Summary
Vi præsenterer her, en protokol til at bestemme kvantitativt phycobiliprotein indhold i cyanobacterium Synechocystis ved hjælp af en Spektrofotometrisk metode. Ekstraktionsmetode blev også anvendt til andre cyanobakterier og alger stammer; på grund af variationer i pigment absorptionsspektre, er det imidlertid nødvendigt at teste de spektrofotometriske ligninger for hver stamme individuelt.
Abstract
Dette er en simpel protokol til kvantitativ bestemmelse af phycobiliprotein indhold i model cyanobacterium Synechocystis. Fykobiliproteiner er de vigtigste komponenter i phycobilisomes, de store lys-høst antenner i cyanobakterier og flere alger taxa. Phycobilisomes af Synechocystis indeholder to fykobiliproteiner: phycocyanin og allophycocyanin. Denne protokol beskriver en enkel, effektiv og pålidelig metode til kvantitativ bestemmelse af både phycocyanin og allophycocyanin i denne model cyanobacterium. Vi sammenlignede flere metoder til phycobiliprotein ekstraktion og spektrofotometrisk kvantificering. Ekstraktionsmetode som beskrevet i denne protokol blev også anvendt til andre cyanobakterier stammer som Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., og stenflader sp., samt om rødalger Porphyridium cruentum. Men udryddelse koefficienter af specifikke fykobiliproteiner fra forskellige taxa kan variere og det anbefales derfor, at validere metoden spektrofotometriske kvantificering for hver enkelt stamme individuelt. Protokollen kræver lidt tid og kan udføres i alle standard life science laboratorier, da det kræver kun standard udstyr.
Introduction
fPhycobiliproteins er vandopløselige pigment-protein komplekser, der udgør væsentlige bestanddele af de lys-høst antenner i prokaryote cyanobakterier (Cyanophyta) og flere eukaryote taxa (Glaucophyta, Rhodophyta , og Cryptophyta)1. De opstår hovedsagelig som Supramolekylær komplekser kaldes phycobilisomes og de er typisk knyttet til overfladen af de fotosyntetiske membraner i stromale side, med undtagelse af Cryptophyta, hvor fykobiliproteiner er lokaliseret i den tylakoid lumen2. Fire typer af fykobiliproteiner er blevet identificeret op til dato: core allophycocyanin og den perifere phycocyanin, phycoerythrin og phycoerythrocyanin1. Som de vigtigste lys-høst komplekser repræsenterer phycobilisomes en af de afgørende faktorer for alger og cyanobakterier masse kulturer produktivitet. Det er blevet påvist, at phycobilisomes afkortning kan forbedre biomasse akkumulering under stærkt lys3. På den anden side under beskedne eller lav irradians resulterede antenne trunkering i vækst og biomasse ophobning reduktion3,4. Fykobiliproteiner bruges kommercielt som mad farvestoffer, lægemidler og tilsætningsstoffer i den kosmetiske industri, samt fluorescens sonder med programmer i flowcytometri, fluorescerende immunassays og Fluorescens mikroskopi5.
Denne protokol fokuserer på den kvantitative bestemmelse af fykobiliproteiner i model cyanobacterium Synechocystis. Cyanobakterier er de tidligste iltdannende fotosyntetiske autotrofer; de har danner Jordens biosfære for mere end 2,4 milliarder år6. De spiller en afgørende rolle i globale biogeokemiske kredsløb af kvælstof, kulstof, ilt og andre elementer. Blandt cyanobakterier, en encellet stamme Synechocystis fik en unik position, da det var den første cyanobacterium med det hele genom sekventeret7,8, det er naturligvis udklappelige af eksogene DNA9, og det udfører stabilt og relativt hurtig vækst10,11. I Synechocystis, antenne kernekomponenter, allophycocyanin, er forbundet med integreret Membranproteiner, og de vedlagte phycocyanin ligger på tylakoid membran periferien.
Flere metoder til phycobiliprotein udvinding og kvantificering er sammenlignet i denne protokol. Den endelige ekstraktionsmetode blev anvendt til Synechocystissamt til andre stammer, cyanobakterier, herunder Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira SP., og stenflader sp., og det var også med held anvendes til rødalger Porphyridium cruentum. Metoden udviklet i denne protokol kan derfor betragtes som en universel metode til phycobiliprotein udvinding. Selv om nogle af de testede udvindingsmetoder resulterede i højere total protein udbytter, her beskrevne ekstraktionsmetode forudsat det højeste phycobiliprotein giver sammen med det laveste indhold af klorofyl en rest i den phycobiliprotein ekstrakt. At reducere indholdet af klorofyl en var afgørende for den korrekte phycocyanin og allophycocyanin spektrofotometriske kvantificering.
Absorptionsspektra phycobiliprotein kan variere betydeligt mellem forskellige alger og cyanobakterier arter12,13,14,15,16,17 og endda blandt flere stammer af en enkelt cyanobakterier slægten18. Derfor er bestemte bølgelængder og absorption koefficienter som anvendes til bestemmelse af phycocyanin og allophycocyanin i Synechocystis ikke generelt gælder for andre stammer. Derudover indeholder Synechocystis ikke phycoerythrin og phycoerythrocyanin, der findes i nogle andre alger og cyanobakterier. Med henblik på bestemmelse af fykobiliproteiner i stammer end Synechocystisanbefales det at evaluere de spektrofotometriske ligninger for hver stamme individuelt.
