 1C).
    13. Ovası bulun ve ampulla infundibulum aracılığıyla epidural kateter 1-2 cm yerleştirin (Şekil 2a-2C). Hasar ve hemoraj önlemek için ovidukt çok uzağa ilerleme yok.
    14. Embriyoları, kateter (Şekil 2D-2F) ile birleştirilerek şırınga pistonu hafifçe basarak ovidukt 'a bırakın. Her iki hava kabarcığı kateter çıkmak gerekir.
    15. Embriyoların serbest bırakıldıktan hemen sonra kateteri çıkarın.
    16. Embriyoların yokluğunda kontrol etmek ve başarılı transferini onaylamak için kateter, aspirasyon ve serbest bırakma ortamını durulayın.
    17. Eğer istenirse uterusun diğer tarafında 1.4.16 için 1.4.11 adımları yineleyin.
    18. Epidural İğne ve endoskop kamerayı çıkarın.
    19. CO2 ' ye endoskopik Trocar ile yayın yapın. Hayvan karın içinde aşırı gaz kalırsa, ağrı ve rahatsızlık olacaktır.
    20. Endoskopik trokar Karın boşluğundan çıkarın. Cerrahi havluyu çıkarın.
    21. Anestezi durdurma.
    22. Klorhekidin çözeltisi ile trokar tarafından yapılan kesi temizleyin. Mikronize alüminyum ve plastik soyunma ile trokar tarafından yapılan kesi kapatın.
  5. Postoperatif bakım
    1. Hayvanların antibiyotikler ile tedavi: 10 mg/kg enroflokacin, subkutan, her 24-h için 5 gün.
    2. Analjezikler yönetin: buprenorfik hidroklorür (0,03 mg/kg), İntramüsküler, her 12 saat 3 gün; Meloxicam (0,2 mg/kg), subkutan, her 24-h 3 gün.
    3. Ameliyat sonrası en az 30 dakika boyunca hayvanları izleyin (hayvan ve kullanılan anestezi dozuna bağlı olarak) fizyolojik koşullarını kurtarırlar.
    4. Alıcıyı (ör. kulak dövmesi) ve ev hayvanlarını uygun çevresel şartla temiz bir kafeste tanımlayın.

Figure 1
Şekil 1: Laparoskopi (dış görünüm) yardımıyla laparoskopik embriyo transferi. A) endoskopik troaraba (bir liman) eklenmesi. B) endoskopik kamera ve Epidural İğne (siyah ok) ekleme. C) embriyo transfer kateteri (beyaz ok) Epidural İğne yoluyla ekleme. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: Laparoskopi (iç görünüm) yardımıyla laparoskopik embriyo transferi. A: Kateterin Epidural İğne yoluyla karın bölgesine yerleştirilmesi. Asterisk infundibulum gösterir. B, C, D: Embriyolar ile yüklenen kateter infundibulum genelinde ampulla bölgesine eklenir. E, F: Embriyolar serbest, şişmiş bir oviduct görselleştirme tarafından teyit. Bu rakam Marco-Jiménez et al 'dan uyarlanmıştır. 38. lütfen buraya tıklayın Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için .

