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Biochemistry

Determinação espectrofotométrica de Phycobiliprotein conteúdo em associação Synechocystis

Published: September 11, 2018 doi: 10.3791/58076
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 1
1Department of Adaptive Biotechnologies, Global Change Research Institute, Czech Academy of Sciences, 2Department of Plant Physiology, Faculty of Science, Masaryk University, 3Laboratory of Intracellular Regulation, Institute of Plant Physiology, Russian Academy of Sciences

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar quantitativamente o conteúdo de phycobiliprotein na associação Synechocystis , usando um método espectrofotométrico. O procedimento de extração foi aplicado também com sucesso para outras cepas de cianobactérias e algas; no entanto, devido às variações em espectros de absorção do pigmento, é necessário testar as equações espectrofotométricas para cada estirpe individualmente.

Abstract

Este é um protocolo simples para a determinação quantitativa do teor de phycobiliprotein na associação modelo Synechocystis. Phycobiliproteins são os componentes mais importantes de ficobilissoma captadores, as grandes antenas de luz-colheita em cianobactérias e vários táxons de algas. Os ficobilissoma captadores de Synechocystis contêm dois phycobiliproteins: ficocianina e allophycocyanin. Este protocolo descreve uma simples, eficiente e confiável método para a determinação quantitativa de ficocianina e allophycocyanin na associação deste modelo. Comparou-se vários métodos de extração de phycobiliprotein e quantificação espectrofotométrica. O procedimento de extração, conforme descrito neste protocolo foi aplicado também com sucesso para outras cepas de cianobactérias como Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp.,sp intoxicante ., e Nostoc SP., bem como sobre algas vermelhas Porphyridium Dendrobrium. No entanto, os coeficientes de extinção de phycobiliproteins específicas de vários táxons podem diferir e, portanto, recomenda-se validar o método de quantificação espectrofotométrica para cada estirpe única individualmente. O protocolo requer pouco tempo e pode ser executado em qualquer laboratório de Ciências da vida padrão, pois requer equipamento padrão somente.

Introduction

fPhycobiliproteins são complexos de proteína-pigmento hidrossolúvel que representam os componentes principais das antenas de luz-colheita em procariontes cianobactérias (Cyanophyta) e vários táxons eucariontes (Glaucophyta, Rhodophyta e Cryptophyta)1. Eles ocorrem principalmente como complexos supramoleculares chamados ficobilissoma captadores e estão normalmente ligados à superfície das membranas fotossintéticas do lado do estroma, com excepção dos Cryptophyta, onde os phycobiliproteins são localizadas no tilacoides lúmen2. Foram identificados quatro tipos de phycobiliproteins até a data: allophycocyanin o núcleo e o periférico ficocianina, ficoeritrina e phycoerythrocyanin1. Como os principais complexos de luz-colheita, ficobilissoma captadores representam um dos fatores cruciais de produtividade de culturas em massa de algas e cianobactérias. Foi demonstrado que truncamento ficobilissoma captadores pode aumentar o acúmulo de biomassa sob luz forte3. Por outro lado, sob o modesta ou baixa irradiância, o truncamento de antena resultou em taxas de crescimento e acúmulo de biomassa a redução3,4. Phycobiliproteins comercialmente são usados como corantes de alimentos, medicamentos e aditivos alimentares, na indústria de cosmético e como fluorescência sondas com aplicações em citometria de fluxo fluorescentes imunoensaios e de microscopia de fluorescência5.

Este protocolo centra-se na determinação quantitativa de phycobiliproteins na associação modelo Synechocystis. Cianobactérias são os primeiros autotróficos fotossintéticos Membros; Eles têm sido formando da Biosfera da terra por mais de 2,4 bilhões de anos6. Eles jogam um papel crucial nos ciclos biogeoquímicos globais de carbono, nitrogênio, oxigênio e outros elementos. Entre cianobactérias, uma estirpe unicelular Synechocystis ganhou uma posição única, já que foi a primeira associação com o todo o genoma sequenciado7,8, é naturalmente transformável por exógeno DNA9, e Ele executa o crescimento estável e relativamente rápido10,11. Em Synechocystis, o componente central de antena, allophycocyanin, está associado com as proteínas de membrana integrais e a ficocianina anexada está localizada na periferia de membrana tilacoides.

Vários métodos de extração de phycobiliprotein e quantificação são comparados neste protocolo. O procedimento de extração final foi aplicado com êxito Synechocystis, bem como outras estirpes de cianobactérias, incluindo Cyanothece sp de Spirulina SP., Synechococcuselongatus,., intoxicante SP..e Nostoc SP. e foi também aplicado com sucesso algas vermelhas Porphyridium Dendrobrium. Portanto, o método desenvolvido no presente protocolo pode ser considerado como um método universal para a extração de phycobiliprotein. Apesar de alguns dos métodos de extração testados resultaram em rendimentos mais elevados de proteína total, o aqui descrito procedimento de extração, desde o mais alto phycobiliprotein produz juntamente com o menor teor de um resíduo de clorofila na extrato de phycobiliprotein. Redução do teor de clorofila um foi essencial para a correta ficocianina e quantificação espectrofotométrica de allophycocyanin.