Selv om protokollen indeholder to længere skridt (natten frysetørring af cellulære pellets og 1 times protein udvinding), er den samlede arbejdsmængde tid til fykobiliproteiner kvantificering ikke længere end 2 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cyanobakterier dyrkning
- Dyrke Synechocystis celler i Erlenmeyerkolben kolber eller i photobioreactors10,19 i "buffered" BG11 medium20 at fastholde en pH på < 10 (f.eks.ved hjælp af 17 mM HEPES10).
Bemærk: Standard dyrkning betingelser kræver en kontrolleret temperatur (typisk 30 ° C, den optimale temperatur er 35 ° C)21, belysning (typisk et hvidt lys med en intensitet op til 800 µmol [fotoner] / [m2·s])21, og en CO 2 levering (i 400-mL beboelse-bedømmelseskomite photobioreactor, væksten mætte CO2 koncentration er 1.700 ppm)21. - Bestem kultur tæthed, måle kultur ekstinktionen spektrofotometrisk på 730 nm (OD730) ved hjælp af en kuvette med en lys sti på 1 cm. Alternativt kan tælle celler under mikroskop ved hjælp af en hemocytometer eller en automatiseret celle Counter.
2. prøver forberedelse
- Arbejde under lav irradians at forhindre forringelse af phycobiliprotein.
- Høste 3 x 1 mL af kultur suspension til sikker-lock rør. Bruge tre til vurdering af tekniske fejl i målingen. For at udføre kultur prøvetagning under sterile forhold, høste celler i en laminar hætte og følg de rette orden og sikkerhed praksis.
- Der centrifugeres celler på 15.000 x g laboratorium temperatur i 5 min. være opmærksomme på ordentligt afbalanceret centrifugerotoren. Efter centrifugering, slette analysere. Sørg for ikke at forstyrre pelleten.
- Sætte prøverne i en fryser. Til langtidsopbevaring, holde prøverne ved-80 ° C. Dette er nødvendigt for at forhindre forringelse af phycobiliprotein. For kortvarig oplagring er-20 ° C tilstrækkeligt.
- Frysetørre prøverne natten over. For en ordentlig freeze-drying, holde temperaturen af fryse-tørretumbler kondensator-60 ° c og trykket i fryse-tørretumbler kammer omkring 1 hPa.
- Efter endt freeze-drying cyklus, lukke røret så snart som muligt at forhindre reabsorption af vand fra luften.
3. celle homogenisering og pigmenter udvinding
- Tilføje fire stykker af glasperler (med en diameter på 2 mm) til hvert prøveglas og lukke rør.
Bemærk: Når låget af sikker-lock røret bruges til homogenisering er for tyndt, kan det bryde under homogenisering; Derfor anbefales kun sikker-lock rør med stærk låg til denne protokol. - Homogeniseres prøver med glasperler til 15 s på et homogeniseringsapparat laboratorium temperatur.
Bemærk: En korrekt homogeniserede prøve er spredt over hele indersiden af sikker-lock rør. - Der tilsættes 1 mL PBS buffer (pH 7,4), forkølede til 4 ° C, og prøver for at udtrække fykobiliproteiner.
Bemærk: Fra dette trin på, holde prøver på isen for at forhindre forringelse af de udvundne proteiner. Dette er kritisk. - Bland prøverne med PBS for 5 s på homogeniseringsapparat laboratorium temperatur.
Bemærk: Efter blanding, prøverne er grønlig. - Efter blanding, holde prøver på is for 60 min. dække iskarret med et låg til at forhindre forringelse af pigmenter.
- Efter 60 min i phycobiliprotein Origin, centrifugeres prøver på 15.000 x g ved 4 ° C i 5 min. være opmærksom på korrekt balance af centrifugerotoren.
Bemærk: Efter centrifugering, supernatanten har en cyan blå farve.
4. Phycobiliprotein kvantificering
- Før spektrofotometrisk måling, kalibrere Spektrofotometer til grundlinjen ved hjælp af PBS-buffer som en tomme.
- Når spektrofotometrets er kalibreret, kassere PBS fra et spektrofotometer kuvette og afpipetteres supernatanten med udpakkede fykobiliproteiner i stedet for med den kasserede buffer.
- Kvantificere phycobiliprotein koncentration spektrofotometrisk, ved hjælp af en slit bredde på 0,5 nm.
- Absorbansen måles af phycocyanobilins i phycocyanin og allophycocyanin mod PBS buffer Tom på 615 nm (en615) og 652 nm (en652), henholdsvis, og måler absorbansen af celleaffald på 720 nm (en720).
- Beregne koncentrationen af phycocyanin og allophycocyanin ifølge ligninger (1) og (2) af Bennett og Bogorad12:
Bemærk: En615, en652og en720 skal passe til den lineære absorbans vifte af spektrofotometret. Om nødvendigt, fortyndes prøven med PBS buffer.
- Genberegne pigment koncentration i de oprindelige prøver. Pigment koncentration i stikprøven svarer direkte med resultaterne af ligninger (1) og (2) når 1 mL af kultur og 1 mL af ekstraktionsbuffer anvendes i analysen. Ved hjælp af forskellige mængder af cyanobakterier prøver og/eller PBS buffer, bør den endelige pigment koncentration beregnes efter ligning (3):
(3)
Bemærk: I tilfælde af en normalisere phycobiliprotein indhold pr. celle tørvægt, den endelige pigment koncentration bør beregnes efter ligning (4)
(4)
(3)
(4)5. bestemmelse af celle tørvægt (valgfri)
- Veje tre tomme sikker-lock rør på analytisk saldi.
