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Biochemistry

Photometrische Bestimmung des Cyanobakteriums Synechocystis Phycobiliprotein Inhalt

Published: September 11, 2018 doi: 10.3791/58076
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 1
1Department of Adaptive Biotechnologies, Global Change Research Institute, Czech Academy of Sciences, 2Department of Plant Physiology, Faculty of Science, Masaryk University, 3Laboratory of Intracellular Regulation, Institute of Plant Physiology, Russian Academy of Sciences

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Phycobiliprotein Inhalt in cyanobakteriums Synechocystis eine photometrische Methode quantitativ zu bestimmen. Extraktionsverfahren wurde auch erfolgreich auf andere Cyanobakterien und Algen Stämme angewendet; jedoch aufgrund von Variationen in Pigment Absorptionsspektren ist es notwendig, die photometrische Gleichungen für jede Belastung individuell zu testen.

Abstract

Dies ist ein einfaches Protokoll für die quantitative Bestimmung der Phycobiliprotein Inhalt in das Modell cyanobakteriums Synechocystis. Phycobiliproteins sind die wichtigsten Komponenten des Phycobilisomes, das großen Licht-ernten Antennen in Cyanobakterien und einige Algen Taxa. Die Phycobilisomes Synechocystis enthalten zwei Phycobiliproteins: Phycocyanin und Allophycocyanin. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache, effiziente, und zuverlässige Methode zur quantitativen Bestimmung von Phycocyanin und Allophycocyanin in diesem Modell Cyanobakterium. Wir haben mehrere Methoden der Phycobiliprotein Extraktion und spektralphotometrische Quantifikation verglichen. Extraktionsverfahren wie in diesem Protokoll beschrieben wurde auch erfolgreich auf andere Cyanobakterien Stämme wie Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., angewendet. und Nostoc SP., Rotalgen Porphyridium Cruentum. Jedoch die vom Aussterben bedroht-Koeffizienten der spezifischen Phycobiliproteins aus verschiedenen Taxa können unterschiedlich sein und es empfiehlt daher, die photometrische Quantifizierungsmethode für jede einzelne Belastung individuell zu validieren. Das Protokoll erfordert nur geringen Zeitaufwand und kann in jedem standard Life-Science-Labor durchgeführt werden, da es nur standard-Ausrüstung erfordert.

Introduction

fPhycobiliproteins sind wasserlösliche Pigment-Protein-komplexe, die Hauptkomponenten des Licht-ernten Antennen in prokaryotic Cyanobacteria (Cyanophyta) und mehrere eukaryotischen Taxa (Glaucophyta, Rhodophyta darstellen , und Cryptophyta)1. Sie kommen hauptsächlich als supramolekulare komplexe Phycobilisomes genannt und sie hängen in der Regel an die Oberfläche der photosynthetischen Membranen auf der Stromale Seite, mit Ausnahme von Cryptophyta, wo die Phycobiliproteins, in lokalisiert sind der Thylakoidmembran Lumen2. Vier Arten von Phycobiliproteins wurden auf dem neuesten Stand: die Kern-Allophycocyanin und die peripheren Phycocyanin, Phycoerythrin und Phycoerythrocyanin1. Als die wichtigsten lichtsammelkomplexe repräsentieren Phycobilisomes eines der entscheidenden Faktoren der Algen und Cyanobakterien massenkulturen Produktivität. Es wurde nachgewiesen, dass diese Phycobilisomes Abschneiden Biomasse Akkumulation unter starkem Licht3verbessern kann. Auf der anderen Seite führte unter bescheidenen oder niedrigen Bestrahlungsstärke, die Antenne Abschneiden Wachstumsraten und Biomasse Akkumulation Reduktion3,4. Phycobiliproteins dienen im Handel als Lebensmittel-Farbstoffe, Pharma und Lebensmittel-Zusatzstoffe in der kosmetischen Industrie sowie Fluoreszenz Sonden mit Anwendungen in der Durchflusszytometrie, fluoreszierende Immunoassays und Fluoreszenz-Mikroskopie-5.