Os espectros de absorção de phycobiliprotein pode variar significativamente entre diferentes algas e cianobactérias espécie12,13,14,15,16,17 e até mesmo entre várias cepas de cianobactérias único género18. Portanto, os comprimentos de onda específicos e coeficientes de absorção como usado para a determinação de ficocianina e allophycocyanin em Synechocystis não são geralmente aplicáveis a outras estirpes. Além disso, Synechocystis não contiver ficoeritrina e phycoerythrocyanin que pode ser encontrado em algumas outras algas e cianobactérias. Para a determinação de phycobiliproteins em cepas diferentes Synechocystis, recomenda-se avaliar as equações espectrofotométricas para cada estirpe individualmente.

Embora o protocolo contém duas etapas mais tempo (durante a noite de liofilização de pelotas celulares e extração da proteína 1 hora), o tempo de trabalho total para a quantificação de phycobiliproteins é não mais de 2 horas.

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Protocol

1. cultivo de cianobactérias

  1. Cultive células Synechocystis em Erlenmeyers ou em fotobiorreatores10,19 em buffer BG11 médio20 para manter um pH de < 10 (por exemplo, usando 17 mM HEPES10).
    Nota: As condições de cultivo padrão exigem uma temperatura controlada (normalmente, 30 ° C, a temperatura ideal é 35 ° C)21, iluminação (normalmente, uma luz branca de uma intensidade até 800 µmol [fótons] / [m2·s])21e um CO fornecimento de 2 (no photobioreactor plana de 400 mL, o crescimento, saturando a concentração de CO2 é 1.700 ppm)21.
  2. Para determinar a densidade de cultura, medir a densidade óptica da cultura por espectrometria no 730 nm (OD730), utilizando uma cubeta com um caminho de luz de 1 cm. Alternativamente, contar as células em um microscópio usando um hemocytometer ou uma célula automatizada contador.

2. preparação de amostras

  1. Trabalho sob baixa irradiância para prevenir a degradação de phycobiliprotein.
  2. 3 x 1 mL de suspensão de cultura para cofre-bloqueio tubos de colheita. Use o triplica de estimativa de erros técnicos na medição. Para realizar a amostragem de cultura sob condições estéreis, colher as células em uma capa laminar e siga as práticas de trabalho e segurança adequadas.
  3. Centrifugar as células a 15.000 x g a temperatura do laboratório por 5 min. Preste atenção para o rotor de centrífuga devidamente equilibrada. Após a centrifugação, descarte os sobrenadantes. Certifique-se para não perturbar a pelota.
  4. Colocar as amostras no congelador. Para armazenamento a longo prazo, manter as amostras a-80 ° C. Isso é necessário para prevenir a degradação de phycobiliprotein. Para o armazenamento a curto prazo,-20 ° C é suficiente.
  5. Congela as amostras durante a noite. Para um adequado processo de liofilização, manter a temperatura do condensador Liofilizador abaixo de-60 ° C e a pressão na câmara Liofilizador em torno de 1 hPa.
  6. Depois de terminar o ciclo de liofilização, feche o tubo logo que possível para evitar a reabsorção de água do ar.

3. pilha de homogeneização e extração de pigmentos

  1. Adicione quatro pedaços de grânulos de vidro (com um diâmetro de 2 mm) para cada tubo de amostra e fechar os tubos.
    Nota: Quando a tampa do cofre-fechamento tubo usado para homogeneização é magra demais, pode quebrar durante a homogeneização; Portanto, apenas segura-bloqueio tubos com tampas fortes são recomendados para este protocolo.
  2. Homogeneizar as amostras com os grânulos de vidro por 15 s em um homogeneizador a temperatura do laboratório.
    Nota: Uma amostra devidamente homogeneizada é espalhada sobre a superfície interior dos tubos de bloqueio de segurança.
  3. Adicione 1 mL de tampão PBS (pH 7,4), pré-resfriado a 4 ° C, para as amostras a fim de extrair o phycobiliproteins.
    Nota: Este passo no, mantenho as amostras no gelo para evitar a degradação das proteínas extraídas. Isto é crítico.
  4. Misturar as amostras com PBS para 5 s do homogenizador a temperatura do laboratório.
    Nota: Após a mistura, as amostras são esverdeadas.
  5. Após a mistura, manter as amostras no gelo por 60 min. tampa o banho de gelo com uma tampa para evitar a degradação de pigmentos.
  6. Após 60 min de extração phycobiliprotein, Centrifugar as amostras a 15.000 x g a 4 ° C por 5 min. Preste atenção para equilibrar corretamente o rotor de centrífuga.
    Nota: Após a centrifugação, o sobrenadante tem uma cor azul ciana.