Forsigtig: Det er afgørende, at sikker-lock rør er tør. I tilfælde af lagring af tørre rør i et vådt miljø, rør i flere timer i en fastfrysning tørretumbler før vejning dem. Manipulere rør forsigtigt og kun med pudderfrie behandskede hænder til at undgå enhver kontakt mellem materialet og forskerens fingre. Holde alle indehavere og centrifugeres ren for at undgå overførsel af materiale til rør. - Prøve 1 x 15 mL af kultur suspension til 15 mL konisk slange.
- Der centrifugeres kultur suspension i 15 mL konisk rør på 4.000 x g laboratorium temperatur i 10 min. Balance af centrifugerotoren med tre yderligere 15 mL konisk rør, hvert indeholdende 15 mL vand. Efter centrifugering, slette 12 mL af supernatanten.
- Resuspenderes i de resterende supernatanten og overføre 3 x 1 mL af blandingen til tre 1,5 mL sikker-lock rør med en pipette. I tilfælde af at nogle rester af toerstoffet forbliver i 15 mL konisk tube, tilføje 1,5 mL deioniseret vand til koniske rør, vortex eller ryste tube til resuspend de resterende pellet, og overføre 3 x 0,5 mL af blandingen til tre 1,5 mL sikker-lock rør (allerede containi NG 3 x 1 mL af toerstoffet) med en pipette.
Bemærk: Dividere pellet over tre 1,5 mL sikker-lock rør vil tillade vurdering af eventuelle tekniske fejl af tørvægt måling. - Der centrifugeres celler i 1,5 mL sikker-lock rør på 15.000 x g laboratorium temperatur i 5 min. Balance centrifugerotoren med en ekstra 1,5 mL sikker-lock tube, som indeholder 1 mL vand. Efter centrifugering, slette analysere.
- Sætte prøverne i fryseren. Til langtidsopbevaring, holde prøverne ved-80 ° C; til kortvarig lagring er-20 ° C tilstrækkelig.
- Frysetørre prøverne natten over. For en ordentlig freeze-drying, holde temperaturen af fastfrysning tørretumbler kondensator-90 ° c og trykket i fryse-tørretumbler kammer omkring 1 hPa.
- Efter frysetørring, lukke rør og vejer prøverne på analytisk saldi.
Bemærk: Tørvægt værdi kan anvendes til normalisering af phycobiliprotein indhold pr. celle tørvægt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For de oprindelige metode tests, Synechocystis blev dyrket som batch kulturer i Erlenmeyerkolben kolber på en shaker i BG11 dyrkning medium20 (suppleret med 17 mM HEPES) på 25 ° C, under et varmt hvidt lys med en intensitet på 50 µmol (fotoner) / (m 2·s) og med 1% CO2 i de dyrkningsbaserede atmosfære. Under dyrkning, kulturer var udtaget til sikker-lock rør og centrifugeres (15.000 x g laboratorium temperatur i 5 min), supernatanten blev kasseret, og prøverne var enten opbevares ved-80 ° C og frysetørrede som forberedelse til den enkelte trin af denne protokol eller opbevares ved-20 ° C eller-80 ° C for sammenlignende udvinding og kvantificeringer analyse.
De testede ekstraktion procedurer inkluderet celle forstyrrelser ved hjælp af sonikering, homogenisering med zirconia perler i PBS buffer og fryse-optøning. Resultaterne af forskellige udvindingsmetoder er sammenfattet i figur 1. Metoden som beskrevet i denne protokol omhandlede den højeste fykobiliproteiner udbytter sammen med den laveste klorofyl en forurening i ekstraktionsbuffer. Klorofyl en blev opdaget i ekstraktionsbuffer når sonikering blev brugt til celle forstyrrelser. Gentagne cyklusser af nedfrysning og optøning prøver i en ultralyd bad på is resulterede i højere protein udbytterne i ekstraktionsbuffer. Men på samme tid, koncentrationen af klorofyl en i ekstraktionsbuffer øget (figur 1 inset), som udelukket en ordentlig phycobiliprotein indhold kvantificering.
Den optimale homogenisering tid var 15 s. homogenisering for både kortere (5 s) og længere (20 s) perioder givet lidt lavere phycobiliprotein udbyttet, som vist i figur 2. Homogenisering celler med glasperler med en diameter på 2 mm resulteret i det højeste udbytte sammenlignet med glasperler med en diameter på 0,5 mm, 1 mm eller 4 mm, med zirconia perler af 0,5 mm diameter, eller sea sand korn. PBS ekstraktionsbuffer blev testet som den optimale buffer til fykobiliproteiner udvinding (figur 3). Tilsætning af 100 mM NaCl eller 150 mM KCl til PBS buffer eller til vandet steg ikke ekstraktionseffektivitet af phycobiliprotein, og det samme gik til at bruge 20 mM natrium acetat buffer for udvinding (figur 3). Optimal phycobiliprotein udvinding tid var 60 minutter, fordi efter længere tid (op til 240 minutter), koncentrationen af phycobiliprotein i ekstraktionsbuffer ikke ændre betydeligt (figur 4).