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die quantitative Bestimmung der Phycobiliproteins in das Modell cyanobakteriums Synechocystis. Cyanobakterien sind die frühesten sauerstoffhaltige photosynthetischen Autotrophe; Sie haben die Biosphäre der Erde für mehr als 2,4 Milliarden Jahren6gebildet. Sie spielen eine entscheidende Rolle im globalen biogeochemischen Kreisläufe von Stickstoff, Kohlenstoff, Sauerstoff und anderen Elementen. Unter den Cyanobakterien, eine einzellige Sorte Synechocystis eine Alleinstellung gewonnen, da war es die erste Cyanobakterium mit dem gesamten Genom sequenziert7,8, ist es natürlich umwandelbar durch exogene DNA-9, und Es führt stabil und relativ schnelles Wachstum10,11. In Synechocystis, die Kernkomponente Antenne Allophycocyanin, die integraler Membranproteine zugeordnet ist und die beigefügten Phycocyanin befindet sich an der Thylakoidmembran Membran Peripherie.

Mehrere Methoden zur Phycobiliprotein Extraktion und Quantifizierung werden in diesem Protokoll verglichen. Die endgültige Extraktionsverfahren wurde erfolgreich Synechocystissowie andere Cyanobakterien Stämme, einschließlich Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira eingesetzt. SP., und Nostoc SP., und es wurde auch erfolgreich auf Rotalgen Porphyridium Cruentumangewendet. Daher kann die Methode entwickelt, die in diesem Protokoll als eine universelle Methode für die Extraktion von Phycobiliprotein betrachtet werden. Obwohl einige der getesteten Extraktionsmethoden Gesamtprotein Ertragssteigerungen geführt, die hier beschrieben Extraktionsverfahren vorausgesetzt ergibt sich die höchste Phycobiliprotein zusammen mit dem niedrigsten Inhalt von Chlorophyll ein Rückstand in der Phycobiliprotein zu extrahieren. Reduzierung des Gehalts an Chlorophyll ein war entscheidend für die richtige Phycocyanin und Allophycocyanin spektralfotometrische Quantifizierung.

Die Phycobiliprotein Absorptionsspektren können variieren erheblich zwischen den verschiedenen Algen und Cyanobakterien Arten12,13,14,15,16,17 und sogar unter mehrere Stämme von einem einzigen Cyanobakterien Gattung18. Daher sind die spezifischen Wellenlängen und Absorption Koeffizienten zur Bestimmung von Phycocyanin und Allophycocyanin in Synechocystis verwendet nicht allgemein anwendbar auf andere Stämme. Darüber hinaus bietet Synechocystis keine Phycoerythrin und Phycoerythrocyanin, die in einigen anderen Algen und Cyanobakterien gefunden werden können. Für die Zwecke der Bestimmung der Phycobiliproteins Stämme als Synechocystisempfiehlt es sich, die photometrische Gleichungen für jede Belastung individuell zu bewerten.

Obwohl das Protokoll länger zweistufig (über Nacht von der zellulären Pellets und 1 Stunde Proteingewinnung Gefriertrocknung) enthält, ist die gesamte Arbeitszeit für die Quantifizierung der Phycobiliproteins nicht länger als 2 Stunden.

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Protocol

(1) Cyanobakterien Anbau

  1. Synechocystis Zellen im Erlenmeyerkolben oder in Photobioreaktoren10,19 in gepufferten BG11 Medium20 einen pH-Wert von < 10 (z. B.mit 17 mM HEPES10) weiterhin zu pflegen.
    Hinweis: Standard Anbaubedingungen erfordern einen kontrollierten Temperatur (30 ° C, die optimale Temperatur ist in der Regel 35 ° C)21, Beleuchtung (in der Regel ein weißes Licht mit einer Intensität bis zu 800 µmol [Photonen] / [m2·s])21und ein CO 2 Lieferung (in der 400-mL-Flachbildschirm-Photobioreaktor ist das Wachstum Sättigung CO2 -Konzentration 1.700 ppm)21.
  2. Um die Kultur-Dichte zu bestimmen, Messen Sie die Kultur optische Dichte spektralphotometrisch bei 730 nm (OD730) mit einer Küvette mit einer Schichtdicke von 1 cm. Alternativ zählen die Zellen unter dem Mikroskop mit einer Hemocytometer oder einer automatisierten Zelle Zähler.