2. embriyo vitrifikasyon ve ısınma

  1. Sıcak sıcaklıklarda vitrifikasyon çözeltisi toksisitesi azaltmak için oda sıcaklığında (yaklaşık 22 °C) tüm manipülasyon gerçekleştirin.
    Not: embriyolar Bu protokolde 0.1-2 μL otomatik pipet kullanılarak taşınabilir, ancak embriyoları en düşük hacmi sürükleyerek taşımak için diğer benzer aygıtlar uygun olabilir.
  2. Embriyoları iki adımlı ek prosedürde vitrify:
    1. Embriyoları, BM 'de çözünen% 10 (v/v) Etilen glikol ve% 10 (v/v) dimetil sülfoxid olan dengeleyici solüsyonda 2 dakika boyunca yerleştirin.
    2. Embriyoları (adım 2.2.1) 1 dakika boyunca, BM 'de çözünen% 20 (v/v) Etilen glikol ve% 20 (v/v) dimetil sülfoxid içeren vitrifikasyon çözüme taşıyın.
  3. Embriyoları bir 125 μL plastik ministraw içine yükleyin (bir pamuklu fiş ile bir kapalı uç ve bir açık aşırı içerir). İşlem Şekil 3' te şemalandırılır.
    1. 0,125 ' in kapalı ucunu, uygun mikrodispenseri (örn®.
    2. Küçük bir hava balonu tarafından aşağıdaki 1/3 kadar saman uzunluğu, aspirate BM.
    3. 40 μL vitrifikasyon solüsyonunun bir hacminde embriyo aspirate, başka bir küçük hava balonu izledi.
    4. İlk sıvı fraksiyonu (adım 2.3.2) pamuk ulaşır kadar BM aspirate.
    5. Açık ucunu bir saman fişi ile kapatın.
  4. Adım 2.2.2, embriyolar için toksik olacak bir dakikadan fazla sona ermeden emin olmak için 2,3 sırasında yapılır.
  5. Vitrifikasyon elde etmek için doğrudan sıvı azot içine ministraw Dalma.
  6. İstediğiniz zaman için azot için bir Dewar ministraw saklayın.
  7. Embriyoları tek bir adımda çözün.
    1. 20-30 s için sıvı azot buharı 10 cm yatay olarak ministraw yerleştirin.
    2. Kristalizasyon süreci ministraw içinde başladığında, 10-15 s için 25 °C ' de bir su banyosuna ministraw batırın.
    3. Ministraw fişini çıkarın ve pamuk fişini kesiniz.
    4. Birleştirilmiş bir mikrodispenseri ile tüm ministraw içeriğini 5 dakika boyunca BM 'de 25 °C ' de 0,33 M sakaroz çözeltisi içeren bir plakaya atın.
      Not: Bu adım, vitrifikasyon çözeltisi embriyo pozlama azaltmak için hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
    5. Embriyoları başka bir 5 dakika için BM çözümünü içeren yeni bir plakaya taşıyın.
    6. ET ile devam etmek için sadece hasarlı embriyo (bozulmamış mukin ceket ve zona pellucida ile) düşünün.
      Not: çözülür embriyolar, asenkron transferler (örn., morula transferleri 60-62 h) embriyo ve maternal endometrium arasında bir yeniden senkronizasyon sağlayarak sonuçları artırabilir dikkate alın.

Figure 3
Şekil 3: doğru yüklenmiş saman şeması. A) BM, vitrifikasyon sırasında kullanılan embriyo manipülasyon medyasını ifade eder. Embriyo vitrifikasyon çözüm yüklü olmalıdır. B) yüklenmemiş saman, embriyo konumunun büyütülmüş detay ile makroskopik görünümü. Bu büyük hacimli cihaz, minimum hacim cihazlarından farklı olarak, çok sayıda embriyoya vitriks yapmanızı sağlar. Ayrıca, bu cihazın işlenmesi en az hacim cihazları ile karşılaştırıldığında daha kolaydır, sonuçlar tavşan41benzer iken. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Minimal invaziv laparoskopi taze veya vitrifiye embriyolar taşıma üreme çalışmaları için en iyi model hayvanlar arasında tavşan yerleştirir. Tablo 1 farklı gelişim AŞAMALARıNDA taze et sonuçlarını gösterir (Şekil 4) aktarılan embriyo. Doğumda hayatta kalma oranı (bir yavru ile sonuçlanan embriyo yüzdesi) Bu yazıda açıklanan laparoskopik tekniğin etkinliğini kanıtladı. Daha yüksek değerler, ET, Morula aşamasında embriyolar ile erken veya kompakt morulae yapıldığında elde edilmiştir. Bu sonuçlara dayanarak, bu embriyoların vitrifikasyonu sonrasında hayatta kalma oranını göstermek için ikinci bir deney gerçekleştirdik. Böylece, Tablo 2 biz, aynı zamanda kurtarılan vitrifiye tavşan Morula aktardıktan sonra elde edilen sonuçları göstermek, sıkıştırma ya da iyi bir dereceye ulaşmıştır Bu embriyo arasında ayrım. Doğum hayatta kalma oranı farklı embriyo aşamaları arasında farklı, sıkıştırılmış morulae daha yüksek olmak. Bu nedenle, laparoskopik embriyo transferi tavşan taze ve vitrifiye embriyoları aktarmak için güvenilir bir tekniktir