Vi har også testet Spektrofotometer linearitet interval for phycobiliprotein måling (figur 5) og sammenlignet flere ligninger for phycobiliprotein kvantificering, ved hjælp af både phycocyanin og allophycocyanin standarder (figur 6). Spektrofotometeret bruges i denne protokol viste en lineær absorbans ligger mellem 0,1 - 3.0 (figur 5). Da spektre af protein extract havde sin maksimale absorption omkring 620 nm (en620), og på 652 nm, absorption (en652) var kun 33% af en620 (figur 7), Spektrofotometer linearitet for en652 (maks. allophycocyanin absorbans) blev testet kun op til en652 af 1.16. Ligninger (1) og (2) af Bennett og Bogorad12 bedste genopbygningen af både phycocyanin og allophycocyanin standarder blandt alle testede ligninger (figur 6). Streptomycin sulfat, brugt i adskillige tidligere undersøgelser for afskaffelse af membran fragmenter der indeholder klorofyl en, var vist ikke nødvendige til udvinding (figur 7).
For den repræsentative eksperiment, Synechocystis blev dyrket i en photobioreactor25 i et turbidostat regime, hvor cellerne blev opretholdt i eksponentiel vækstfase inden for et angivent interval af optisk densitet (målt på 680 nm, OD 680) af en kontrolleret fortynding af en frisk dyrkning medium (BG11 medie bufferet med 17 mM HEPES)11,26. Kulturer blev dyrket ved 32 ° C og den indgående luft indeholdt 0,5% CO2. Kulturerne var oplyst med et rødt lys (λmax: 633 nm, λ1/2: 20 nm) af en intensitet af 25-1100 µmol (fotoner) / (m2·s), sammen med et blåt lys (λmax: 445 nm, λ1/2: 20 nm) af en intensitet af 25 () µmol fotoner) / (m2·s). Ekstinktionen af kultur suspension blev målt ved photobioreactor base, og den vifte af OD680 blev sat til 0,52 - 0,58 (2 x 107 til 4 x 107 celler/mL). Kulturer blev dyrket under hver specifikke lysintensiteten i mindst 24 timer for at give tilstrækkelig tid til akklimatisering. Efter at nå vækst stabilitet, var kulturer udtaget til tørvægt (ifølge trin 2.1-2.8 af denne protokol), celletal og phycocyanin og allophycocyanin indhold. Resultaterne af phycobiliprotein evalueringen under stigende lys intensitet er vist i figur 8. Synechocystis faldt phycobiliprotein indhold fra 12% af cellulære tørvægt (505 fg/celle) under den laveste irradians til 3% af cellulære tørvægt (280 fg/celle) under den højeste irradians.
Figur 1 : Sammenligning af ekstraktionseffektivitet af metoden beskrevet i denne protokol med flere referencemetoder. Koncentrationen af phycocyanin (sorte bjælker) og allophycocyanin (hvide barer) i råprotein ekstrakt blev målt efter udvinding i PBS buffer for 60 min. metode A er beskrevet i denne protokol. Metode B blev ændret som følger: efter høst, var cellerne centrifugeres (15.000 x g laboratorium temperatur i 5 min) og opbevares ved-20 ° C natten over. De frosne prøver blev sonicated for 120 s ved 4 ° C, og fykobiliproteiner blev udvundet i PBS buffer for 60 min. metode C blev ændret fra metode B ved at gemme pellets af høstede celler ved-80 ° C i 30 min, frysetørring cellulære pellets , og tilføje PBS buffer til de tørre pellets. Metode D blev ændret fra Chung mfl. 16: efter Frysetørring (samme som i metoden C), 0,25 mL af Na-acetat med 1% streptomycin sulfat buffer (pH 5,5) blev føjet til den tørre cellulære pellet, sammen med 0,25 mL af zirconium perler (med en diameter på 0,5 mm), og prøverne blev homogeniseret to gange for 60 s på homogeniseringsapparat. Efter homogenisering, en anden 0,5 mL af Na-acetat med 1% streptomycin sulfat buffer (pH 5,5) blev føjet til prøven, rørene var vortexed, og proteiner blev udtrukket på isen for 30 min. metode E bestod af en enkelt frysning-optøning cyklus i PBS buffer og protein udvinding i 24 timer ved 4 ° C. Metode F (inset figur) bestod af én og seks cyklusser af nedfrysning celler (i første omgang, frysetørres og genopslemmes i PBS buffer) i flydende kvælstof, efterfulgt af sonikering på is. På grund af betydelig klorofyl en tilstedeværelse i råprotein ekstrakt, var fykobiliproteiner ikke kvantificeret inden for metode F. De afbillede værdier repræsenterer gennemsnit fra tre tekniske replikater, med fejllinjer repræsenterer standardafvigelser. Pigment koncentrationer blev beregnet ligninger (1) og (2) af denne protokol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Effekt af homogenisering tid på ekstraktionseffektivitet phycobiliprotein. De frysetørrede pellets af Synechocystis celler (ifølge trin 3.1-3.5 af denne protokol) blev afbrudt med glasperler på homogeniseringsapparat for 5 s, 15 s, og 20 s. De afbillede værdier repræsenterer gennemsnit fra tre tekniske replikater, med fejllinjer repræsenterer standardafvigelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Phycobiliprotein ekstraktionseffektivitet i forskellige udvinding buffere. Fykobiliproteiner blev udvundet i PBS buffer, PBS buffer med et tillæg af 100 mM NaCl eller 150 mM KCl, deioniseret vand med 100 mM NaCl eller 150 mM KCl, ifølge Hemlata og Fareha-22, og 20 mM natriumacetat ifølge Chung mfl < / C4 >. 