2. Proben-Vorbereitung

  1. Arbeiten Sie unter niedrigen Bestrahlungsstärke, Phycobiliprotein Abbau zu verhindern.
  2. 3 x 1 mL Suspension Kultur zu Safe-Lock Tubes zu ernten. Verwenden Sie Triplicates für die Schätzung von technischen Fehlern bei der Messung. Um die Kultur-Probenahme unter sterilen Bedingungen durchzuführen, Ernten Sie die Zellen in einer laminaren Kapuze und folgen Sie die richtigen Arbeits- und Praktiken.
  3. Zentrifugieren Sie die Zellen im Labor Temperatur 5 min. Achten Sie auf die ausgewogene Zentrifuge Rotor 15.000 X g . Verwerfen Sie nach Zentrifugation die Überstände. Achten Sie darauf, nicht zu stören das Pellet.
  4. Setzen Sie die Proben in einer Tiefkühltruhe. Halten Sie für die langfristige Lagerung die Proben bei-80 ° C. Dies ist notwendig, Phycobiliprotein Abbau zu verhindern. Für kurzfristige Lagerung ist-20 ° C ausreichend.
  5. Gefriertrocknen Sie die Proben über Nacht. Für einen richtigen Gefriertrocknung Prozess halten die Temperatur des Kondensators Einfrieren-Trockner unter-60 ° C und der Druck in der Freeze-Trockner Kammer ca. 1 hPa.
  6. Schließen Sie nach Beendigung des Gefriertrocknung Zyklus den Schlauch so bald wie möglich auf die Resorption von Wasser aus der Luft zu verhindern.

3. Handy-Homogenisierung und Pigmente Extraktion

  1. Jede Probenröhrchen vier Stücke von Glasperlen (mit einem Durchmesser von 2 mm) hinzu und schließen Sie die Rohre.
    Hinweis: Wenn der Deckel der Safe-Lock-Röhre zur Homogenisierung zu dünn ist, kann es während der Homogenisierung zu brechen; Daher sind nur Safe-Lock Röhren mit starken Deckeln für dieses Protokoll empfohlen.
  2. Homogenisieren der Proben mit den Glasperlen für 15 s auf einem Homogenisator bei Labor-Temperatur.
    Hinweis: Eine richtig homogenisierte Probe breitet sich über die ganze innere Fläche der Safe-Lock-Röhren.
  3. Fügen Sie 1 mL PBS-Puffer (pH-Wert 7,4), bis 4 ° C, um die Proben um Phycobiliproteins extrahieren vorgekühlt.
    Hinweis: Halten Sie von diesem Schritt auf die Proben auf Eis, um den Abbau der extrahierten Proteine zu verhindern. Dies ist kritisch.
  4. Mischen Sie die Proben mit PBS für 5 s auf den Homogenisator bei Labor-Temperatur.
    Hinweis: Nach dem Mischen sind die Proben grünlich.
  5. Nach dem Mischen, halten Sie den Proben auf Eis für 60 min. Abdeckung das Eisbad mit einem Deckel zu Pigmenten Abbau zu verhindern.
  6. Zentrifugieren Sie nach 60 min Phycobiliprotein Extraktion die Proben bei 15.000 X g bei 4 ° C für 5 min. Achten Sie darauf, die Zentrifuge Rotor richtig auszugleichen.
    Hinweis: Nach der Zentrifugation des Überstands hat eine Cyan blaue Farbe.