Figure 4
Şekil 4: tavşan embriyo. A) pronükleer. B) sekiz hücre. C) erken Morula. D) kompakt Morula. E) blastosist. Asterisk iki pronuclei gösterir. Siyah oklar zona pellucida gösterir. Beyaz oklar genellikle embriyolar arasında değişen mukin ceket, gösterir. ICM: Iç hücre Mass. TE: Troectoderm. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Gelişimsel aşama1 Embriyo Alıcı Transfer yeri Gebelik oranı (%) İmplantasyon oranı (%) Doğum hayatta kalma oranı (%)2
Pronüklear 78 7 Ovidukt 7 (100) 50 (64,0)b 34 (43,6)b
8 hücre 81 7 Ovidukt 7 (100) 60 (74,1)b 53 (65,4)a
Erken Morula 81 7 Ovidukt 7 (100) 80 (98,8)a 60 (74,1)a
Kompakt Morula 80 7 Ovidukt 7 (100) 80 (100)a 58 (72,5)a
Blastosist 80 7 Rahim 7 (100) 73 (91,3)a 38 (47,5)b

Tablo 1. Laparoskopi ile taze tavşan embriyo transferi (In vivo türetilen) verimliliği. 1farklı embriyo 18-20h (pronükleer), 36-38h (8 hücre), 60-62 h (erken morula), 70-72 h (kompakt Morula) ve 80-82 h (blastosist) olarak Çiftleştikten sonra kurtarıldı. Compact (> 32 hücre) ve kompakt olmayan Morula (≈ 32 hücreler) 70-72 h 'de kurulabilir, ancak sadece kompakt morulalar aktarılmıştır. 2 Doğum Sağkalım oranı hamile alıcıdan yapar. a, b Farklı üst simgeler ile değerler istatistiksel olarak farklıdır (P < 0.001).

Gelişimsel aşama Aktarılan embriyo Alıcı Gebelik oranı (%) Doğum hayatta kalma oranı (%)1
Sıkıştırılmış olmayan 135 10 9 (90) 62 (45,9)b
Sıkıştırılmış 150 10 10 (100,0) 98 (65,3)a
Toplam 285 20 19 (95) 160 (56,1)

Tablo 2. Kompaktsız ve kompakt vitrifiye edilmiş Morula. a, bdeğerleri farklı üst simgeler ile istatistiksel olarak farklıdır (P < 0.001). 1 Doğum Sağkalım oranı hamile alıcıdan yapar. Embriyolar aynı zamanda (70-72 h) kurtarıldı ve kompakt (> 32 hücre) ve kompakt olmayan Morula (≈ 32 hücreler) olarak ayırt edildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Transfer edilen embriyolar9' dan ilk belgelenmiş canlı Doğum vakası beri, bu teknik ve tavşan türleri üreme çalışmalarında çok önemli hale gelmiştir. Ayrıca, manipülasyon, üretim, ağoprezervasyon vb. içeren embriyo araştırma çalışmaları, son bir adım olarak embriyo kapasitesinin değerlendirilmesi için sağlıklı tam vadeli yavru üretmek gerektirir. Bu nedenle embriyo transfer tekniği13,28. Yıllarca embriyoları maternal uterusa aktarmak için kullanılan cerrahi yöntemler, tür13,14,15, büyük çoğunluğu daha az invaziv yöntemler ile giderek değiştirildi 21 , 27 , 29 , 30. ancak, tavşanlar içinde, erken embriyo gelişimi ve in vitro üretilen embriyolar INTRAOVIDUCTAL et doğal koşullara benzer bir sonuç sağlamak için kaçınılmaz hale gelir. Tavşanlar içinde, intraoviduktal mukin kat embriyo implantasyon sağlayan önemli bir faktördür, uterus boynuzları Blastokist genişleme sırasında embriyonik kaplamaların yeniden modelleme sonra gerçekleşir gibi. Ancak, mukin ceket biriktirme ovasyon takip 3 gün boyunca ovidukt ile sınırlıdır, ve kat malzemesi birikimi moleküler mekanizmaları büyük ölçüde bilinmiyor31. Bu nedenlerle, içinde vitro-geliştirilen blastoslerin rahim32,33,34ve embriyolar hasarlı mukin ceket ile transfer edildiğinde hayatta değildi bilinmektedir daha düşük bir hayatta kalma oranı var 35. benzer şekilde, tavşanlar bir transservikal embriyo transferi rapor gruplar çok düşük canlı doğmuş oranları sonuçlandı11,26. Burada, Besenfelder ve Brem18' den uyarlanan minimal invazif bir teknik sunuyoruz, embriyoları başarılı Doğum oranlarına aktarmak için. Tablo 1sonuçlarına göre, tavşan embriyoları Morula aşaması Doğum yüksek hayatta kalma oranı elde etmek için en iyi embriyonik aşamasıdır. Olası bir açıklama, en erken aşamaların manipülasyon için daha büyük hassasiyettir. İlginçtir ki, embriyonik aşama ilerledikçe başarı oranı artar, muhtemelen embriyonun iyileşmesi için önce oviduktal salgıları için daha fazla maruz kalma nedeniyle. Ama embriyolar blastosist aşamaya ulaştığında ve uterusa aktarılan bir yer-uyumlu olduğunda, değerler büyük ölçüde azalır. Ne söyleniyor hariç değil, olası bir açıklama embriyoların ovidukt transfer embriyo manipülasyon sırasında mukin katmanında oluşturulan olası hasar geri yükleyebilirsiniz olabilir. Bu nedenle, uterusun içine aktarılan blastositler, implantasyon kapasitesini tehlikeye atabilecek bu mekanizmadan yoksun bırakılacaktır.