16. udvinding blev udført ved 4 ° C ifølge trin 4.1-4.3 i denne protokol. De afbillede værdier repræsenterer gennemsnit fra tre tekniske replikater, med fejllinjer repræsenterer standardafvigelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Phycobiliprotein stabilitet i ekstraktionsbuffer rettidigt. Efter den ekstraktionsmetode, udføres som beskrevet i trin 4.1-4.3 i denne protokol, var phycobiliprotein ekstrakt i PBS buffer (pH 7,4) opbevares ved 4 ° C i op til 4 timer, med ingen betydelig phycocyanin (cirkler) og allophycocyanin (firkanter) nedbrydning. Den stiplede linje repræsenterer den lineære fit tid punkter beregnes af de mindste kvadraters metode. De afbillede værdier repræsenterer gennemsnit fra tre tekniske replikater, med fejllinjer repræsenterer standardafvigelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Repræsentative målinger af phycocyanin og allophycocyanin koncentrationer i Synechocystis. En tæt kultur suspension (phycocyanin: 456 µg/mL, allophycocyanin: 106 µg/mL) var gradvist fortyndet til en koncentration på 19 µg/mL for både phycocyanin og allophycocyanin. De afbillede værdier repræsenterer gennemsnit fra tre tekniske replikater, med fejllinjer repræsenterer standardafvigelser. Den prikkede linje repræsenterer den lineære fit koncentration punkter beregnes af de mindste kvadraters metode. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Skøn over phycocyanin og allophycocyanin koncentrationer i pigmenter standarder. Indholdet af phycocyanin og allophycocyanin i pigment standarder var måles spektrofotometrisk ifølge ligninger af Bennett og Bogorad12, Lüder mfl. 13, Peder-Wiley og Neefus15, Evans14og Chung mfl. 16. proteinindhold i standarder (som nødvendigt til fykobiliproteiner bestemmelse) var kvantificeres ved hjælp af en opløsning af bicinchoninic acid, natriumcarbonat, natrium tartrat og natriumbikarbonat i 0,1 N NaOH (med et slut-pH på 11,25), i reaktion med 4% (w/v) copper(II) sulfat pentahydrat27, ved hjælp af bovint serumalbumin som en standard protein. Ligninger af Bennett og Bogorad omhandlede den højeste genopbygning af begge pigmenter: 96% af phycocyanin standard og 99% af allophycocyanin standard. De afbillede værdier repræsenterer gennemsnit fra tre tekniske replikater, med fejllinjer repræsenterer standardafvigelser. Den stiplede linje fremhæver 100%-point. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Effekten af streptomycin sulfat på absorptionsspektrum af den råprotein ekstrakt i PBS buffer. (A) udvinding procedure som beskrevet i trin 4.1-4.3 af denne protokol eller (B) ved hjælp af sonikering som beskrevet i forklaringen af figur 1 til metode F blev udført i PBS buffer (cirkler) og PBS buffer suppleret med 1% streptomycin sulfat (firkanter). Phycobiliprotein kvantificering blev udført efter trin 5.1-5.4 af denne protokol. De afbillede værdier repræsenterer gennemsnit fra tre tekniske replikater, med fejllinjer repræsenterer standardafvigelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8 : Koncentrationen af phycocyanin (cirkler) og allophycocyanin (firkanter) i Synechocystis passes under rød-orange lys med en intensitet på 25-1100 µmol(photons)/(m2·s). Synechocystis kulturer blev dyrket i en photobioreactor ved 32 ° C, med 0,5% CO2 i luften input i BG11 dyrkning medium suppleret med 17 mM HEPES i et turbidostat regime ifølge Zavrel et al. 11. phycobiliprotein koncentrationer blev målt i henhold til denne protokol og den endelige phycobiliprotein indhold var normaliseret pr. cellulære tørvægt, som beskrevet i afsnit 2 i denne protokol. De stiplede linjer repræsenterer magt pasform af de målte punkter, beregnes af de mindste kvadraters metode. De afbillede værdier repræsenterer gennemsnit fra tre tekniske replikater, med fejllinjer repræsenterer standardafvigelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en enkel, hurtig og reproducerbar metode til kvantificering af phycobiliprotein indhold i model cyanobacterium Synechocystis. Flere metoder til celle homogenisering, protein udvinding og phycocyanin og allophycocyanin kvantificering sammenlignes, og den endelige protokol repræsenterer en kombination af de optimale skridt af hver enkelt procedure. Som repræsentative data, var indholdet af fykobiliproteiner kvantificeret i Synechocystis celler under stigende lysintensitet. Selvom analysen kræver lignende tid og laboratorieudstyr som nogle af de tidligere udgivne metoder12,13,14,15,16, er fordelen ved denne protokol at ingen klorofyl en frigives i ekstraktionsbuffer og således phycobiliprotein måling kan estimeres med høj præcision.
Mængden af cellesuspension kræves for phycobiliprotein analyse kan variere med kultur tæthed. Sample volumen på 1 mL er optimeret til kulturer med en OD730 1,5, en celle massefylde på ca 2 x 107 celler/mL eller kulturer med en phycobiliprotein indhold af ca 20 mg/L. Ved fortyndede kulturer, høste en større kultur volumen. Til gengæld for tætte kulturer, høste en lavere kultur volumen i high-density kulturer, der er en risiko for, at fykobiliproteiner delvist forbliver i cellerne efter udvinding. På samme måde, mængden af cellesuspension kræves til tørvægt bestemmelse kan variere med kultur tæthed. Prøveudtagning volumen på 15 mL er optimeret til kulturer med en OD730 1,5 eller med en celle massefylde på ca 2 x 107 celler/mL. Med lavere massefylde kulturer eller med lavere mængder kan måling fejl forøges. Tværtimod giver større kultur diskenheder eller tættere kulturer bedre metode resolutioner.