4. Phycobiliprotein quantificação

  1. Antes da medição espectrofotométrica, calibre o espectrofotômetro para a linha de base usando o tampão PBS como um espaço em branco.
  2. Uma vez que o espectrofotômetro calibrado, descartar a PBS de um fluorímetro e pipetar o sobrenadante com phycobiliproteins extraído em vez de com o buffer de descartados.
  3. Quantificar a concentração de phycobiliprotein espectrofotometricamente, usando uma largura de fenda de 0,5 nm.
    1. Medir a absorvância do phycocyanobilins em ficocianina e allophycocyanin contra o tampão PBS em branco no 615 nm (615) e 652 nm (652), respectivamente, e medir a absorvância dos restos celulares em 720 nm (720).
    2. Calcule a concentração de ficocianina e allophycocyanin de acordo com as equações (1) e (2) de Bennett e Bogorad12:
      Equation 1
      Equation 2
      Nota: Um615, um652e um720 devem caber ao intervalo linear absorvância do espectrofotómetro. Se necessário, dilua a amostra com o tampão PBS.
  4. Recalcule a concentração de pigmento nas amostras originais. A concentração de pigmento na amostra corresponde diretamente com os resultados das equações (1) e (2) quando a 1 mL de cultura e 1 mL de tampão de extração são utilizados para a análise. No caso de utilizar diferentes volumes de amostras de cianobactérias e/ou tampão PBS, a concentração de pigmento final deve ser calculada de acordo com a equação (3):
    Equation 3(3)
    Nota: No caso de um normalização phycobiliprotein conteúdo por peso seco de célula, a concentração de pigmento final deve ser calculada de acordo com a equação (4)Equation 4 (4)

5. determinação do peso seco da célula (opcional)

  1. Pesa três tubos de fechadura de cofre vazios em balanças analíticas.
    Atenção: É fundamental que os tubos de bloqueio de segurança estão secos. No caso de armazenar os tubos em um ambiente úmido, seque os tubos durante várias horas em um secador antes da pesagem-los de gelo. Manipular os tubos com cuidado e somente com as mãos enluvadas sem pó para evitar qualquer contato entre o material e os dedos do pesquisador. Manter todos os titulares e limpo para evitar a transferência de qualquer material para os tubos de centrifugação.
  2. 1 x 15 mL de suspensão de cultura em tubo cônico de 15 mL de amostra.
  3. Centrifugar a suspensão de cultura em tubos cônicos de 15 mL a 4.000 x g a temperatura do laboratório durante 10 min. de equilíbrio do rotor de centrífuga com três adicionais-15ml cónicos tubos, contendo cada uma 15 mL de água. Após a centrifugação, descarte 12 mL do sobrenadante.
  4. Resuspenda o pellet em restante sobrenadante e transferir 3 x 1 mL da mistura de três tubos de bloqueio de segurança de 1,5 mL com uma pipeta. No caso de algumas sobras da pelota permanecem no tubo cônico de 15 mL, adicionar 1,5 mL de água desionizada ao tubo cônico, vórtice ou agitar o tubo para Ressuspender o restante da pelota e transferir 3 x 0,5 mL da mistura para os três tubos de cofre-fechamento 1,5 mL (já containi ng 3 x 1 mL da pelota) com uma pipeta.
    Nota: Dividindo a pelota sobre três tubos de 1,5 mL cofre-fechadura permitirá a estimativa de qualquer erro técnico de medição de peso seco.
  5. Centrifugar as células em tubos de 1,5 mL cofre-bloqueio a 15.000 x g a temperatura do laboratório por 5 min. de equilíbrio do rotor de centrífuga com um tubo de segurança-bloqueio de 1,5 mL adicional que contém 1 mL de água. Após a centrifugação, descarte os sobrenadantes.
  6. Colocar as amostras no congelador. Para armazenamento a longo prazo, manter as amostras a-80 ° C; para armazenar a curto prazo,-20 ° C é suficiente.
  7. Congela as amostras durante a noite. Para um adequado processo de liofilização, manter a temperatura do condensador secador de congelamento abaixo de-90 ° C e a pressão na câmara Liofilizador em torno de 1 hPa.
  8. Após a liofilização, feche os tubos e pesar as amostras em balanças analíticas.
    Nota: O valor do peso seco pode ser usado para a normalização do conteúdo por peso seco celular phycobiliprotein.