Teknik, hafif, kısa manipülasyon ile tek bir bağlantı noktası enstrüman (5 mm endoskop Trocar) kullanılarak gerçekleştirilir. Bu nedenle, the5-mm endoskop troaraba kesi kapatılması gerektirmez. Laparoskopik teknik faydaları postoperatif ağrı, normal aktivite daha hızlı dönüş ve daha az postoperatif komplikasyonlar içerir. Buna ek olarak, endoskopik prosedürler daha az karın yapışmasına neden olur ve açık cerrahi ile karşılaştırıldığında alıcı tarafından daha iyi bir bağışıklık tepkisi sağlar21,36,37. Laboratuvarımızın kanıt birikmesini tavşan modelinde bu ET prosedürün etkinliğini göstermiştir. Bu nedenle, son beş yıl içinde toplam 3.909 embriyo (1.335 taze ve 2.574 vitrifiye embriyoları) mevcut yazıda açıklanan prosedür aracılığıyla transfer edildi. Bu tekniğin bir sonucu olarak, taze ve vitrifiye transfer embriyoları yavru oranları sırasıyla38,39,40,41,42, % 62,9 ve% 42,5 idi 43 , 44 , 45 , 46 , 47. birçok çalışmalar bu tekniğe dayanmaktadır: Marco-Jiménez ve al. 38 , 39 , 40 , 41, Vicente ve al. 42, viudes-de-Castro et al. 43, Saenz-de-juano ve ark. 44 , 45 , 47, LAVARA et al. 46.

Bu tekniği yürütmek için pratik öneriler aşağıda açıklanmıştır. Embriyo Kültürü deneylerinde, aynı zamanda, embriyo transferi için yeni bir kateter kullanmak yerine Kültür Medya ve manipülasyon medya arasında embriyoları taşımak için kullanılır. Bu, maden yağı transferini önler ve optimum akış sağlar. ET sırasında üreme sisteminin işlenmesi en aza indirmek için önemlidir, ovidukt aşırı manipülasyon yapışmalara neden olabilir gibi. Eğer ovidukt bükülmüş ise, embriyoları içeren ve mekanik manipülasyon kaybına neden olabilir, doğru konumlandırmak için, kateter değil, epidural şırınga istihdam. Kateter oviduct geçtikten sonra, kolayca kaydırıyor. Değilse, kateter sapmış olabilir. Bir kez oviduct içinde, Eğer medya akmaz, biraz dışarı kateter hareket ve tekrar yeniden eklemek için deneyin. Hala akmaz, kateter tıkanmış. Onu ovidukt 'den çıkarın ve içeriği temiz bir ortama sahip bir çanak haline bırakın. Daha sonra, embriyoları başka bir kateter içine yeniden takın ve tekrar ovidukt içine yeniden takmak için deneyin. Teslimat genellikle Morula transferinden sonra 28-30 gün yer alır.