Kritiske trin i protokollen er celle homogenisering og phycobiliprotein udvinding, der bør give højt udbytte og høj specificitet. Højeste udbytte og renhed af ekstrakter med samtidige maksimale protein bevarelse blev opnået ved frysetørring prøverne, homogenisering tør cellulære pellets af glasperler og udføre phycobiliprotein udvinding i PBS buffer ( Figur 1). Da selv en lille forurening af råprotein ekstrakt af klorofyl en kan føre til en phycobiliprotein indhold overvurdering, er det nødvendigt at undgå enhver klorofyl en ekstraktion ved at tilføje PBS buffer. Klorofyl en blev opdaget i den rå ekstrakt når sonikering blev brugt til celle forstyrrelser. Som vist i indsatser af figur 1, med gentagne sonikering cyklusser, mængden af klorofyl en i uddrag steg. På den anden side beløbet af udvundet proteiner (som registreret af absorbans ved 280 nm) også øget efter gentagne sonikering cyklusser. Derfor brugen af sonikering (i kombination med frysning-optøning cyklusser i flydende kvælstof) vises som en passende metode til total protein udvinding (både gratis og membran-bundet proteiner er frigivet fra cellerne); Det anbefales dog ikke at phycobiliprotein spektrofotometriske kvantificering. Chung mfl. Anbefalet brug af 1% streptomycin sulfat for at eliminere membran fragmenter med klorofyl en16. Her, syntes anvendelse af streptomycin sulfat ikke at være nødvendigt, da det ikke førte til en reduktion af klorofyl en i protein ekstrakt (figur 7). Selv om en enkelt sonikering cyklus for 120 s ikke forstyrre cellerne effektivt (metoder B og C, figur 1), andre metoder (fx, metode F som præsenteret i figur 1 eller de metoder, der er præsenteret i figur 7B) bekræftede tidligere resultater af sonikering at være en effektiv celle forstyrrelser metode22,28. På den anden side, forudsat enkle frysning-optøning cyklusser, også tidligere rapporteret som en effektiv metode til fykobiliproteiner udvinding22,28, de laveste udbytterne i de beskrevne her prøver (metode E, figur 1 ). Celle homogenisering (inden for ekstraktionsbuffer, 2 x 60 s) af zirconium perler blev testet som mindre effektive end de 15-s homogenisering af den frysetørrede cellulære pellet (metode D, figur 1). Homogenisering proceduren inden for ekstraktionsbuffer var tidligere beskrevet med en længere homogenisering tid (10 min)29. Vi har ikke teste homogenisering i længere tid end 2 min siden prøverne opvarmes betydeligt i løbet af hver homogenisering cyklus. I litteraturen blev andre celle forstyrrelser metoder også beskrevet, herunder udnyttelse af en fransk presse16 eller griding13,15,30; imidlertid blev sådanne metoder ikke testet i denne undersøgelse.
Protein udvinding blev udført for 15 s (figur 2) i PBS buffer. Buffer pH var 7.4, som blev rapporteret tidligere som optimal for phycobiliprotein udvinding22. Tilsætning af NaCl og KCl ikke forbedre phycobiliprotein ekstraktionseffektivitet (figur 3), som modsige tidligere bemærkninger22. Men som angivet i figur 3, den fosfatbufferet saltopløsning, som anvendes i denne protokol indeholdt 154 mM NaCl (ud over 5,6 mM Na2HPO4 og 1 mM KH2PO4), der ikke tillod os at etablere den NaCl-fri PBS udvinding buffer som kontrol. Vi sammenlignede også PBS buffer og natrium acetat buffer16 udvinding effektivitetsgevinster. Kombinationen af natrium fosfat og kalium fosfat i PBS buffer fastsat højere fykobiliproteiner udbytter (figur 3). Denne konstatering svarede med de tidligere resultater af Hemlata mfl. 22.
Phycobiliprotein udvinding tid var optimeret til 1 h. længere udvinding ikke førte til betydelige phycobiliprotein nedbrydning eller udvinding forbedring (figur 4), som svarede med det tidligere arbejde, Lawrenz mfl. 28. en udvinding tid kortere end 1 h ikke blev testet. Ligeledes blev udvinding for mere end 4 h ikke testet, da tidligere blev det konstateret, at de udpakkede fykobiliproteiner i fosfat buffer er stabil i mindst 48 h28.
Vi sammenlignede flere ligninger af spektrofotometriske phycocyanin og allophycocyanin kvantificering som tidligere beskrevet i litteraturen, at genberegne indholdet af begge fykobiliproteiner i de forretningsmæssige standarder med kendte protein koncentrationer (figur 6). Den bedste genopbygning af begge pigmenter blev opnået med ligninger af Bennett og Bogorad12. Dette resultat var ikke specifik til fosfat ekstraktionsbuffer da sådan en buffer er blevet brugt tidligere12,13,15. Det var heller ikke specifikt for pigment standarder siden forskellen mellem en615, en618og en620 (bølgelængder bruges til phycocyanin estimering i tidligere værker) i phycocyanin standard var 1% og forskellen mellem en 650 en652 (bølgelængder tidligere anvendt til allophycocyanin skøn12,13,14,16) i allophycocyanin standard var 3%. På samme måde, forskellen mellem en615 og en620 i protein-ekstrakt af Synechocystis var kun 2%. Sådanne små forskelle i absorptionsspektre ikke kan resultere i en endelig pigment variation på op til 36% (figur 6). Derfor, forskellene mellem de enkelte ligninger var snarere forbundet med variationer i phycobiliprotein udryddelse koefficienter af specifikke organismer12,13,14, 15 , 16 , 17. det er interessant, ligningerne af Chung mfl. forudsat den laveste phycocyanin genopbygning (figur 6), selv om forfatterne også brugt Synechocystis til deres eksperimenter16.