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Representative Results

Para os testes do método inicial, Synechocystis era cultivada como culturas de lote em Erlenmeyers num agitador em BG11 cultivo médio20 (suplementado com 17 mM HEPES) a 25 ° C, sob uma luz branca quente de uma intensidade de 50 µmol (fótons) / (m 2·s) e com 1% de CO2 na atmosfera de cultivo. Durante o cultivo, as culturas foram amostradas para tubos de bloqueio seguro e centrifugaram (15.000 x g a temperatura do laboratório por 5 min), o sobrenadante foi descartado e as amostras foram ou armazenadas a-80 ° C e liofilizadas como preparação para o etapas individuais do presente protocolo ou armazenado a-20 ° C ou -80 ° C para análise comparativa de extração e quantificações.

Os procedimentos de extração testados incluíam rompimento da pilha por sonication, homogeneização com grânulos de zircônia dentro o tampão PBS e congelamento-descongelamento. Os resultados dos métodos de extração diferentes estão resumidos na Figura 1. O método conforme descrito neste protocolo fornecido que o phycobiliproteins mais altos rendimentos juntamente com a menor clorofila uma contaminação no buffer de extração. Clorofila um foi detectado no buffer de extração quando sonication foi usado para o rompimento da pilha. Ciclos de congelamento e degelo as amostras em banho de ultra-som no gelo de repetição resultaram em rendimentos mais elevados de proteína no buffer de extração. Ao mesmo tempo, a concentração de clorofila no buffer de extração aumentou (Figura 1 baixo-relevo), que excluiu uma phycobiliprotein adequada quantificação de conteúdo.

O tempo de homogeneização ideal era 15 s. homogeneização para os dois mais curtos (5 s) e mais (20 s) períodos fornecido ligeiramente mais baixos rendimentos de phycobiliprotein, como mostrado na Figura 2. Homogeneizar as células com grânulos de vidro de diâmetro 2mm resultou em rendimentos mais altos quando comparados com os grânulos de vidro de diâmetro de 0,5 mm, 1 mm ou 4 mm, com grânulos de zircônia de um diâmetro de 0.5 mm ou com grãos de areia do mar. A solução de tampão PBS foi testada como o amortecedor ideal para extração de phycobiliproteins (Figura 3). A adição de NaCl de 100 mM ou 150 mM KCl para o tampão PBS ou água não aumentar a eficiência de extração de phycobiliprotein, e o mesmo passou para o uso de 20 mM de tampão de acetato de sódio para extração (Figura 3). O tempo de extração de phycobiliprotein ideal era de 60 minutos porque, depois de mais tempo (até 240 minutos), a concentração de phycobiliprotein no buffer de extração não se alterou significativamente (Figura 4).

Também testámos o intervalo de linearidade do espectrofotômetro para a medição de phycobiliprotein (Figura 5) e comparadas várias equações de phycobiliprotein quantificação, usando padrões tanto ficocianina e allophycocyanin (Figura 6). O espectrofotómetro utilizado neste protocolo mostrou uma gama de absorbância linear entre 0,1 - 3,0 (Figura 5). Desde que os espectros da proteína extracto teve sua absorção máxima em torno de 620 nm (um620) e em 652 nm, a absorção (652) foi de apenas 33% de um620 (Figura 7), a linearidade de espectrofotômetro para um652 (máximo absorbância de allophycocyanin) foi testada somente até um652 de 1.16. As equações (1) e (2) Bennett Bogorad12 , desde a melhor reconstrução de padrões tanto ficocianina e allophycocyanin entre todas as equações testadas (Figura 6). Sulfato de estreptomicina, usado em vários estudos anteriores para a eliminação da membrana fragmentos contendo clorofila um, foi mostrado como não necessário para a extração (Figura 7).

Para o experimento de representante, Synechocystis foi cultivado em um photobioreactor25 em um regime de turbidostat, onde as células foram mantidas em fase de crescimento exponencial dentro de um intervalo definido de densidade óptica (medido em 680 nm, OD 680) por uma diluição controlada por um cultivo fresco médio (BG11 meio tamponado com 17 mM HEPES)11,26. As culturas foram cultivadas a 32 ° C e o ar de entrada continha 0,5% de CO2. As culturas foram iluminadas com uma luz vermelha (λmáx: 633 nm, λ1/2: 20 nm) de uma intensidade de 25-1100 µmol (fótons) / (m2·s), juntamente com uma luz azul (λmáx: 445 nm, λ1/2: 20 nm) de uma intensidade de 25 µmol ( fótons) / (m2·s). A densidade óptica da suspensão cultura foi medida pelo photobioreactor de base, e o intervalo de OD680 foi definida para 0,52 - 0,58 (2 x 107 a 4 x 107 células/mL). As culturas foram cultivadas sob cada intensidade de luz específica pelo menos 24 horas fornecer tempo suficiente para aclimatação. Depois de atingir a estabilidade do crescimento, as culturas foram amostradas por peso seco (de acordo com passos 2.1-2.8 do presente protocolo), contagem de células e conteúdo de ficocianina e allophycocyanin. Os resultados da avaliação phycobiliprotein sob crescente intensidades luminosas são mostrados na Figura 8. Synechocystis diminuiu o conteúdo phycobiliprotein de 12% do peso seco celular (505 fg/célula) sob a menor irradiação para 3% do peso seco celular (280 fg/célula) sob a mais alta irradiância.