Buna ek olarak, embriyo gelişimsel aşaması pseudogebe kadınlarda uterus ortamından daha gelişmiş olabilir gösteren kanıtlar vardır, ama tam tersi. Özellikle, embriyo olumlu rahim ortamı için beklemek yeteneğine sahip, ancak rahim ortamı implantasyon için doğru aşamada embriyolar için bekleyemezsiniz10. Vitrifiye edilen embriyolar ile ilgili olarak, kısa/uzun süreli depolama sonrasında, embriyonun gelişimsel aşamasını ilgili olumlu rahim ortamı ile senkronize etmek mümkündür. Ayrıca, Eğer embriyo donör de embriyo alıcı ise, endometrium üzerinde superovülasyon zararlı etkileri vitrifikasyon tekniği kullanılarak atılabilir ve bir sonraki döngüsü48embriyolar transfer. Tavşanlar, vitrifiye embriyoların yumurtlamak 60-62 h önceden (asynchrony) indüklenen alıcıların oviduct içine transfer yüksek verimli bir tekniktir44,49. Bununla ilgili olarak, 10-12 h sırasında oviductal embriyo geçişi Hücre fizyolojisi ve ölü hücrelerin değiştirilmesi restorasyonunda yararlı etkileri açıklayabilir, ve muhtemelen embriyo sırasında mukin ceket indüklenen hasar onarmak tavsiye edilmiştir Manipülasyon. Ayrıca, vitrifiye embriyolar, depolama sırasında metabolik olarak askıya alındıkları için gelişmede bir gecikme sunar. Bu nedenle, kriokonservirovannogo embriyo asenkron alıcılar içine transfer embriyonun metabolik etkinliğini yeniden etkinleştirmek için izin verir ve böylece gelişim embriyo aşaması rahim ortamı ile senkronize edilir. Bunun yerine, kriokonservirovannogo embriyolar senkron reseptörlere aktarılırsa, anne ve embriyo arasındaki çapraz konuşma başarılı bir gebeliğin başlangıcını engeller. Tavşan, intraoviduktal transfer sonrası Morula49en yüksek hayatta kalma oranı elde edilmiştir. Verilerimiz Bu rapor ile uyumludur, ancak Morula aşaması 70-72 h (Tablo 2) ' de sıkıştırma derecesine bağlı olarak ağoprezervasyon sonrasında farklı hayatta kalma oranlarını sergiler. Burada, sıkıştırılmış Morula, gelişimin her aşamasının kriyokoruyucular ve geçirgen nüfuz göre kendi mekanizması olduğunu gösteren önceki raporlarla uyumlu olduğu olmayan sıkıştırılmış Morula, karşılaştırıldığında Doğum yüksek hayatta kalma oranları gösterdi 50kriyoprezervasyonu çözeltisi ilavesi sırasında dehidrasyon kapsamı. Bu tekniklerin altta yatan, vitrifikasyon ve intraoviductal Embriyo transferinin bir kombinasyonunun, sıvı nitrojen içinde 15 yıllık depolama sonrası tavşan nüfusunu yeniden kurmak için başarılı bir strateji olduğunu, onların çözülme sonrası hayatta kalma ve canlı Doğum51.

Bu tekniği başarıyla gerçekleştirmek için aşağıdaki Ayrıntılar dikkate alınmalıdır. Vitrifikasyon için kullanılan ardışık ortamların artan yoğunluğunun (dpbs, dengelemesinden solüsyonu, vitrifikasyon çözeltisi) Progressive embriyo dehidrasyon nedeniyle embriyo kasılmasının neden olabileceğini akılda bulundurmak önemlidir. Ancak, embriyo orta ile dengelenmiş olduğunda normal görünümü kurtarılır. Ayrıca, embriyo artan yoğunluk medya arasında taşındığında, yoğunluk hareketleri nedeniyle medyanın yüzeyine hareket eğilimindedir. Embriyo kaybını önlemek ve vitrifikasyon süresini sağlamak için, bu embriyo yerinde tutacak medyanın küçük damla vitrifikasyon gerçekleştirmek için tavsiye edilir.