I stedet for bestemmelse af enkelt bølgelængder, anbefales det at måle et kontinuert spektrum af phycobiliprotein ekstrakt mellem 280-720 nm, at vurdere tilstedeværelsen af klorofyl en i ekstrakt, som kan interferere med både de allophycocyanin og phycocyanin absorption. Desuden ved måling af absorbans ved 280 nm (en280), renhed af både phycocyanin (en615/A280 eller en620/A280)21,22 og allophycocyanin (280, en652af /A) 24 inden for ekstraktet kan skønnes (0,7: fødevaregodkendt, 3.9: reaktiv lønklasse, > 4.0: analysekvalitet)21.
Som repræsentative data, blev koncentrationen af både phycocyanin og allophycocyanin i Synechocystis fastsat under stigende lysintensitet. Fastholde den kultur på et konstant niveau inden for en turbidostat dyrkning regime11var,21 væsentlige for den direkte sammenlignende eksperiment. Phycocyanin og allophycocyanin koncentrationer af 2,4% - 10,2% og 0,6% - 1,7% af cellulære tørvægt, henholdsvis, blev lignende som tidligere rapporteret værdier11,31,32. Phycobiliprotein indhold pr. celle grundlag var også lignende som rapporteret tidligere11,33. Med den stigende lys faldt fykobiliproteiner indhold. Interessant, selv under de højeste lysintensitet af 1100 µmol (fotoner) / (m2·s), fykobiliproteiner var ikke helt bleget.
Da protokollen kræver kun standardudstyr og er relativt hurtigt, kan det nemt blive vedtaget på et laboratorium, hvor fykobiliproteiner analyseres rutinemæssigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Protokollen blev vedtaget fra en tidligere publikation11. T. Z., D. Ch. og J. C. blev støttet af Ministeriet for uddannelse, Ungdom og sport i Tjekkiet inden for den nationale bæredygtighed Program jeg (NPU jeg), give nummer LO1415. J. C. blev også støttet af GA CR, tilskud antallet 18-24397S. Adgang til instrumenter og andre faciliteter blev støttet af den tjekkiske forskningsinfrastruktur for Systembiologi C4SYS (projekt ingen LM2015055). M. A. S. blev støttet af en bevilling fra den russiske Science Foundation [nr. 14-14-00904].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | Institut Pasteur, Paris, France | 6803 | Cyanobacterium strain |
| Roti-CELL PBS | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 9143.1 | Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4 |
| Eppendorf safe-lock tubes | Eppendorf, Hamburk, Germany | 30120086 | Safe-lock tubes 1.5 ml |
| VWR 80-Place Storage System | VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA | 30128-282 | Holder for safe-lock tubes |
| RAININ 100 µl -1000 µl | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 17014382 | Pipette |
| GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8 | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 30389272 | Pipette tips |
| Rotina 420R | Hettich, Kirchlengern, Germany | 4701 | Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes |
| LCexv 4010 | Liebherr, Bulle, Switzerland | 9005382197172 | Refrigerator and freezer -20 °C |
| Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | EXF24086V | Freezer -80 °C |
| CoolSafe | LaboGene, Lillerød, Denmark | 7.001.000.615 | Freeze dryer |
| UV-2600 | Shimadzu, Kyoto, Japan | UV-2600 | Spectrophotometer |
| Hellma absorption cuvettes, semi Micro | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z600288 | VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm |
| Silamat S6 | Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein | 602286WU | Homogenizer |
| Solid-glass beads | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z273627 | Glass bead of the diameter 2 mm |
| CPA225D-0CE | Sartorius AG, Göttingen, Germany | SECURA225D-1OBR | Analytical balances |
| C-Phycocyanin from Spirulina sp. | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P2172 | Phycocyanin standard |
| Allophycocyanin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | A7472 | Allophycocyanin standard |
| Bicinchoninic Acid Kit | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | BCA1, B9643 | Complete kit for total proteins determination |
| AlgaeTron | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | AG 130-ECO | Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere |
| Photobioreactor | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | FMT-150 | Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment |
| Cellometer | Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA | Auto M10 | Cell counter |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS430791 | 15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling |
| Herasafe KS | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 51024579 | Laminar flow hood |
References
- Mimuro, M., Kikuchi, H. Antenna Systems and Energy Transfer in Cyanophyta and Rhodophyta. Light-Harvesting Antennas in Photosynthesis. Green, B. R., Parson, W. W. , Springer. Dordrecht, The Netherlands. 281-306 (2003).
- Spear-bernstein, L., Miller, K. R. Unique location of the phycobiliprotein light-harvesting pigment in the Cryptophyceae. Journal of Phycology. 25 (3), 412-419 (1989).
- Kirst, H., Formighieri, C., Melis, A. Maximizing photosynthetic efficiency and culture productivity in cyanobacteria upon minimizing the phycobilisome light-harvesting antenna size. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1837 (10), 1653-1664 (2014).
- Page, L. E., Liberton, M., Pakrasi, H. B. Reduction of photoautotrophic productivity in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 by phycobilisome antenna truncation. Applied and Environmental Microbiology. 78 (17), 6349-6351 (2012).