4. Phycobiliprotein Quantifizierung

  1. Kalibrieren Sie bevor die photometrische Messung Spektralphotometer zur Grundlinie mit PBS-Puffer als Rohling.
  2. Nach der Kalibrierung Spektralphotometer verwerfen die PBS von einem Spektrofotometer Küvetten und pipette des Überstands mit extrahierten Phycobiliproteins statt mit dem ausrangierten Puffer.
  3. Quantifizierung die Phycobiliprotein Konzentration spektrophotometrisch, mit einer Spaltbreite von 0,5 nm.
    1. Messen Sie die Absorption von Phycocyanobilins in Phycocyanin und Allophycocyanin gegen die PBS-Puffer leer bei 615 nm (ein615) und 652 nm (eine652), bzw., und Messen Sie die Absorption der zelltrümmer bei 720 nm (A720).
    2. Berechnen Sie die Konzentration von Phycocyanin und Allophycocyanin nach den Gleichungen (1) und (2) von Bennett und Bogorad12:
      Equation 1
      Equation 2
      Hinweis: Eine615, eine652und ein720 sollte auf den Bereich der linearen Absorption des Spektralphotometers passen. Falls notwendig, verdünnen Sie die Probe mit PBS-Puffer.
  4. Neuberechnung der Pigmentkonzentration in die original-Samples. Die Pigmentkonzentration in der Probe entspricht direkt mit den Ergebnissen der Gleichungen (1) und (2) bei 1 mL Kultur und 1 mL des Puffers Extraktion für die Analyse verwendet werden. Bei der Verwendung von unterschiedlichen Mengen von Cyanobakterien Proben und/oder PBS-Puffer, sollte die endgültige Pigmentkonzentration gemäß Gleichung (3) berechnet werden:
    Equation 3(3)
    Hinweis: Im Falle einer Normalisierung Phycobiliprotein Inhalte pro Zelle Trockengewicht, die endgültige Pigmentkonzentration berechnet werden soll nach Gleichung (4)Equation 4 (4)

5. Ermittlung der Zelle Trockengewicht (Optional)

  1. Analysenwaagen belasten Sie drei Safe-Lock-Leerhülsen.
    Achtung: Es ist wichtig, dass die Safe-Lock-Rohre trocken sind. Trocknen Sie bei Lagerung der Rohre in einer feuchten Umgebung die Rohre für mehrere Stunden in eine Gefriertrocknungsanlage vor dem wiegen sie. Manipulieren Sie die Rohre vorsichtig und nur mit puderfreien Handschuhen, jeglichen Kontakt zwischen dem Material und der Forscher Finger zu vermeiden. Halten Sie alle Inhaber und Zentrifugieren Sie sauber, um die Übertragung von Material an den Rohren zu vermeiden.
  2. Probe 1 x 15 mL Kultur Suspension für 15 mL konische Rohr.
  3. Zentrifugieren Sie die Kultur-Suspension in den 15 mL konische Röhrchen bei 4.000 X g bei Labor Temperatur 10 min. Gleichgewicht der Zentrifuge Rotor mit drei zusätzlichen 15 mL konische Röhrchen, jedes mit 15 mL Wasser. Verwerfen Sie nach Zentrifugation 12 mL des Überstands.
  4. Aufschwemmen der Pellets im restlichen überstand und 3 x 1 mL des Gemisches auf drei 1,5 mL-Safe-Lock-Röhren mit einer Pipette übertragen. Für den Fall, dass einige Reste des Geschosses in der 15 mL konische Röhre bleiben, fügen Sie 1,5 mL entionisiertem Wasser zum konischem Rohr, Wirbel oder schütteln das Rohr auf die verbleibenden Aufschwemmen pellet und transfer 3 x 0,5 mL des Gemisches an den drei 1,5 mL-Safe-Lock-Rohren (bereits Containi hinzu 3 x 1 mL des Pellet-ng) mit einer Pipette.
    Hinweis: Aufteilung der Pellets über drei 1,5 mL-Safe-Lock-Rohre wird die Schätzung eines technischen Fehlers der Trockengewicht Messung ermöglichen.
  5. Zentrifugieren Sie den Zellen in 1,5 mL-Safe-Lock-Röhren bei 15.000 X g bei Labor Temperatur 5 min. Balance des Zentrifuge Rotors mit einem zusätzlichen 1,5 mL Safe-Lock-Rohr, das enthält 1 mL Wasser. Verwerfen Sie nach der Zentrifugation die Überstände.
  6. Legen Sie die Proben in den Gefrierschrank. Halten Sie für die langfristige Lagerung die Proben bei-80 ° C; für die kurzfristige Speicherung ist-20 ° C ausreichend.
  7. Gefriertrocknen Sie die Proben über Nacht. Für einen richtigen Gefriertrocknung Prozess halten die Temperatur der Freeze Trockner Kondensator unter-90 ° C und der Druck in der Freeze-Trockner Kammer ca. 1 hPa.
  8. Schließen Sie nach Gefriertrocknung die Rohre und Analysenwaagen belasten Sie Proben.
    Hinweis: Der Trockengewicht Wert kann für die Normalisierung des Phycobiliprotein Inhalts pro Zelle Trockengewicht verwendet werden.