Sonuç olarak, burada hem bir ET tekniği hem de bir model olarak tavşan kullanan gelecekteki çalışmaları kolaylaştıran bir embriyo vitrifikasyon yöntemi açıklanmaktadır. Tavşan ve insanlar arasındaki yakın fitogenetik mesafeye dayanarak, bu modelin kullanımı kolayca insan klinik tıbbı devredilebilir sonuçlar sağlayabilir. Buna ek olarak, bizim Yöntem, deneysel hayvanların insani tedavi iyileştirilmesi hedefini korurken, hayvan refahı (değiştirme, azaltma ve arıtma) 3 RS konseptine uygun, bazı hijyenik ve ekonomik avantajlar sunar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Ekonomi Bakanlığı ve Ispanya 'nın rekabet gücü (AGL2017-85162-C2-1-R) ve Generalitat Valenciana araştırma programı (PrometeoII 2014/036) fonları tarafından destekleniyordu. N. Macowan Ingilizce dil hizmeti tarafından revize İngilizce metin sürümü

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 332
Buprenorphine hydrochloride Alvet Escartí 626 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buserelin Acetate Sigma Aldrich B3303
Clorhexidine digluconate soap Alvet Escartí 0265DCCJ500B
Clorhexidine digluconate solution Alvet Escartí 0265DCCA500B
CO2 Air Liquide 99921 CO2 N48.
CO2 Incubator Fisher scientific 15385194
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich W387509
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) Sigma Aldrich D5773 Without calcium chloride.
Electric razor Oster Golden A5 078005-140-002
Endoscope camera Optomic Spain S.A OP-714
Endoscope trocar with silicone leaflet valve Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 30114GK Lightweight trocar model.
Enrofloxacin Alvet Escartí 9993046 To be ordered by a licensed veterinarian.
Epicraneal needle 23G Alvet Escartí 514056353 Smaller needles can be also used.
Epidural catheter Vygon corporate 187.10
Epidural needle Vygon corporate 187.10
Ethylene Glycol Sigma Aldrich 102466-M
Eye ointment Alvet Escartí 5273
Ketamine hydrochloride Alvet Escartí 184 To be ordered by a licensed veterinarian.
Laparoscopy equipment Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 26003 AA Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel.
Light source Optomic Spain S.A Fibrolux 250
Liquid Nitrogen Air Liquide P1505XXX
Mechanical CO2 insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. Endoflator®
Meloxicam Alvet Escartí 9993501 To be ordered by a licensed veterinarian.
Petri dishes, 35-mm Sigma Aldrich CLS430165-500EA
Plastic dressing (Nobecutan) IBOR medica 7140028
Plastic Straw 0.25 mL IMV - technologies 6431
Povidone iodide solution Alvet Escartí 02656DPYS500S
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
Silicone tube for insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 20400040
Stereomicroscope Leica MZ16F There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few.
Sterile Gloves Alvet Escartí 087GL010075
Sterile gown Alvet Escartí 12261501
Sterile mask Alvet Escartí 058B15924B
Straw Plug IMV - technologies 6431
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Syringe, 1-mL Fisher scientific 11750425
Syringe, 5-mL Fisher scientific 11773313
Urinary catheter IMV - technologies 17722
Waterbath RAYPA BAE-4
Xylazine Alvet Escartí 525225 To be ordered by a licensed veterinarian.
Rabbits Universitat Politècnica de València Line A Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (ART). Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8, (4), 388-402 (2017).
  2. Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo vitrification in rabbits: Consequences for progeny growth. Theriogenology. 84, (5), 674-680 (2015).
  3. Sirard, M. A. The influence of in vitro. fertilization and embryo culture on the embryo epigenetic constituents and the possible consequences in the bovine model. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8, (4), 411-417 (2017).
  4. Feuer, S. K., Rinaudo, P. F. Physiological, metabolic and transcriptional postnatal phenotypes of in vitro. fertilization (IVF) in the mouse. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8, (4), 403-410 (2017).
  5. Jiang, Z., et al. Genetic and epigenetic risks of assisted reproduction. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 44, 90-104 (2017).