Figure 1
Figura 1 : Comparação entre a eficiência de extração do método descrito neste protocolo com vários métodos de referência. A concentração de ficocianina (barras pretas) e allophycocyanin (barras brancas) no extracto de proteína bruta foi medida após extração no buffer PBS para 60 min. um método é descrita neste protocolo. B método foi modificado da seguinte forma: após a colheita, as células foram centrifugadas (15.000 x g a temperatura do laboratório por 5 min) e armazenado a-20 ° C durante a noite. As amostras congeladas foram lisadas por 120 s a 4 ° C e o phycobiliproteins foram extraídos em tampão PBS para 60 min. método C foi modificado do método B, armazenando as pelotas de células colhidas a-80 ° C por 30 min, liofilização as pelotas de celulares e adicionar tampão PBS nas pelotas secas. Método D foi modificado de Chung et al. 16: após a liofilização (mesmo como método C), 0,25 mL de acetato de at com buffer de sulfato de estreptomicina 1% (pH 5,5) foi adicionado ao pellet celular seco, juntamente com 0,25 mL de grânulos de zircónio (com um diâmetro de 0,5 mm), e as amostras foram homogeneizadas duas vezes por 60 s sobre o homogenizador. Após a homogeneização, outra 0,5 mL de at-acetato com buffer de sulfato de estreptomicina 1% (pH 5,5) foi adicionado à amostra, os tubos foram vortexed e as proteínas foram extraídas no gelo por 30 min. método E consistiu em um único ciclo de congelamento-descongelamento em tampão PBS e extração de proteínas por 24 h a 4 ° C. Método F (figura de baixo-relevo) consistia de um e seis ciclos de congelamento das células (inicialmente, liofilizado e resuspended em tampão PBS) em nitrogênio líquido, seguido por sonication no gelo. Devido a clorofila significativa presença no extracto de proteína bruta, os phycobiliproteins não foram quantificados no método F. Os valores retratados representam as médias de três repetições de técnicas, com as barras de erro, que representa os desvios-padrão. Concentrações de pigmento foram calculadas de acordo com as equações (1) e (2) do presente protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Efeito do tempo de homogeneização sobre a eficiência de extração de phycobiliprotein. Os pellets liofilizados de Synechocystis células (de acordo com passos 3.1-3.5 do presente protocolo) foram interrompidos com contas de vidro no homogeneizador para 5 s, 15 s e 20 s. Os valores retratados representam as médias de três repetições de técnicas, com as barras de erro, que representa os desvios-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Eficiência de extração de Phycobiliprotein em vários buffers de extração. Os phycobiliproteins foram extraídos no buffer PBS, PBS buffer com uma adição de NaCl de 100 mM ou 150 mM KCl, em água desionizada com NaCl a 100 mM ou 150 mM KCl, de acordo com Braulio e Fareha22e em acetato de sódio 20 mM de acordo com Chung et al < / C4 >. 16. a extração foi realizada a 4 ° C, de acordo com as etapas 4.1-4.3 do presente protocolo. Os valores retratados representam as médias de três repetições de técnicas, com as barras de erro, que representa os desvios-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Phycobiliprotein estabilidade no buffer de extração no tempo. Após o procedimento de extração, realizado conforme descrito nas etapas 4.1-4.3 do presente protocolo, o extracto de phycobiliprotein em tampão PBS (pH 7,4) foi armazenado a 4 ° C por até 4 horas, sem significativa ficocianina (círculos) e allophycocyanin (praças) degradação. A linha tracejada representa o ajuste linear de pontos de tempo calculado pelo método dos mínimos quadrados. Os valores retratados representam as médias de três repetições de técnicas, com as barras de erro, que representa os desvios-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Representante medições da concentração de ficocianina e allophycocyanin de Synechocystis. Uma suspensão da