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Representative Results

Für die erste Methode Tests Synechocystis wurde angebaut als Batch-Kulturen im Erlenmeyerkolben auf einen Shaker in BG11 Anbau mittleren20 (ergänzt mit 17 mM HEPES) bei 25 ° C, unter ein warmweißes Licht mit einer Intensität von 50 µmol (Photonen) / (m 2·s) und mit 1 % CO2 in der Kultivierung Atmosphäre. Während des Anbaus der Kulturen wurden zu Safe-Lock Tubes abgetastet und zentrifugiert (15.000 X g bei Labor Temperatur für 5 min), der Überstand wurde verworfen und die Proben wurden entweder bei-80 ° C gelagert und gefriergetrocknet als Vorbereitung für die einzelnen Schritte dieses Protokolls oder bei-20 ° C oder Extraktion und Quantifizierungen Vergleichsanalyse-80 ° C gelagert.

Die getesteten Extraktionsverfahren enthalten Zellaufschluss durch Ultraschallbehandlung, Homogenisierung mit Zirkonia Perlen innerhalb der PBS-Puffer und Einfrieren Auftauen. Die Ergebnisse der verschiedenen Extraktionsmethoden sind in Abbildung 1zusammengefasst. Die Methode wie beschrieben innerhalb dieses Protokoll vorausgesetzt, die höchsten Phycobiliproteins zusammen mit der niedrigsten Chlorophyll eine Kontamination in den Extraktionspuffer ergibt. Chlorophyll ein wurde in dem Extraktionspuffer erkannt als Beschallung für den Zellaufschluss verwendet wurde. Wiederholenden Zyklen von Einfrieren und Auftauen der Proben in einem Ultraschallbad auf Eis führte zu höheren Protein-Erträge in dem Extraktionspuffer. Jedoch erhöht zugleich, die Konzentration an Chlorophyll ein in dem Extraktionspuffer (Abbildung 1 Einschub), welche eine ordnungsgemäße Phycobiliprotein Content Quantifizierung ausgeschlossen.

Die optimale Homogenisierung damals 15 S. Homogenisierung für beide kürzer (5 s) und länger (20 s) Perioden zur Verfügung gestellt etwas niedriger Phycobiliprotein Erträge, wie in Abbildung 2dargestellt. Die höchsten Erträge im Vergleich mit Glasperlen mit einem Durchmesser von 0,5 mm, 1 mm oder 4 mm, mit Zirkonia Perlen mit einem Durchmesser von 0,5 mm oder mit Seesand Körner führte Homogenisierung der Zellen mit Glasperlen mit einem Durchmesser von 2 mm. Die PBS-Extraktionspuffer wurde als der optimale Puffer für Phycobiliproteins Extraktion (Abbildung 3) getestet. Die Zugabe von 100 mM NaCl oder 150 mM KCl der PBS-Puffer oder Wasser nicht Phycobiliprotein Extraktionseffizienz zu erhöhen, und dasselbe ging für die Verwendung von 20 mM Natrium-Acetat-Puffer für die Extraktion (Abbildung 3). Die optimale Phycobiliprotein Extraktionszeit war 60 Minuten, weil nach mehr Zeit (bis zu 240 Minuten), die Phycobiliprotein Konzentration in dem Extraktionspuffer nicht wesentlich ändern (Abbildung 4).