  6. Fleming, T. P., Velazquez, M. A., Eckert, J. J. Embryos, DOHaD and David Barker. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 6, (5), 377-383 (2015).
  7. Sparks, A. E. Human embryo cryopreservation-methods, timing, and other considerations for optimizing an embryo cryopreservation program. Seminars in Reproductive Medicine. 33, (2), 128-144 (2015).
  8. Swain, J. E. Optimal human embryo culture. Seminars in Reproductive Medicine. 33, (2), 103-117 (2015).
  9. Heape, W. Preliminary note on the transplantation and growth of mammalian ova within a uterine foster-mother. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 48, 457-459 (1890).
  10. Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal embryo transfer and vasectomy in the mouse model. Journal of Visualized Experiments. (84), e51214 (2014).
  11. Kidder, J. D., Roberts, P. J., Simkin, M. E., Foote, R. H., Richmond, M. E. Nonsurgical collection and nonsurgical transfer of preimplantation embryos in the domestic rabbit (Oryctolagus cuniculus) and domestic ferret (Mustela putorius furo). Journal of Reproduction and Fertility. 116, (2), 235-242 (1999).
  12. Tıras, B., Cenksoy, P. O. Practice of embryo transfer: recommendations during and after. Seminars in Reproductive Medicine. 32, (4), 291-296 (2014).
  13. Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53, (3), 228-231 (2014).
  14. Moreno-Moya, J. M., et al. Complete method to obtain, culture, and transfer mouse blastocysts nonsurgically to study implantation and development. Fertility and Sterility. 101, (3), e13 (2014).
  15. Hasler, J. F. Forty years of embryo transfer in cattle: a review focusing on the journal Theriogenology, the growth of the industry in North America, and personal reminisces. Theriogenology. 81, (1), 152-169 (2014).
  16. Bauer, C. The baboon (Papio sp.) as a model for female reproduction studies. Contraception. 92, (2), 120-123 (2015).
  17. Martinez, E. A., et al. Nonsurgical deep uterine transfer of vitrified, in vivo-derived, porcine embryos is as effective as the default surgical approach. Science Reports. 5, 10587 (2015).
  18. Besenfelder, U., Brem, G. Laparoscopic embryo transfer in rabbits. Journal of Reproduction and Fertility. 99, 53-56 (1993).
  19. Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47, (5), 1051-1060 (1997).
  20. Besenfelder, U., Havlicek, V., Kuzmany, A., Brem, G. Endoscopic approaches to manage in vitro and in vivo embryo development: use of the bovine oviduct. Theriogenology. 73, (6), 768-776 (2010).
  21. Fonseca, J. F., et al. Nonsurgical embryo recovery and transfer in sheep and goats. Theriogenology. 86, (1), 144-151 (2016).
  22. Denker, H. W. Structural dynamics and function of early embryonic coats. Cells Tissues Organs. 166, 180-207 (2000).
  23. Marco-Jiménez, F., López-Bejar, M. Detection of glycosylated proteins in rabbit oviductal isthmus and uterine endometrium during early embryo development. Reproduction in Domestic Animals. 48, (6), 967-973 (2013).
  24. Ménézo, Y. J., Hérubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reproductive BioMedicine Online. 4, (2), 170-175 (2002).
  25. Fischer, B., Chavatte-Palmer, P., Viebahn, C., Navarrete Santos, A., Duranthon, V. Rabbit as a reproductive model for human health. Reproduction. 144, (1), 1-10 (2012).
  26. Besenfelder, U., Strouhal, C., Brem, G. A method for endoscopic embryo collection and transfer in the rabbit. Zentralbl Veterinarmed A. 45, (9), 577-579 (1998).
  27. Daniel, N., Renard, J. P. Embryo transfer in rabbits. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (1), (2010).
  28. Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters rabbit foetal placenta at transcriptomic and proteomic level. Reproduction. 147, (6), 789-801 (2014).
  29. Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. Biotechniques. 47, (5), 919-924 (2009).
  30. Duan, X., Li, Y., Di, K., Huang, Y., Li, X. A nonsurgical embryo transfer technique in mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 32, (4), 440-446 (2016).