- Sonani, R. R. Recent advances in production, purification and applications of phycobiliproteins. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 100 (2016).
- Bryant, D. A. The Molecular Biology of Cyanobacteria. , Springer Netherlands. Dordrecht, The Netherlands. (1994).
- Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. I. Sequence features in the 1 Mb region from map positions 64% to 92% of the genome. DNA Research. 2, 191-198 (1995).
- Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. II. Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein-coding regions. DNA Research. 3, 109-136 (1996).
- Grigorieva, G., Shestakov, S. Transformation in the cyanobacterium Synechocystis sp 6803. FEMS Microbiology Letters. 13 (4), 367-370 (1982).
- Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp: PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), (2015).
- Zavřel, T., Očenášová, P., Červený, J. Phenotypic characterization of Synechocystis sp. PCC 6803 substrains reveals differences in sensitivity to abiotic stress. PLoS One. 12 (12), e0189130 (2017).
- Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaption in a filamentous blue-green alga. The Journal of Cell Biology. 58, 419-435 (1973).
- Lüder, U. H., Knoetzel, J., Wiencke, C. Acclimation of photosynthesis and pigments to seasonally changing light conditions in the endemic antarctic red macroalga Palmaria decipiens. Polar Biology. 24 (8), 598-603 (2001).
- Evans, L. V. The effects of spectral composition and irradiance level on pigment levels in seaweeds. Experimental Phycology: A Laboratory Manual. Lobban, C. S., Chapman, D. J., Kremer, B. P. , Cambridge University Press. Cambridge, New York, New Rochelle, Melbourne, Sydney. 123-133 (1988).
- Sampath-Wiley, P., Neefus, C. D. An improved method for estimating R-phycoerythrin and R-phycocyanin contents from crude aqueous extracts of Porphyra (Bangiales, Rhodophyta). Journal of Applied Phycology. 19 (2), 123-129 (2007).
- Chung, Y. H., Park, Y. M., Moon, Y. J., Lee, E. M., Choi, J. S. Photokinesis of Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Photoscience. 11 (3), 89-94 (2004).
- Sun, L., et al. Phycobilisomes from Cyanobacteria. Handbook on Cyanobacteria: Biochemistry, Biotechnology and Applications. Gault, P. M., Marler, H. J. , Nova Science Publishers, Inc. New York, NY. 105-160 (2009).
- Six, C., et al. Diversity and evolution of phycobilisomes in marine Synechococcus spp.: A comparative genomics study. Genome Biology. 8 (12), (2007).
- Sinetova, M. A., Červený, J., Zavřel, T., Nedbal, L. On the dynamics and constraints of batch culture growth of the cyanobacterium Cyanothece sp. ATCC 51142. Journal of Biotechnology. 162 (1), (2012).
- Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, M., Cohen-Bazire, G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacteriological Reviews. 35 (2), 171-205 (1971).
- Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), 122-132 (2015).
- Hemlata, G., Fareha, B. Studies on Anabaena sp. nccu-9 with special reference to phycocyanin. Journal of Algal Biomass Utilization. 2 (1), 30-51 (2011).
- Rito-Palomares, M., Nuez, L., Amador, D. Practical application of aqueous two-phase systems for the development of a prototype process for c-phycocyanin recovery from Spirulina maxima. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 76 (12), 1273-1280 (2001).
- Zhang, H., et al. Selenium-Containing Allophycocyanin Purified from Selenium-Enriched Spirulina platensis Attenuates AAPH-Induced Oxidative Stress in Human Erythrocytes through Inhibition of ROS Generation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (16), 8683-8690 (2011).
- Nedbal, L., Trtílek, M., Cervený, J., Komárek, O., Pakrasi, H. B. A photobioreactor system for precision cultivation of photoautotrophic microorganisms and for high-content analysis of suspension dynamics. Biotechnology and Bioengineering. 100 (5), 902-910 (2008).
- Zavřel, T., Knoop, H., Steuer, R., Jones, P. R., Červený, J., Trtílek, M. A quantitative evaluation of ethylene production in the recombinant cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 harboring the ethylene-forming enzyme by membrane inlet mass spectrometry. Bioresource Technology. 202, 142-151 (2016).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Lawrenz, E., Fedewa, E. J., Richardson, T. L. Extraction protocols for the quantification of phycobilins in aqueous phytoplankton extracts. Journal of Applied Phycology. 23 (5), 865-871 (2011).
- Lea-Smith, D. J., et al. Phycobilisome-Deficient Strains of Synechocystis sp. PCC 6803 Have Reduced Size and Require Carbon-Limiting Conditions to Exhibit Enhanced Productivity. Plant Physiology. 165 (2), 705-714 (2014).
- Seo, Y. C., et al. Stable isolation of phycocyanin from Spirulina platensis associated with high-pressure extraction process. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1778-1787 (2013).
- Touloupakis, E., Cicchi, B., Torzillo, G. A bioenergetic assessment of photosynthetic growth of Synechocystis sp. PCC 6803 in continuous cultures. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 133 (2015).
- Touloupakis, E., Cicchi, B., Benavides, A. M. S., Torzillo, G. Effect of high pH on growth of Synechocystis sp. PCC 6803 cultures and their contamination by golden algae (Poterioochromonas sp.). Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1333-1341 (2016).
- Ishii, A., Hihara, Y. An AbrB-Like Transcriptional Regulator, Sll0822, Is Essential for the Activation of Nitrogen-Regulated Genes in Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Physiology. 148 (1), 660-670 (2008).