Wir auch das Spektralphotometer Linearität Sortiment für die Phycobiliprotein-Messung (Abbildung 5) getestet und verglichen mehrere Gleichungen Phycobiliprotein Quantifizierung mit Phycocyanin und Allophycocyanin Standards (Abbildung 6). In diesem Protokoll verwendeten Spektralphotometer zeigte einen linearen Absorption Bereich zwischen 0,1 - 3,0 (Abbildung 5). Da die Spektren des Proteins zu extrahieren musste seine maximale Absorption rund 620 nm (ein620), und bei 652 nm, die Absorption (eine652) war nur 33 % von einem620 (Abbildung 7), die Spektralphotometer Linearität für eine652 (maximal Allophycocyanin Extinktion) war nur bis zu einem652 von 1,16 getestet. Die Gleichungen (1) und (2) von Bennett und Bogorad12 vorgesehen die beste Rekonstruktion von Phycocyanin und Allophycocyanin Standards unter allen getesteten Gleichungen (Abbildung 6). Streptomycin Sulfat, verwendet in einigen früheren Studien für die Beseitigung der Membran Fragmente enthält Chlorophyll ein, zeigte sich als nicht notwendig für die Extraktion (Abbildung 7).

Für die repräsentative Experiment wurde in ein Photobioreaktor25 in einem Turbidostat Regime, wo die Zellen in exponentiellen Wachstumsphase in einem definierten Bereich der optischen Dichte gepflegt waren Synechocystis kultiviert (gemessen bei 680 nm, OD 680) durch eine kontrollierte Verdünnung durch eine frische Anbau mittlerer (BG11 Medium mit 17 mM HEPES gepufferten)11,26. Die Kulturen wurden bei 32 ° C kultiviert und die Eingang Luft enthalten 0,5 % CO2. Die Kulturen wurden mit einem roten Licht beleuchtet (λMax.: 633 nm, λ1/2: 20 nm) von einer Intensität von 25-1100 µmol (Photonen) / (m2·s), zusammen mit einem blauen Licht (λMax.: 445 nm, λ1/2: 20 nm) von einer Intensität von 25 µmol ( Photonen) / (m2·s). Die optische Dichte der Suspension Kultur wurde durch die Photobioreaktor Basis gemessen, und die Palette der OD-680 wurde eingerichtet, um 0,52 - 0,58 (2 x 107 , 4 x 107 Zellen/mL). Die Kulturen waren unter jeder spezifischen Lichtintensität für mindestens 24 Stunden, um genügend Zeit zur Akklimatisierung angebaut. Nach Wachstum Stabilität zu erreichen, wurden die Kulturen für Trockengewicht (entsprechend der Schritte 2.1-2.8 dieses Protokolls), Zellzahl und Phycocyanin und Allophycocyanin Inhalt beprobt. Die Ergebnisse der Bewertung unter zunehmendem Lichtintensitäten Phycobiliprotein sind in Abbildung 8dargestellt. Synechocystis verringert den Phycobiliprotein Inhalt von 12 % des zellulären Trockengewicht (505 fg/Zelle) unter der niedrigsten Bestrahlungsstärke auf 3 % des zellulären Trockengewicht (280 fg/Zelle) unter der höchsten Bestrahlungsstärke.