  31. Denker, H. W., Gerdes, H. J. The dynamic structure of rabbit blastocyst coverings. I. Transformation during regular preimplantation development. Anatomy and Embryology. 157, 15-34 (1979).
  32. Seidel, G. E., Bowen, R. A., Kane, M. T. In vitro fertilization, culture and transfer of rabbit ova. Fertility and Sterility. 27, 861-870 (1976).
  33. Binkerd, P. E., Anderson, G. B. Transfer of cultured rabbit embryos. Gamete Research. 2, 65-73 (1979).
  34. Murakami, H., Imai, H. Successful implantation of in vitro cultured rabbit embryos after uterine transfer: a role for mucin. Molecular Reproduction and Development. 43, 167-170 (1996).
  35. Techakumphu, M., Wintenberger-Torrèsa, S., Sevelleca, C., Ménézo, Y. Survival of rabbit embryos after culture or culture/freezing. Animal Reproduction Science. 13, (3), 221-228 (1987).
  36. Gitzelmann, C. A., et al. Cell-mediated immune response is better preserved by laparoscopy than laparotomy. Surgery. 127, (1), 65-71 (2000).
  37. Huang, S. G., Li, Y. P., Zhang, Q., Redmond, H. P., Wang, J. H., Wang, J. Laparotomy and laparoscopy diversely affect macrophage-associated antimicrobial activity in a murine model. BMC Immunology. 14, 27 (2013).
  38. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Almela-Miralles, V., Vicente, J. S. Development of Cheaper Embryo Vitrification Device Using the Minimum Volume Method. Public Library of Science One. 11, (2), e0148661 (2016).
  39. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Generation of live offspring from vitrified embryos with synthetic polymers supercool X-1000 and Supercool Z-1000. CryoLetters. 35, 286-292 (2014).
  40. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Use of cyclodextrins to increase cytoplasmic cholesterol in rabbit embryos and their impact on live KITs derived from vitrified embryos. Cryoletters. 35, 320-326 (2014).
  41. Marco-Jiménez, F., Lavara, R., Jiménez-Trigos, E., Vicente, J. S. In vivo development of vitrified rabbit embryos: Effects of vitrification device, recipient genotype, and asynchrony. Theriogenology. 79, (7), 1124-1129 (2013).
  42. Vicente, J. S., et al. Rabbit morula vitrification reduces early foetal growth and increases losses throughout gestation. Cryobiology. 67, 321-326 (2013).
  43. Viudes-de-Castro, M. P., Marco-Jiménez, F., Cedano-Castro, J. I., Vicente, J. S. Effect of corifollitropin alfa supplemented with or without Lh on ovarian stimulation and embryo viability in rabbit. Theriogenology. 98, 68-74 (2017).
  44. Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters at transcriptomic and proteomic level rabbit foetal placenta. Reproduction. 147, 789-801 (2014).
  45. Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Lavara, R., Vicente, J. S. Direct comparison of the effects of slow freezing and vitrification on late blastocyst gene expression, development, implantation and offspring of rabbit morulae. Reproduction in Domestic Animals. 49, 505-511 (2014).
  46. Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Long-term and transgenerational effects of cryopreservation on rabbit embryos. Theriogenology. 81, 988-992 (2014).
  47. Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo transfer manipulation cause gene expression variation in blastocysts that disrupt implantation and offspring rates at birth in rabbit. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 207, 50-55 (2016).
  48. Roque, M., Valle, M., Kostolias, A., Sampaio, M., Geber, S. Freeze-all cycle in reproductive medicine: current perspectives. JBRA Assisted Reproduction. 21, (1), 49-53 (2017).
  49. Tsunoda, Y., Soma, T., Sugie, T. Effect of post-ovulatory age of recipient on survival of frozen-thawed rabbit morulae. Journal of Reproduction and Fertility. 65, (2), 483-487 (1982).
  50. Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17, (3), 744-751 (2002).
  51. Lavara, R., Baselga, M., Vicente, J. S. Does storage time in LN2 influence survival and pregnancy outcome of vitrified rabbit embryos? Theriogenology. 76, (4), 652-657 (2011).
En düşük Invaziv embriyo transferi ve tavşan modelinde optimum embriyo aşamasında embriyo vitrifikasyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).More

Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter