Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבוע באופן כמותי phycobiliprotein בתוכן cyanobacterium Synechocystis באמצעות שיטת spectrophotometric. ההליך החילוץ היה הוחלו בהצלחה גם זנים אחרים כחוליות ואצות; עם זאת, בשל הבדלים ב ספקטרום בליעה פיגמנט, יש צורך לבחון את המשוואות spectrophotometric עבור כל זן בנפרד.
Abstract
זהו פרוטוקול פשוט מצפני כמותית phycobiliprotein בתוכן מודל cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins הם המרכיבים החשובים ביותר של phycobilisomes, מחושיהם קציר-אור גדול של כחוליות מספר האצות taxa. Phycobilisomes של Synechocystis להכיל שתי phycobiliproteins: phycocyanin ו- allophycocyanin. פרוטוקול זה מתאר פשוט, יעיל, שיטה אמינה מצפני כמותיים הן phycocyanin והן allophycocyanin ב cyanobacterium מודל זה. אנחנו לעומת מספר שיטות החילוץ phycobiliprotein, spectrophotometric כמת. ההליך החילוץ כפי שמתואר פרוטוקול זה הוחל גם בהצלחה על זנים כחוליות אחרים כגון Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, ספירולינה sp., Arthrospira sp., Nostoc sp., כמו גם באשר אדומיות Porphyridium cruentum. עם זאת, המקדמים הכחדה של phycobiliproteins ספציפית של taxa שונים יכולים להיות שונים, ולכן, מומלץ כדי לאמת את שיטת כמת spectrophotometric עבור כל מאמץ יחיד בנפרד. הפרוטוקול דורש מעט זמן, ניתן לבצע במעבדה כל סטנדרט מדעי החיים שכן היא דורשת ציוד סטנדרטי בלבד.
Introduction
fPhycobiliproteins הם פיגמנטים מסיסים במים-חלבון מתחמי המייצגות רכיבים עיקריים של מחושיהם קציר-אור ב כחוליות prokaryotic (Cyanophyta), taxa מספר האיקריוטים (Glaucophyta, Rhodophyta , ו Cryptophyta)1. הם מתרחשים בעיקר בתור מתחמי סופרא מולקולרית בשם phycobilisomes, הם בדרך כלל מחוברים אל פני השטח של הממברנות פוטוסינתטיים בצד סטרומה, למעט Cryptophyta, איפה phycobiliproteins מותאמים תילקואיד לומן2. ארבעה סוגים של phycobiliproteins זוהו עד עדכנית: allophycocyanin את הליבה, וקו היקפיים phycocyanin, phycoerythrin ו- phycoerythrocyanin1. כמו מתחמי קציר-האור הראשי, phycobilisomes מייצגים את אחד הגורמים מכריע של פרודוקטיביות תרבויות מסת האצות, כחוליות. זה הוכח, שחיתוך phycobilisomes הזה יכול לשפר ביומסה הצטברות תחת אור חזק3. מצד שני, תחת irradiance צנוע או נמוך, העיגול אנטנה הביא שיעורי צמיחה ו-3,הפחתת הצטברות ביומסה4. Phycobiliproteins מסחרית משמשים צבעני מזון, תרופות, תוספי מזון, בתעשיית הקוסמטיקה, וכן קרינה פלואורסצנטית רגשים עם יישומים cytometry זרימה, immunoassays פלורסנט ו קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ5.
פרוטוקול זה מתמקד הקביעה כמותית של phycobiliproteins, cyanobacterium דגם Synechocystis. כחוליות הן המוקדם oxygenic פוטוסינתטיים autotrophs; הם יוצרים הביוספרה של כדור הארץ במשך יותר מ- 2.4 מיליארד שנה6. הם לשחק תפקיד מכריע הביוגיאוכימיים הכללית של חנקן, פחמן, חמצן ורכיבים אחרים. בין כחוליות, זן חד־תאיות Synechocystis השיגה תפקיד ייחודי מאז זה היה cyanobacterium הראשון עם הגנום כולו רציף7,8, זה מודולרי באופן טבעי על ידי ה-DNA אקסוגני9, ו היא מבצעת צמיחה יציבה ומהירה יחסית10,11. ב- Synechocystis, הרכיב אנטנה הליבה, allophycocyanin, קשורה עם החלבונים ממברנלי אינטגרלי, והוא phycocyanin המצורף ממוקם בפריפריה תילקואיד ממברנה.
מספר שיטות החילוץ phycobiliprotein, כימות מושווים בתוך פרוטוקול זה. ההליך הסופי החילוץ הוחלה בהצלחה אל Synechocystis, כמו גם זנים אחרים של כחוליות, כולל Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, ספירולינה sp., Arthrospira sp., ו Nostoc sp., והוא הוחל גם בהצלחה על אדומיות Porphyridium cruentum. לכן, השיטה פותחה ב פרוטוקול זה יכול להיחשב כשיטה אוניברסלי לחילוץ phycobiliprotein. אף-על-פי חלק מהשיטות החילוץ שנבדקו, גרמו תשואות גבוהות של חלבון הכולל, הכאן תיאר נוהל חילוץ בתנאי phycobiliprotein הגבוהה ביותר התשואות יחד עם התוכן הנמוך של כלורופיל משקע ב phycobiliprotein חלץ. הפחתת את התוכן של כלורופיל היה חיוני phycocyanin הנכון של כימות spectrophotometric allophycocyanin.
ספקטרום בליעה phycobiliprotein יכול להשתנות באופן משמעותי בין אצות כחוליות מינים12,13,14,15,16,17 שונים ואפילו בין זנים שונים של סוג כחוליות יחיד18. לכן, אורכי גל מסוים ואת מקדמי קליטה משמש לקביעת phycocyanin ו- allophycocyanin ב Synechocystis אינם חלים באופן כללי על זנים אחרים. בנוסף, Synechocystis אינו מכיל phycoerythrin ו- phycoerythrocyanin שניתן למצוא בין כמה אחרים אצות כחוליות. לצורך קביעת phycobiliproteins ב זנים שאינם Synechocystis, מומלץ להעריך את המשוואות spectrophotometric עבור כל זן בנפרד.
למרות הפרוטוקול מכיל שני צעדים ארוכים יותר (בין לילה ליופיליזציה של כדורי הסלולר והפקת חלבונים שעה), הזמן העבודה הכוללת עבור כימות phycobiliproteins הוא לא יותר מ 2 שעות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. כחוליות טיפוח
- לטפח Synechocystis תאים Erlenmeyer מבחנות או בכל10,photobioreactors19 במאגר BG11 בינוני20 כדי לשמור על pH של < 10 (למשל, באמצעות HEPES 17 מ"מ10).
הערה: טיפוח סטנדרטי התנאים מחייבים טמפרטורה מבוקרת (בדרך כלל, 30 מעלות צלזיוס, טמפרטורה אופטימלית הוא 35 ° C)21, תאורה (בדרך כלל, אור לבן בעוצמה עד 800 µmol [פוטונים] / [m2·s])21, ו- CO אספקת 2 (ב- photobioreactor שטוחים 400-mL, הגידול קולח CO2 ריכוז הוא 1,700 ppm)21. - כדי לקבוע את צפיפות תרבות, למדוד את הצפיפות האופטית תרבות spectrophotometrically-730 nm (OD730) באמצעות cuvette של נתיב האור של 1 ס מ. לחלופין, לספור את התאים במיקרוסקופ באמצעות hemocytometer או תא אוטומטיות מונה.
2. דוגמאות הכנה
- לעבוד תחת בקרינה נמוכה כדי למנוע השפלה phycobiliprotein.
- קציר 3 x 1 מ"ל של תרבות השעיה על צינורות מנעול כספת. השתמש triplicates עבור הערכת שגיאות טכניות במדידה. כדי לבצע דגימה תרבות בתנאים סטריליים, לקצור את התאים בשכונה למינריות ובצע את נוהלי עבודה ובטיחות נאותה.
- Centrifuge התאים ב x 15,000 g בטמפרטורת מעבדה עבור 5 דק. לשים לב הרוטור צנטריפוגה מאוזנת כראוי. לאחר צנטריפוגה, למחוק את supernatants. הקפד שלא להפריע בגדר.
- לשים את הדגימות במקפיא. לאחסון לטווח ארוך, שומרים את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס. הדבר נחוץ למנוע השפלה phycobiliprotein. לאחסון לטווח קצר, מספיקה-20 ° C.
- שזה יבש והקפיא את הדגימות בן לילה. עבור תהליך להקפיא ייבוש נאותה, לשמור על הטמפרטורה על ההקפאה-מייבש מעבה מתחת C º 60 ואת הלחץ בתא ההקפאה-מייבש סביב 1 hPa.
- לאחר סיום מחזור להקפיא ייבוש, סגור את הצינור בהקדם האפשרי כדי למנוע את התחדשות של מים מן האוויר.
3. תא המגון ופיגמנטים החילוץ
- להוסיף ארבע חתיכות של חרוזי זכוכית (בקוטר של 2 מ מ) כל שפופרת מדגם וסגור את הצינורות.
הערה: כאשר המכסה של הצינור מנעול כספת המשמש המגון הוא רזה מדי, הדבר עלול לפגום במהלך המגון; לכן, רק מנעול כספת צינורות בשלמותם חזק מומלץ עבור פרוטוקול זה. - Homogenize את הדגימות עם חרוזי זכוכית 15 s על מהמגן בטמפרטורה מעבדה.
הערה: מדגם כראוי homogenized משתרע על פני השטח הפנימי כל הצינורות מנעול כספת. - להוסיף 1 מ"ל של מאגר PBS (pH 7.4), precooled עד 4 ° C, כדי הדגימות כדי לחלץ phycobiliproteins.
הערה: מהשלב הזה על, שומרים את הדגימות על קרח כדי למנוע ההשפלה של החלבונים שחולצו. . זה חיוני - מערבבים את הדגימות עם PBS עבור 5 s ב- מהמגן בטמפרטורת מעבדה.
הערה: לאחר ערבוב, הדגימות הן ירקרק. - לאחר ערבוב, שומרים את הדגימות על קרח במשך 60 דק המכסה את אמבטיית קרח עם מכסה כדי למנוע השפלה פיגמנטים.
- לאחר 60 דקות של phycobiliprotein החילוץ, centrifuge את הדגימות-x 15,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. שים לב לאזן כראוי בין הרוטור צנטריפוגה.
הערה: לאחר צנטריפוגה, תגובת שיקוע יש צבע כחול ציאן.
4. Phycobiliprotein כמת
- לפני המדידה spectrophotometric, לכייל את ספקטרופוטומטרים לקו הבסיס באמצעות המאגר PBS ריקים.
- ברגע ספקטרופוטומטרים מכויל, למחוק את החינוכית של אחד cuvette ספקטרופוטומטרים ו pipette את תגובת שיקוע עם שחולצו phycobiliproteins במקום עם המאגר שהושלכו.
- לכמת את ריכוז phycobiliprotein spectrophotometrically, באמצעות חריץ ברוחב של 0.5 ננומטר.
- למדוד את ספיגת של phycocyanobilins phycocyanin ואת allophycocyanin נגד המאגר PBS ריק-615 nm (615) ו 652 nm (652), בהתאמה, ולמדוד את ספיגת של ההריסות הסלולר ב 720 nm (720).
- לחשב את הריכוז של phycocyanin, allophycocyanin על פי המשוואות (1) ו- (2) של בנט, Bogorad12:
הערה: על615652,720 . זה צריך להתאים לטווח ספיגת ליניארי ספקטרופוטומטרים במידת הצורך, לדלל את הדגימה עם מאגר PBS.
- חישוב מחדש של ריכוז פיגמנט הדגימות המקורי. ריכוז פיגמנט במדגם מקבילה ישירות עם התוצאות של משוואות (1) ו- (2) 1 מ"ל של תרבות 1 מ"ל של המאגר החילוץ משמשים לניתוח. במקרה של שימוש באמצעי אחסון שונים של כחוליות דגימות ו/או מאגר PBS, יש לחשב את ריכוז פיגמנט הסופי לפי משוואה (3):
(3)
הערה: במקרה של תוכן phycobiliprotein תהליך לפי משקל יבש תא, ריכוז פיגמנט הסופי יש לחשב לפי משוואה (4)
(4)
(3)
(4)5. קביעת המשקל היבש תא (אופציונלי)
- שוקלת שלושה צינורות מנעול כספת ריקה על יתרות האנליטי.
התראה: זה קריטי כי הצינורות מנעול כספת יבשים. במקרה של אחסון הצינורות בסביבה רטובה, יבשה הצינורות במשך מספר שעות הקפאה מייבש לפני שקילה אותם. לתפעל את הצינורות בעדינות ורק עם אבקה ללא ידיים בכפפות כדי למנוע מגע בין החומר ובין האצבעות של החוקר. לשמור כל מחזיקי, צנטריפוגה נקי כדי למנוע את העברת חומר הצינורות. - דוגמה 1 x 15 מ"ל של תרבות השעיה על צינור חרוטי 15-mL.
- Centrifuge המתלה התרבות ב- 15-mL חרוט הצינורות ב x 4,000 גרם בטמפרטורה מעבדה במשך 10 דקות איזון הרוטור צנטריפוגה עם שלושה נוספים 15-mL חרוט צינורות, המכיל כל 15 מ"ל של מים. לאחר צנטריפוגה, להתעלם מ 12 ל תגובת שיקוע.
- Resuspend בגדר, תגובת שיקוע הנותרים ולהעביר 3 x 1 מ"ל של התערובת שלושה צינורות מנעול כספת 1.5-mL עם פיפטה. במקרה קצת שאריות של בגדר נשארים בצינור חרוט 15-mL, להוסיף 1.5 מיליליטר מים יונים צינור חרוטי, מערבולת או טלטול צינור כדי resuspend הנותרים גלולה ולאחר להעביר 3 x 0.5 מ"ל של התערובת מנעול כספת 1.5-mL שלושה צינורות (כבר containi ng 3 x 1 מיליליטר בגדר) עם פיפטה.
הערה: חלוקת בגדר מעל שלושה צינורות מנעול כספת 1.5-mL יאפשר את אומדן שגיאות טכניות של מדידת משקל יבש. - Centrifuge התאים 1.5-mL צינורות מנעול כספת ב x 15,000 g בטמפרטורת מעבדה עבור 5 דק איזון הרוטור צנטריפוגה עם צינור מנעול כספת נוספים של 1.5-mL המכיל 1 מ ל מים. לאחר צנטריפוגה, למחוק את supernatants.
- שמת את הדגימות במקפיא. לאחסון לטווח ארוך, שומרים את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס; לאחסון לטווח קצר, מספיקה-20 ° C.
- שזה יבש והקפיא את הדגימות בן לילה. עבור תהליך להקפיא ייבוש נאותה, לשמור על הטמפרטורה על הקבל מייבש ההקפאה מתחת-90 ° C והלחץ בתא ההקפאה-מייבש סביב 1 hPa.
- לאחר ליופיליזציה, לסגור את הצינורות ולשקול את הדוגמאות על יתרות האנליטי.
הערה: הערך משקל יבש יכול לשמש עבור נירמול של התוכן phycobiliprotein לכל תא משקל יבש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לצורך הבדיקות בשיטה הראשונית, Synechocystis היה מעובד כמו תרבויות אצווה Erlenmeyer המבחנות על מטרף BG11 טיפוח בינוני20 (בתוספת 17 מ"מ HEPES) 25 ° c, תחת אור לבן חם של עוצמות של 50 µmol (פוטונים) / (ז 2·s) עם 1% CO2 באטמוספרה culturing. במהלך הטיפוח, התרבויות היו נדגמים כדי מנעול כספת צינורות centrifuged (15,000 x g בטמפרטורת מעבדה במשך 5 דקות), תגובת שיקוע גורש ואני הדגימות היו מאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס או הקפוא כהכנה צעדים בודדים של פרוטוקול זה או מאוחסנות ב-20 ° C או -80 ° C עבור חילוץ השוואתי וניתוח quantifications.
ההליכים החילוץ שנבדקו כללו לשבירת תאים על ידי sonication, המגון עם חרוזי קריסטל בתוך מאגר PBS, מפשיר ההקפאה. התוצאות של שיטות שונות מיצוי מסוכמות באיור1. השיטה כפי שמתואר בתוך פרוטוקול זה סיפק ש-phycobiliproteins הגבוהה ביותר התשואות יחד עם הנמוך כלורופיל הזיהום במאגר החילוץ. כלורופיל זוהה המאגר החילוץ כאשר sonication שימש על ההפרעה התא. חוזרים מחזורים של הקפאה והפשרה הדגימות באמבט אולטרסאונד על הקרח של הביאה תשואות גבוהות חלבון במאגר החילוץ. עם זאת, באותו זמן, ריכוז כלורופיל במאגר החילוץ מוגברת (איור 1 פנימי), אשר לא נכלל כימות תוכן של phycobiliprotein נכונה.
הזמן האופטימלי המגון היה המגון ס' 15 עבור שניהם קצרים (5 s) וארוך (20 s) תקופות סיפק מעט נמוך יותר phycobiliprotein בתשואות, כמוצג באיור2. Homogenizing התאים עם חרוזי זכוכית של קוטר של 2 מ מ הביאה התשואות הגבוהות ביותר בהשוואה עם חרוזי זכוכית של קוטר של 0.5 מ מ, מ מ 1 או 4 מ מ, עם חרוזי קריסטל של 0.5 מ מ קוטר, או עם גרגרי חול ים. המאגר החילוץ PBS נבחנה כמו המאגר אופטימלית לחילוץ phycobiliproteins (איור 3). התוספת של 100 מ מ NaCl או 150 מ מ אשלגן כלורי המאגר הציבורי או מים לא להגביר יעילות הפקת phycobiliprotein והלכתי זהה לשימוש 20 מ מ סודיום אצטט מאגר לחילוץ (איור 3). הזמן מיצוי אופטימלי phycobiliprotein היה 60 דקות כי, לאחר עוד זמן (עד 240 דקות), הריכוז phycobiliprotein במאגר החילוץ לא השתנה באופן משמעותי (איור 4).
אנו גם נבדק הטווח ליניאריות ספקטרופוטומטרים עבור המידה phycobiliprotein (איור 5), לעומת מספר משוואות phycobiliprotein כמת, באמצעות סטנדרטים הן phycocyanin והן allophycocyanin (איור 6). ספקטרופוטומטרים בשימוש פרוטוקול זה הראה מגוון ספיגת ליניארי בין 0.1 - 3.0 (איור 5). הספקטרום של החלבון לחלץ היו בליעה מקסימלית בסביבות 620 nm (620), ו- 652 nm, הספיגה (652) היה רק 33%620 (איור 7), ליניאריות ספקטרופוטומטרים עבור652 (מקסימום ספיגת allophycocyanin) נבחנה רק עד652 של 1.16. המשוואות (1) (2) של בנט, Bogorad12 מסופק על שחזור הטוב ביותר של תקני הן phycocyanin והן allophycocyanin בין כל נבדק משוואות (איור 6). סולפט סטרפטומיצין, נעשה שימוש במספר מחקרים קודמים עבור חיסול של קרום קטעים המכילים כלורופיל , הוצגה גם לא הכרחי על החילוץ (איור 7).
לניסוי נציג, Synechocystis היה מעובד photobioreactor25 המשטר turbidostat, שבו התאים היו מתוחזקים בשלב הצמיחה המעריכית בתוך טווח מוגדר של צפיפות אופטית (נמדד ב 680 nm, OD 680) על ידי לדילול מבוקר על ידי טיפוח טרי בינוני (buffered עם 17 מ"מ HEPES בינוני BG11)11,26. התרבויות היו מעובדים ב 32 ° C, האוויר קלט הכיל 0.5% CO2. התרבויות היו המוארת עם אור אדום (λמקסימום: 633 ננומטר, λ1/2: 20 ננומטר) של עוצמות של 25-1100 µmol (פוטונים) / (·s2מ'), יחד עם אור כחול (λמקסימום: 445 ננומטר, λ1/2: 20 ננומטר) של עוצמות של 25 µmol ( פוטונים) / (·s2מ'). הצפיפות האופטית של המתלה תרבות נמדדה על ידי הבסיס photobioreactor, והגדר טווח של יתר680 היה 0.52 - 0.58 (2 x 107 4 x 107 תאים/מ ל...). התרבויות היו מעובדות תחת כל עוצמת האור ספציפי לפחות 24 שעות לספק מספיק זמן להתאקלמות. כשמגיעים הצמיחה היציבות, התרבויות היו שנדגם לצורך משקל יבש (לפי השלבים 2.1-2.8 של פרוטוקול זה), ספירת תאים ותוכן phycocyanin ו- allophycocyanin. התוצאות של ההערכה phycobiliprotein תחת הגדלת עוצמות אור מוצגים באיור8. Synechocystis ירד התוכן phycobiliprotein מ 12% ממשקל יבש הסלולר (fg 505/תא) תחת irradiance הנמוך 3% של משקל יבש הסלולר (fg 280/תא) תחת irradiance הגבוהה.
איור 1 : השוואה של היעילות החילוץ של השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה עם מספר שיטות של אסמכתא. הריכוז של phycocyanin (קווים שחורים), allophycocyanin (ברים לבן) תמצית חלבון גולמי נמדדה לאחר החילוץ במאגר PBS במשך 60 דק שיטה א מתואר בתוך פרוטוקול זה. שיטת B שונה כדלקמן: לאחר הקטיף, התאים הם centrifuged (15,000 x g בטמפרטורת מעבדה במשך 5 דקות) ומאוחסן ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הדגימות קפוא היו sonicated תמורת 120 s ב 4 ° C, ו- phycobiliproteins את חולצו במאגר PBS במשך 60 דק בשיטת C שונה מן השיטה B על-ידי אחסון כדורי של תאים שנקטפו ב-80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ליופיליזציה כדורי הסלולר , הוספת חיץ PBS כדי כדורי יבש. D בשיטה שונה מצ'ונג ואח. 16: לאחר ליופיליזציה (אותו כמו שיטת C), 0.25 mL אצטט-נה עם 1% סטרפטומיצין סולפט מאגר (pH 5.5) נוספה בגדר הסלולר יבש, יחד עם 0.25 mL של זירקוניום חרוזים (בקוטר של 0.5 מ מ), ואת הדגימות היו הומוגני פעמיים 60 s ב- מהמגן. לאחר המגון, עוד 0.5 מיליליטר Na-אצטט עם 1% סטרפטומיצין סולפט מאגר (pH 5.5) נוספה המדגם, הצינורות היו vortexed, החלבונים חולצו על קרח במשך 30 דקות שיטת E כללה מחזור מפשיר הקפאה יחיד במאגר PBS ו מיצוי חלבונים במשך 24 שעות ביממה ב 4 º C. שיטת F (שיבוץ איור) כללה מחזורי אחד ושש להקפיא את התאים (בתחילה, הקפוא, resuspended במאגר PBS) בחנקן נוזלי, ואחריו sonication על קרח. עקב כלורופיל משמעותי נוכחות תמצית חלבון גולמי, phycobiliproteins וועדת בתוך שיטה פ מתוארים הערכים מייצגים ממוצעים של משכפל טכני שלוש, עם קווי השגיאה המייצג סטיות תקן. ריכוז פיגמנט חושבו לפי משוואות (1) ו- (2) של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : השפעת הזמן המגון על יעילות הפקת phycobiliprotein. כדורי lyophilized של תאים Synechocystis (על-פי השלבים 3.1-3.5 של פרוטוקול זה) היו משובשות עם חרוזי זכוכית על מהמגן עבור 5 s, 15 s, ו- 20 s. מתוארים הערכים מייצגים ממוצעים של משכפל טכני שלוש, עם קווי השגיאה המייצג סטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : Phycobiliprotein יעילות הפקת במאגרי חילוץ שונות. Phycobiliproteins חולצו במאגר PBS, בהמאגר הציבורי עם תוספת של 100 מ מ NaCl או 150 מ מ אשלגן כלורי, מים יונים עם 100 מ מ NaCl או 150 מ מ אשלגן כלורי, על פי Hemlata ו- Fareha22, וב -20 מ מ סודיום אצטט לפי צ'ונג ואח < / c4 >. 16. החילוץ בוצע ב 4 ° C על-פי השלבים 4.1-4.3 של פרוטוקול זה. מתוארים הערכים מייצגים ממוצעים של משכפל טכני שלוש, עם קווי השגיאה המייצג סטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : Phycobiliprotein יציבות במאגר החילוץ בזמן. לאחר הניתוח החילוץ, שבוצעה כמתואר בצעדים 4.1-4.3 של פרוטוקול זה, תמצית phycobiliprotein במאגר PBS (pH 7.4) היה מאוחסן ב 4 ° C עד 4 שעות, עם לא משמעותי phycocyanin (מעגלים) והשפלה allophycocyanin (ריבועים). הקו המקווקו מייצג את התאמת ליניארי של נקודות זמן מחושב בשיטת הריבועים הפחותים. מתוארים הערכים מייצגים ממוצעים של משכפל טכני שלוש, עם קווי השגיאה המייצג סטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : מדידות נציג של ריכוזים phycocyanin ו- allophycocyanin ב Synechocystis. השעיה תרבות צפוף (phycocyanin: 456 µg/mL, allophycocyanin: µg 106/mL) היה מדולל בהדרגה עד ריכוז של µg/mL 19 הן phycocyanin והן allophycocyanin. מתוארים הערכים מייצגים ממוצעים של משכפל טכני שלוש, עם קווי השגיאה המייצג סטיות תקן. הקו המנוקד מייצג את התאמת ליניארי של נקודות ריכוז מחושב בשיטת הריבועים הפחותים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : הערכה של phycocyanin ו- allophycocyanin ריכוזים של פיגמנטים סטנדרטים. התכנים של phycocyanin ושל allophycocyanin ברמת פיגמנט נמדדת spectrophotometrically על פי המשוואות של בנט, Bogorad12, Lüder et al. 13Sampath-ויילי, Neefus15, אוונס14, צ'ונג ואח. 16. תכולת החלבון בתקנים (כנדרש לקביעת phycobiliproteins) הייתה לכמת באמצעות פתרון של חומצה bicinchoninic, סודיום קרבונט, tartrate נתרן, סודיום ביקרבונט ב 0.1 N NaOH (עם סופי pH של 11.25), ב התגובה עם 4% (w/v) copper(II) חומצה גופרתית pentahydrate27, באמצעות אלבומין שור כמו חלבון סטנדרטית. המשוואות של בנט, Bogorad מספק שחזור הגבוהה של שני פיגמנטים: 96% של phycocyanin רגיל ו- 99% של allophycocyanin רגיל. מתוארים הערכים מייצגים ממוצעים של משכפל טכני שלוש, עם קווי השגיאה המייצג סטיות תקן. הקו המקווקו מסמן את הנקודה 100%. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7 : השפעת סטרפטומיצין סולפט על ספקטרום הבליעה של החלבון גולמי לחלץ במאגר PBS. (א) החילוץ ההליך כמתואר השלבים 4.1-4.3 של פרוטוקול או (B) באמצעות sonication כפי שמתואר במקרא של איור 1 עבור שיטת F בוצעה ב- PBS מאגר (מעגלים) וב -מאגר PBS בתוספת 1% סטרפטומיצין סולפט (ריבועים). כימות phycobiliprotein בוצעה על-פי השלבים 5.1-5.4 של פרוטוקול זה. מתוארים הערכים מייצגים ממוצעים של משכפל טכני שלוש, עם קווי השגיאה המייצג סטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8 : ריכוז של phycocyanin (מעגלים) ו allophycocyanin (ריבועים) ב- Synechocystis מעובדות תחת אור אדום-כתום של עוצמה של µmol(photons)/(m2·s) 25-1100. Synechocystis תרבויות היו טיפח של photobioreactor-32 מעלות צלזיוס, עם 0.5% CO2 באוויר קלט, BG11 טיפוח בינוני בתוספת 17 מ מ HEPES משטר turbidostat על פי Zavrel. et al. 11. phycobiliprotein הריכוזים נמדדו לפי פרוטוקול זה, התוכן phycobiliprotein הסופי היה מנורמל לפי משקל יבש הסלולר, כמתואר בסעיף 2 של פרוטוקול זה. קווים מקווקווים מייצגים את התאמת הכוח של נקודות מדודות, שחושב באמצעות שיטת הריבועים הפחותים. מתוארים הערכים מייצגים ממוצעים של משכפל טכני שלוש, עם קווי השגיאה המייצג סטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה, מהירה, לשחזור כימות של phycobiliprotein בתוכן מודל cyanobacterium Synechocystis. מספר שיטות תא המגון חלבון החילוץ, phycocyanin, allophycocyanin כמת מושווים, פרוטוקול הסופי מהווה שילוב של השלבים אופטימלית של כל נוהל בודדת. בתור נציג נתונים, התוכן של phycobiliproteins הייתה לכמת בתאים Synechocystis תחת הגדלת עוצמת האור. למרות הניתוח דורש זמן דומה וציוד מעבדה כמו חלק שיטות שפורסמו בעבר12,13,14,15,16, היתרון של פרוטוקול זה הוא יכול להיות מוערך כי אין כלורופיל שוחרר לתוך המאגר החילוץ ומדידה, לפיכך, את phycobiliprotein עם דיוק גבוהה.