cultura densa (ficocianina: 456 µ g/mL, allophycocyanin: 106 µ g/mL) foi gradualmente diluída até uma concentração de 19 µ g/mL para ficocianina e allophycocyanin. Os valores retratados representam as médias de três repetições de técnicas, com as barras de erro, que representa os desvios-padrão. A linha pontilhada representa o ajuste linear dos pontos de concentração calculada pelo método dos mínimos quadrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 : Estimativa da concentração de ficocianina e allophycocyanin de padrões de pigmentos. O conteúdo de ficocianina e allophycocyanin em padrões de pigmento foi medido por espectrometria de acordo com as equações de Bennett e Bogorad12, Lüder et al. 13, Saramago-Wiley e Neefus15, Evans14e Chung et al. 16. conteúdo de proteína nas normas (como necessárias para a determinação de phycobiliproteins) foi quantificado utilizando uma solução de carbonato de sódio, ácido bicinchoninic, tartarato de sódio e bicarbonato de sódio em 0,1 N de NaOH (com um pH final de 11,25), em reação com o cobre (II) 4% (p/v) de sulfato pentahidratado27, usando albumina de soro bovino como um padrão de proteína. As equações de Bennett e Bogorad fornecido a maior reconstrução de dois pigmentos: 96% de ficocianina padrão e 99% de allophycocyanin padrão. Os valores retratados representam as médias de três repetições de técnicas, com as barras de erro, que representa os desvios-padrão. Linha tracejada destaca o ponto de 100%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7 : O efeito do sulfato de estreptomicina sobre o espectro de absorção da proteína bruta extrato no buffer PBS. (A), a extração de procedimento conforme descrito nas etapas 4.1-4.3 do presente protocolo ou (B) usando sonication, conforme descrito na legenda da Figura 1 para o método F foi realizada em tampão PBS (círculos) e em tampão PBS, suplementado com 1% sulfato de estreptomicina (quadrados). A quantificação de phycobiliprotein foi realizada de acordo com passos 5.1-5.4 do presente protocolo. Os valores retratados representam as médias de três repetições de técnicas, com as barras de erro, que representa os desvios-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8 : Concentração de ficocianina (círculos) e allophycocyanin (quadrados) em Synechocystis cultivada sob luz vermelha-alaranjada de uma intensidade de µmol(photons)/(m2·s) 25-1100. Synechocystis culturas foram cultivadas em um photobioreactor a 32 ° C, com 0,5% de CO2 no ar entrado, no meio de cultivo BG11 suplementado com 17 mM HEPES em regime turbidostat de acordo com Zavrel et al 11. as concentrações de phycobiliprotein foram medidas de acordo com este protocolo e o conteúdo de phycobiliprotein final foi normalizado por peso seco celular, conforme descrito na secção 2 do presente protocolo. As linhas tracejadas representam o ajuste da potência dos pontos de medida, calculada pelo método dos mínimos quadrados. Os valores retratados representam as médias de três repetições de técnicas, com as barras de erro, que representa os desvios-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo descreve um método simples, rápido e reprodutível para a quantificação do teor de phycobiliprotein na associação modelo Synechocystis. Vários métodos de homogeneização de células, extração de proteínas e quantificação de ficocianina e allophycocyanin são comparados, e o protocolo final representa uma combinação das etapas de cada procedimento único ideais. Como dados representativos, o conteúdo de phycobiliproteins foi quantificado em células de Synechocystis sob crescente intensidade da luz. Apesar da análise requer tempo semelhante e equipamento de laboratório, como alguns dos métodos anteriormente publicados12,13,14,15,16, a vantagem deste protocolo é que sem clorofila um é liberado para o buffer de extração e, assim, a medição de phycobiliprotein pode ser estimado com alta precisão.

A quantidade de suspensão de células necessária para a análise de phycobiliprotein pode variar de acordo com a densidade de cultura. O volume de 1 mL da amostra é otimizado para culturas com uma OD730 de 1.5, uma densidade de célula de aproximadamente 2 x 107 células/mL, ou para culturas com um teor de phycobiliprotein de aproximadamente 20 mg/L. No caso de culturas diluídas, colha um maior volume de cultura. Por outro lado, no caso de culturas densas, colher uma baixa cultura volume-em alta densidade de culturas, há o risco de phycobiliproteins parcialmente permanecem nas células após a extração. Da mesma forma, a quantidade de suspensão de células necessária para a determinação do peso seco pode variar de acordo com a densidade de cultura. O volume de amostragem de 15 mL é otimizado para as culturas com uma OD730 de 1,5 ou com uma densidade de célula de aproximadamente 2 x 107 células/mL. Com culturas de densidade mais baixas ou com volumes menores, o erro de medição pode aumentar. Pelo contrário, maiores volumes de cultura ou culturas mais densas fornecem melhores resoluções de método.

Passos críticos do protocolo são a extração de homogeneização e phycobiliprotein de célula que deve proporcionar rendimentos elevados e alta especificidade. O mais alto rendimento e pureza dos extractos com preservação simultânea máxima de proteína foi alcançado por liofilização das amostras, homogeneizando as pelotas celulares secas por grânulos de vidro e realizar a extração de phycobiliprotein em tampão PBS ( Figura 1). Uma vez que mesmo uma pequena contaminação do extrato de proteína bruta por clorofila uma pode levar a uma superestimação de conteúdo phycobiliprotein, é necessário evitar qualquer clorofila uma extração adicionando o tampão PBS. Clorofila uma foi detectada no extrato bruto quando sonication foi usado para rompimento da pilha. Conforme a inserção da Figura 1, com ciclos de sonication, a quantidade de clorofila no extrato aumentada de repetição. Por outro lado, a quantidade de extraída de proteínas (como detectado pela absorbância em 280 nm) também aumentou após sonication ciclos de repetição. Portanto, o uso de sonication (em combinação com ciclos de congelação-degelo em nitrogênio líquido) aparece como um método adequado para a extração de proteínas totais (proteínas livres e membrana-limite são liberadas das células); no entanto, não é recomendável para fins de quantificação espectrofotométrica de phycobiliprotein. Chung et al. recomendado o uso de sulfato de estreptomicina 1% a fim de eliminar os fragmentos de membrana com clorofila um16. Aqui, o uso do sulfato de estreptomicina apareceu para não ser necessário, já que não levou a uma redução da clorofila no extracto de proteína (Figura 7). Mesmo que um único sonication ciclo para 120 s não perturbem as células eficientemente (métodos B e C, Figura 1), outros métodos (por exemplo, método F tal como apresentado na Figura 1 ou os métodos apresentados na Figura 7B) confirmaram achados anteriores de sonication sendo uma célula eficiente interrupção método22,28. Por outro lado, ciclos de congelação-degelo simples, também anteriormente relatados como um método eficiente para phycobiliproteins extração de22,28, desde que os rendimentos mais baixos nos ensaios descritos aqui (método E, Figura 1 ). Homogeneização da pilha (dentro do buffer de extração, 2 x 60 s) por zircônio grânulos foi testado como menos eficiente do que a homogeneização de 15-s do pellet celular liofilizado (método D, Figura 1). O processo de homogeneização dentro do buffer de extração foi descrito anteriormente com um mais longo de tempo (10 min) homogeneização29. Não Testámos a homogeneização por mais de 2 min, desde as amostras aquecida significativamente durante cada ciclo de homogeneização. Na literatura, outros métodos de interrupção de célula também foram descritos, incluindo a utilização de uma imprensa francesa16 ou moagem13,15,30; no entanto, tais métodos não foram testados neste estudo.

A extração de proteínas foi realizada por 15 s (Figura 2) em tampão PBS. O tampão de pH foi de 7,4, que foi relatado anteriormente como ideal para extração de phycobiliprotein22. A adição de NaCl ou KCl não melhorar eficiência de extração de phycobiliprotein (Figura 3), que está contradizendo anteriores observações22. No entanto, conforme indicado na Figura 3, a solução de tampão fosfato salina como usado neste protocolo contido 154 mM NaCl (além de 5,6 mM Na2HPO4 e 1 mM KH2PO4), que não nos permitiu estabelecer o Livre de NaCl PBS solução tampão como um controle. Nós também comparamos tampão PBS e sódio Acetato tampão16 extração eficiências. A combinação de fosfato de sódio e fosfato de potássio dentro do buffer PBS fornecido phycobiliproteins mais elevados rendimentos (Figura 3). Esta constatação correspondeu-se com as conclusões anteriores de Braulio et al. 22.

O tempo de extração de phycobiliprotein foi otimizado para 1 h. extração mais não conduziu a phycobiliprotein significativa degradação ou extração melhoria (Figura 4), que correspondeu com o trabalho anterior de Lawrenz et al. 28. um tempo de extração menor do que 1 h não foi testado. Da mesma forma, a extração de mais de 4 h não foi testada desde que foi encontrado anteriormente que o phycobiliproteins extraídos no tampão fosfato é estáveis pelo menos 48 h28.

Nós comparamos várias equações de quantificação espectrofotométrica de ficocianina e allophycocyanin, conforme descrito anteriormente na literatura, recalculando o conteúdo de ambos os phycobiliproteins das normas comerciais com proteínas conhecidas concentrações (Figura 6). A melhor reconstrução de ambos os pigmentos foi alcançada com as equações de Bennett e Bogorad12. Este resultado não era específico para o fosfato solução tampão desde que tal um buffer tem sido usado anteriormente12,13,15. Também não era específico para os padrões de pigmento, desde que a diferença entre um615A618e um620 (comprimentos de onda usados para estimativa de ficocianina em trabalhos anteriores) no padrão a ficocianina foi 1% e a diferença entre um 650 e um652 (comprimentos de onda utilizados anteriormente para allophycocyanin estimativa12,13,14,16) no allophycocyanin padrão foi de 3%. Da mesma forma, a diferença entre um615 e um620 no extracto de proteína de Synechocystis era apenas 2%. Essas pequenas diferenças em espectros de absorção não podem resultar em uma variação de pigmento final de até 36% (Figura 6). Portanto, as diferenças entre as equações individuais foram bastante ligadas às variações de phycobiliprotein coeficientes de extinção de organismos específicos12,13,14, 15 , 16 , 17. Curiosamente, as equações de Chung et al. desde a reconstrução de ficocianina menor (Figura 6) embora os autores também usaram Synechocystis para seus experimentos16.