הסכום של השעיה תא הנדרש לניתוח phycobiliprotein יכול להשתנות עם צפיפות תרבות. נפח דגימה של 1 מ"ל ממוטבת עבור תרבויות עם יתר730 של 1.5, צפיפות התאים של 2 x 107 תאים למ"ל, או עבור תרבויות עם תוכן phycobiliprotein של 20 מ ג/ל' במקרה של תרבויות מדולל, לקצור נפח גדול יותר של תרבות. מצד שני, במקרה של תרבויות צפופה, למסוק את תרבות נמוכה יותר נפח בתרבויות בצפיפות גבוהה, יש סכנה phycobiliproteins חלקית יישארו בתאים אחרי החילוץ. בדומה לכך, הסכום של השעיה תא הנדרש לקביעת משקל יבש יכול להשתנות עם צפיפות תרבות. נפח דגימה של 15 מ"ל ממוטב התרבויות עם יתר של730 של 1.5 או עם תא צפיפות של 2 x 107 תאים למ"ל. עם תרבויות צפיפות נמוכה יותר או עם אמצעי אחסון נמוך, באפשרותך להגדיל שגיאת המדידה. להפך, כרכים תרבות גדול או תרבויות צפופה לספק החלטות שיטה טובה יותר.
שלבים קריטיים של הפרוטוקול הם תא המגון ו phycobiliprotein החילוץ זה צריך לספק תפוקה גבוהה וספציפיות גבוהה. התשואות הגבוהה ביותר ואת הטוהר של תמציות עם חלבון המרבי בו זמנית שימור הושגה על ידי ליופיליזציה הדגימות homogenizing כדורי הסלולר יבש על ידי חרוזי זכוכית, מבצע החילוץ phycobiliprotein במאגר PBS ( איור 1). מאז אפילו של תמצית חלבון גולמי על ידי כלורופיל זיהום קטן יכול להוביל מופרזת תוכן phycobiliprotein, זה הכרחי למנוע כל כלורופיל חילוץ על ידי הוספת המאגר PBS. כלורופיל זוהה תמצית גולמי כאשר sonication שימש לשבירת תאים. כפי שמוצג שיבוץ איור 1, עם חוזרים sonication מחזורים, הכמות של כלורופיל תמצית גדל. מצד שני, הכמות שחולצו חלבונים (כפי שזיהה את ספיגת ב 280 ננומטר) גדל גם לאחר חוזר sonication מחזורים. לכן, השימוש sonication (בשילוב עם מפשיר הקפאה מחזורים של חנקן נוזלי) מופיע כשיטה המתאימה לחילוץ חלבון הכולל (חלבונים הן בחינם, ממברנה מכורך משתחררים מתאי); עם זאת, לא מומלץ לצורך כימות spectrophotometric phycobiliprotein. צ'ונג ואח. מומלץ השימוש של 1% סטרפטומיצין גופרתי כדי לחסל את קרום קטעים עם כלורופיל16. . כאן, השימוש סטרפטומיצין סולפט הופיע לא יהיה הכרחי, מאז זה לא הוביל לצמצום של כלורופיל תמצית חלבון (איור 7). אף-על-פי sonication יחיד מחזור 120 s לא הביאה את התאים בצורה יעילה (שיטות B ו- C, איור 1), שיטות אחרות (למשל, שיטה F כפי שהוצג באיור 1 או השיטות המוצגים באיור 7 ב) אישר ממצאים קודמים של sonication להיות יעיל תא הפרעה שיטת22,28. מצד שני, מחזורים פשוטים מפשיר הקפאה, דיווח גם בעבר בתור שיטה יעילה עבור חילוץ phycobiliproteins22,28, סיפק את התשואות הנמוך בבדיקות המתוארים כאן (שיטת E, איור 1 ). תא המגון (בתוך המאגר החילוץ, 2 x 60 s) על ידי זירקוניום חרוזים נבחנה כמו פחות יעילה מאשר המגון 15-s בגדר הסלולר הליחה (שיטת D, איור 1). ההליך המגון בתוך המאגר החילוץ תוארה בעבר עם הזמן (10 דקות) המגון עוד29. אנחנו לא מבחן המגון יותר מ 2 דקות מאז הדגימות התחמם באופן משמעותי במהלך כל מחזור המגון. בספרות, שיטות אחרות להפרעה תא. היו גם כמתואר לעיל, לרבות הניצול של העיתונות הצרפתית16 או griding13,15,30; עם זאת, שיטות כאלה לא נבדקו במחקר זה.
החילוץ חלבון בוצע עבור 15 s (איור 2) במאגר PBS. מאגר ה-pH היה 7.4, אשר היה בעבר כפי שדווח האופטימלי עבור חילוץ phycobiliprotein22. התוספת של NaCl או אשלגן כלורי לא לשפר את יעילות הפקת phycobiliprotein (איור 3), אשר סותר תצפיות הקודם22. עם זאת, כפי שמצוין באיור3, באגירה פוספט תמיסת כמו בשימוש פרוטוקול זה הכיל 154 מ מ NaCl (בנוסף HPO 5.6 מ מ נה24 2PO 1 מ מ ח'4), אשר אפשרו לנו להקים ללא NaCl PBS החילוץ מאגר כפקד. אנחנו גם ביחס PBS מאגר של סודיום אצטט מאגר16 החילוץ היעילות. השילוב של סודיום פוספט ואשלגן פוספט בתוך המאגר PBS מסופקים phycobiliproteins גבוהה מניבה (איור 3). ממצא זה התכתב עם הממצאים הקודמים של Hemlata et al. 22.
הפעם החילוץ phycobiliprotein היה אופטימיזציה עבור ה 1 חילוץ עוד לא הובלת לשיפור משמעותי phycobiliprotein השפלה או מיצוי (איור 4), אשר תאמו עבודתו הקודמת של לורנס ואח. 28. זמן החילוץ של קצרים יותר 1 h לא נבדקה. באופן דומה, חילוץ במשך יותר מ 4 שעות לא נבדקה מאז נמצא בעבר כי phycobiliproteins שחולצו במאגר פוספט הם יציבים במשך שעה לפחות 4828.
השווינו מספר משוואות של כימות phycocyanin ו allophycocyanin spectrophotometric כפי שתואר קודם לכן בספרות, על ידי חישוב מחדש את התוכן של שני phycobiliproteins בתקנים מסחרי עם חלבונים הידועים ריכוזי (איור 6). שחזור הטוב ביותר של שני פיגמנטים הושגה עם המשוואות של בנט, Bogorad12. תוצאה זו לא היה ספציפי פוספט מאגר חילוץ מאז מאגר כזה היה בשימוש בעבר12,13,15. זה היה גם ספציפית את הסטנדרטים פיגמנט מאז ההבדל בין615,618620 (אורכי גל המשמש להערכת phycocyanin בעבודות קודמות) phycocyanin רגיל היה 1% לההבדל בין 650 ,652 (אורכי גל שימשו בעבר allophycocyanin שערוך12,13,14,16) allophycocyanin רגיל היה 3%. באופן דומה, ההבדל בין615 620 תמצית חלבון Synechocystis היה רק 2%. הבדלים קטנים כאלה ספקטרום בליעה לא יכול לגרום וריאציה פיגמנט הסופי של עד 36% (איור 6). לכן, ההבדלים בין המשוואות בודדים היו מחוברים מעדיף וריאציות phycobiliprotein הכחדה המקדמים של אורגניזמים ספציפיות12,13,14, 15 , 16 , 17. מעניין, את המשוואות של צ'ונג ואח. מספק שחזור phycocyanin הנמוך (איור 6) למרות המחברים משמש גם Synechocystis שלהם ניסויים16.
במקום הקביעה של אורכי גל יחיד, מומלץ למדוד את ספקטרום רציף של תמצית phycobiliprotein בין 280-720 ננומטר, כדי להעריך את הנוכחות של כלורופיל תמצית, אשר עלולה להפריע שניהם allophycocyanin, phycocyanin הספיגה. יתר על כן, על ידי מדידת את ספיגת ב 280 ננומטר (280), טוהר של21,phycocyanin (615/A280 או /A620280)22 וגם allophycocyanin (652/A280) יכול להיות מוערך 24 בתוך התמצית (0.7: מזון כיתה, 3.9: כיתה תגובתי, > 4.0: כיתה אנליטית)21.
בתור נציג נתונים, נקבע ריכוז הן phycocyanin והן allophycocyanin, Synechocystis תחת הגדלת עוצמת האור. שמירה על צפיפות תרבות ברמה קבועה בתוך משטר טיפוח turbidostat11,21 היה חיוני לניסוי השוואתי ישירה. ריכוז phycocyanin ו- allophycocyanin של 2.4% 10.2% ו- 0.6% - 1.7% של משקל יבש הסלולר, בהתאמה, היו דומות כמו ערכים שדווחה בעבר31,11,, או32 כמו כן, הבסיס לכל תא phycobiliprotein התוכן היה דומה כפי שדווח בעבר11,33. עם האור גובר, התוכן phycobiliproteins ירד. מעניין, אפילו תחת עוצמת האור הגבוהה של 1100 µmol (פוטונים) / (ז2·s), phycobiliproteins לא היו לגמרי מולבן.
כיוון הפרוטוקול דורש ציוד סטנדרטי רק מהיר יחסית, זה יכול להיות בקלות אימצה במעבדה כלשהי שבה phycobiliproteins מנותחים באופן שגרתי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
הפרוטוקול אומצה מן הפרסום הקודם11. ט Č צ, ד בח י. נתמכו על-ידי משרד החינוך, נוער וספורט של הרפובליקה הצ'כית במסגרת התכנית הלאומית הקיימות אני (NPU אני), להעניק LO1415 מספר. ג'יי Č. גם נתמך על ידי GA CR, גרנט מספר 18-24397S. לגישת מכשירים ומתקנים אחרים נתמכה על ידי תשתיות מחקר הצ'כי ביולוגיה מערכתית C4SYS (פרויקט אין LM2015055). מ א ס נתמך על ידי מענק של קרן המדע הרוסי [מס 14-14-00904].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | Institut Pasteur, Paris, France | 6803 | Cyanobacterium strain |
| Roti-CELL PBS | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 9143.1 | Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4 |
| Eppendorf safe-lock tubes | Eppendorf, Hamburk, Germany | 30120086 | Safe-lock tubes 1.5 ml |
| VWR 80-Place Storage System | VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA | 30128-282 | Holder for safe-lock tubes |
| RAININ 100 µl -1000 µl | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 17014382 | Pipette |
| GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8 | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 30389272 | Pipette tips |
| Rotina 420R | Hettich, Kirchlengern, Germany | 4701 | Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes |
| LCexv 4010 | Liebherr, Bulle, Switzerland | 9005382197172 | Refrigerator and freezer -20 °C |
| Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | EXF24086V | Freezer -80 °C |
| CoolSafe | LaboGene, Lillerød, Denmark | 7.001.000.615 | Freeze dryer |
| UV-2600 | Shimadzu, Kyoto, Japan | UV-2600 | Spectrophotometer |
| Hellma absorption cuvettes, semi Micro | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z600288 | VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm |
| Silamat S6 | Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein | 602286WU | Homogenizer |
| Solid-glass beads | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z273627 | Glass bead of the diameter 2 mm |
| CPA225D-0CE | Sartorius AG, Göttingen, Germany | SECURA225D-1OBR | Analytical balances |
| C-Phycocyanin from Spirulina sp. | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P2172 | Phycocyanin standard |
| Allophycocyanin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | A7472 | Allophycocyanin standard |
| Bicinchoninic Acid Kit | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | BCA1, B9643 | Complete kit for total proteins determination |
| AlgaeTron | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | AG 130-ECO | Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere |
| Photobioreactor | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | FMT-150 | Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment |
| Cellometer | Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA | Auto M10 | Cell counter |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS430791 | 15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling |
| Herasafe KS | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 51024579 | Laminar flow hood |
References
- Mimuro, M., Kikuchi, H. Antenna Systems and Energy Transfer in Cyanophyta and Rhodophyta. Light-Harvesting Antennas in Photosynthesis. Green, B. R., Parson, W. W. , Springer. Dordrecht, The Netherlands. 281-306 (2003).
- Spear-bernstein, L., Miller, K. R. Unique location of the phycobiliprotein light-harvesting pigment in the Cryptophyceae. Journal of Phycology. 25 (3), 412-419 (1989).
- Kirst, H., Formighieri, C., Melis, A. Maximizing photosynthetic efficiency and culture productivity in cyanobacteria upon minimizing the phycobilisome light-harvesting antenna size. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1837 (10), 1653-1664 (2014).
- Page, L. E., Liberton, M., Pakrasi, H. B. Reduction of photoautotrophic productivity in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 by phycobilisome antenna truncation. Applied and Environmental Microbiology. 78 (17), 6349-6351 (2012).
- Sonani, R. R. Recent advances in production, purification and applications of phycobiliproteins. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 100 (2016).
- Bryant, D. A. The Molecular Biology of Cyanobacteria. , Springer Netherlands. Dordrecht, The Netherlands. (1994).
- Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. I. Sequence features in the 1 Mb region from map positions 64% to 92% of the genome. DNA Research. 2, 191-198 (1995).
- Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. II. Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein-coding regions. DNA Research. 3, 109-136 (1996).
- Grigorieva, G., Shestakov, S. Transformation in the cyanobacterium Synechocystis sp 6803. FEMS Microbiology Letters. 13 (4), 367-370 (1982).
- Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp: PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), (2015).
- Zavřel, T., Očenášová, P., Červený, J. Phenotypic characterization of Synechocystis sp. PCC 6803 substrains reveals differences in sensitivity to abiotic stress. PLoS One. 12 (12), e0189130 (2017).
- Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaption in a filamentous blue-green alga. The Journal of Cell Biology. 58, 419-435 (1973).
- Lüder, U. H., Knoetzel, J., Wiencke, C. Acclimation of photosynthesis and pigments to seasonally changing light conditions in the endemic antarctic red macroalga Palmaria decipiens. Polar Biology. 24 (8), 598-603 (2001).
- Evans, L. V. The effects of spectral composition and irradiance level on pigment levels in seaweeds. Experimental Phycology: A Laboratory Manual. Lobban, C. S., Chapman, D. J., Kremer, B. P. , Cambridge University Press. Cambridge, New York, New Rochelle, Melbourne, Sydney. 123-133 (1988).
- Sampath-Wiley, P., Neefus, C. D. An improved method for estimating R-phycoerythrin and R-phycocyanin contents from crude aqueous extracts of Porphyra (Bangiales, Rhodophyta). Journal of Applied Phycology. 19 (2), 123-129 (2007).
- Chung, Y. H., Park, Y. M., Moon, Y. J., Lee, E. M., Choi, J. S. Photokinesis of Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Photoscience. 11 (3), 89-94 (2004).
- Sun, L., et al. Phycobilisomes from Cyanobacteria. Handbook on Cyanobacteria: Biochemistry, Biotechnology and Applications. Gault, P. M., Marler, H. J. , Nova Science Publishers, Inc. New York, NY. 105-160 (2009).
- Six, C., et al. Diversity and evolution of phycobilisomes in marine Synechococcus spp.: A comparative genomics study. Genome Biology. 8 (12), (2007).
- Sinetova, M. A., Červený, J., Zavřel, T., Nedbal, L. On the dynamics and constraints of batch culture growth of the cyanobacterium Cyanothece sp. ATCC 51142. Journal of Biotechnology. 162 (1), (2012).
- Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, M., Cohen-Bazire, G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacteriological Reviews. 35 (2), 171-205 (1971).
- Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), 122-132 (2015).
- Hemlata, G., Fareha, B. Studies on Anabaena sp. nccu-9 with special reference to phycocyanin. Journal of Algal Biomass Utilization. 2 (1), 30-51 (2011).
- Rito-Palomares, M., Nuez, L., Amador, D. Practical application of aqueous two-phase systems for the development of a prototype process for c-phycocyanin recovery from Spirulina maxima. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 76 (12), 1273-1280 (2001).
- Zhang, H., et al. Selenium-Containing Allophycocyanin Purified from Selenium-Enriched Spirulina platensis Attenuates AAPH-Induced Oxidative Stress in Human Erythrocytes through Inhibition of ROS Generation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (16), 8683-8690 (2011).
- Nedbal, L., Trtílek, M., Cervený, J., Komárek, O., Pakrasi, H. B. A photobioreactor system for precision cultivation of photoautotrophic microorganisms and for high-content analysis of suspension dynamics. Biotechnology and Bioengineering. 100 (5), 902-910 (2008).
- Zavřel, T., Knoop, H., Steuer, R., Jones, P. R., Červený, J., Trtílek, M. A quantitative evaluation of ethylene production in the recombinant cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 harboring the ethylene-forming enzyme by membrane inlet mass spectrometry. Bioresource Technology. 202, 142-151 (2016).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Lawrenz, E., Fedewa, E. J., Richardson, T. L. Extraction protocols for the quantification of phycobilins in aqueous phytoplankton extracts. Journal of Applied Phycology. 23 (5), 865-871 (2011).
- Lea-Smith, D. J., et al. Phycobilisome-Deficient Strains of Synechocystis sp. PCC 6803 Have Reduced Size and Require Carbon-Limiting Conditions to Exhibit Enhanced Productivity. Plant Physiology. 165 (2), 705-714 (2014).
- Seo, Y. C., et al. Stable isolation of phycocyanin from Spirulina platensis associated with high-pressure extraction process. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1778-1787 (2013).
- Touloupakis, E., Cicchi, B., Torzillo, G. A bioenergetic assessment of photosynthetic growth of Synechocystis sp. PCC 6803 in continuous cultures. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 133 (2015).
- Touloupakis, E., Cicchi, B., Benavides, A. M. S., Torzillo, G. Effect of high pH on growth of Synechocystis sp. PCC 6803 cultures and their contamination by golden algae (Poterioochromonas sp.). Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1333-1341 (2016).
- Ishii, A., Hihara, Y. An AbrB-Like Transcriptional Regulator, Sll0822, Is Essential for the Activation of Nitrogen-Regulated Genes in Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Physiology. 148 (1), 660-670 (2008).