Em vez da determinação de comprimentos de onda único, recomenda-se medir um espectro contínuo do extrato phycobiliprotein entre 280-720 nm, para estimar a presença de clorofila no extrato, que poderia interferir com ambos os allophycocyanin e a absorção de ficocianina. Além disso, medindo a absorbância em 280 nm (280), uma pureza de ficocianina (um615/A280 ou um620/A280)21,22 e allophycocyanin (um652/A280) 24 dentro o extrato pode ser estimado (0.7: comestível, 3.9: classe reativa, > 4.0: qualidade analítica)21.

Como dados representativos, determinou-se a concentração de ficocianina e allophycocyanin em Synechocystis sob crescente intensidade da luz. Manter a densidade de cultura a um nível constante dentro de um cultivo de turbidostat regime11,21 foi essencial para o experimento comparativo direto. A concentração de ficocianina e allophycocyanin de 2,4% - 10,2% e 0,6% - 1,7% do peso seco celular, respectivamente, foram semelhantes como o relatado anteriormente valores11,31,32. Também, a base do phycobiliprotein conteúdo por célula foi semelhante, como relatado anteriormente11,33. Com a luz crescente, o conteúdo de phycobiliproteins diminuiu. Curiosamente, mesmo sob a mais alta intensidade de luz de 1100 µmol (fótons) / (m2·s), os phycobiliproteins não eram completamente branqueada.

Desde que o protocolo exige equipamento somente padrão e é relativamente rápido, pode ser facilmente adotada em qualquer laboratório, em que phycobiliproteins são analisados rotineiramente.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Foi adoptado o protocolo de uma anterior publicação de11. T. z., ch. D. e J. Č... foram apoiados pelo Ministério da educação, juventude e desporto da República Checa, no âmbito do programa nacional de sustentabilidade eu (NPU eu), conceder o número LO1415. J. Č... era também apoiada pelos GA CR, Grant number 18-24397S. Acesso aos instrumentos e outras instalações foi apoiado em infra-estrutura checo de investigação para a biologia de sistemas C4SYS (projeto não LM2015055). M. A. S. foi apoiado por uma bolsa da Fundação de ciência russo [n. º 14-14-00904].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synechocystis sp. PCC 6803 Institut Pasteur, Paris, France 6803 Cyanobacterium strain
Roti-CELL PBS Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 9143.1 Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4
Eppendorf safe-lock tubes  Eppendorf, Hamburk, Germany 30120086 Safe-lock tubes 1.5 ml
VWR 80-Place Storage System VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA 30128-282 Holder for safe-lock tubes 
RAININ 100 µl -1000 µl  Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA 17014382 Pipette
GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8 Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA 30389272 Pipette tips
Rotina 420R Hettich, Kirchlengern, Germany 4701 Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes
LCexv 4010 Liebherr, Bulle, Switzerland 9005382197172 Refrigerator and freezer -20 °C
Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA EXF24086V  Freezer -80 °C
CoolSafe LaboGene, Lillerød, Denmark 7.001.000.615 Freeze dryer 
UV-2600 Shimadzu, Kyoto, Japan UV-2600 Spectrophotometer 
Hellma absorption cuvettes, semi Micro Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA Z600288  VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm 
Silamat S6 Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein 602286WU Homogenizer 
Solid-glass beads Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA Z273627 Glass bead of the diameter 2 mm
CPA225D-0CE Sartorius AG, Göttingen, Germany SECURA225D-1OBR Analytical balances
C-Phycocyanin from Spirulina sp.  Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA P2172 Phycocyanin standard
Allophycocyanin Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA A7472 Allophycocyanin standard
Bicinchoninic Acid Kit  Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA BCA1, B9643 Complete kit for total proteins determination
AlgaeTron  Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic AG 130-ECO  Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere
Photobioreactor Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic FMT-150 Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment
Cellometer  Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA Auto M10 Cell counter
Corning 15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA CLS430791  15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling
Herasafe KS Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 51024579 Laminar flow hood

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Determinação espectrofotométrica de Phycobiliprotein conteúdo em associação <em>Synechocystis</em>
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