Figure 1
Abbildung 1 : Vergleich der Extraktionseffizienz der Methode beschrieben in diesem Protokoll mit mehreren Referenzmethoden. Die Konzentration von Phycocyanin (schwarze Balken) und Allophycocyanin (weiße Balken) im Rohprotein Extrakt wurde gemessen, nach Extraktion in der PBS-Puffer für 60 min. Methode A innerhalb dieses Protokoll beschrieben wird. Methode B wurde wie folgt geändert: nach der Ernte wurden die Zellen zentrifugiert (15.000 X g bei Labor Temperatur für 5 min) und über Nacht bei-20 ° C gelagert. Die gefrorenen Proben wurden für 120 sonorisiert s bei 4 ° C und die Phycobiliproteins wurden extrahiert in PBS-Puffer für 60 min. Methode C von B-Methode geändert wurde, durch die Lagerung der Pellets der geernteten Zellen bei-80 ° C für 30 min, Gefriertrocknung die zelluläre Pellets , und das Hinzufügen von PBS-Puffer für die trockene Pellets. Methode D wurde von Chung Et al.modifiziert. 16: nach der Gefriertrocknung (gleich wie in Methode C), 0,25 mL Na-Acetat mit 1 % Streptomycin Sulfat Puffer (pH 5,5) wurde hinzugefügt, um das trockene zellulären Pellet, zusammen mit 0,25 mL von Zirkonium Perlen (mit einem Durchmesser von 0,5 mm), und die Proben waren zweimal homogenisiert für 60 s in den Homogenisator. Nach der Homogenisierung, ein weiteres 0,5 mL Na-Acetat mit 1 % Streptomycin Sulfat-Puffer (pH 5,5) wurde hinzugefügt, um die Probe, die Röhren waren verwirbelt und der Proteine wurden extrahiert auf Eis für 30 min. Methode E aus einem Einfrieren Auftauen Zyklus in PBS-Puffer bestand und Proteingewinnung 24 h bei 4 ° C. Methode F (Einschub Abbildung) bestand aus einem und sechs Zyklen des Einfrierens der Zellen (zunächst gefriergetrocknet und Nukleinsäuretablette in PBS-Puffer) in flüssigem Stickstoff, gefolgt von Beschallung auf Eis. Aufgrund der erheblichen Chlorophyll eine Präsenz im Rohprotein Extrakt wurden die Phycobiliproteins nicht innerhalb Methode F. quantifiziert. Die dargestellten Werte repräsentieren Durchschnittswerte von drei technischen Wiederholungen mit der Fehlerbalken Standardabweichungen vertreten. Pigmentkonzentrationen wurden nach Gleichungen (1) und (2) dieses Protokoll berechnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Wirkung der Homogenisierung Zeit auf die Extraktionseffizienz Phycobiliprotein. Die lyophilisierten Pellets von Synechocystis Zellen (nach diesem Protokoll-Schritte 3.1-3.5) wurden gestört, mit Glasperlen auf Homogenisator für 5 s, 15 s und 20 s. Die dargestellten Werte repräsentieren Durchschnittswerte von drei technischen Wiederholungen mit der Fehlerbalken Standardabweichungen vertreten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Phycobiliprotein Extraktionseffizienz in verschiedenen Extraktion Puffern. Die Phycobiliproteins wurden extrahiert in der PBS-Puffer, die PBS-Puffer mit einem Zusatz von NaCl 100 mM oder 150 mM KCl, deionisiertes Wasser mit 100 mM NaCl oder 150 mM KCl, nach Hemlata und Fareha22, und 20 mM Natriumacetat nach Chung Et al. < / C4 >. 16. die Gewinnung erfolgte bei 4 ° C gemäß 4.1-4.3 dieses Protokolls. Die dargestellten Werte repräsentieren Durchschnittswerte von drei technischen Wiederholungen mit der Fehlerbalken Standardabweichungen vertreten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Phycobiliprotein Stabilität in dem Extraktionspuffer rechtzeitig. Nach Extraktionsverfahren, wie beschrieben in Schritten 4.1-4.3 dieses Protokolls durchgeführt wurde Phycobiliprotein Extrakt in PBS-Puffer (pH 7,4) für bis zu 4 Stunden, ohne bedeutende Phycocyanin (Kreise) und Allophycocyanin (Quadrate) Abbau bei 4 ° C gelagert. Die gestrichelte Linie stellt die lineare Anpassung der Zeitpunkte durch die Methode der kleinsten Quadrate berechnet. Die dargestellten Werte repräsentieren Durchschnittswerte von drei technischen Wiederholungen mit der Fehlerbalken Standardabweichungen vertreten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Repräsentative Messungen von Phycocyanin und Allophycocyanin Konzentrationen in Synechocystis. Eine Dichte Kultur-Suspension (Phycocyanin: 456 µg/mL, Allophycocyanin: 106 µg/mL) wurde schrittweise bis zu einer Konzentration von Phycocyanin und Allophycocyanin 19 µg/mL verdünnt. Die dargestellten Werte repräsentieren Durchschnittswerte von drei technischen Wiederholungen mit der Fehlerbalken Standardabweichungen vertreten. Die gestrichelte Linie stellt die lineare Anpassung der Konzentration Punkte durch die Methode der kleinsten Quadrate berechnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Schätzung von Phycocyanin und Allophycocyanin Konzentrationen in Pigmente Normen. Der Inhalt von Phycocyanin und Allophycocyanin in Pigment-Standards wurde nach den Gleichungen von Bennett und Bogorad12, spektralphotometrisch gemessen Lüder Et Al. 13, Sampath-Wiley und Neefus15, Evans14und Chung Et Al. 16. Proteingehalt in den Standards (wie nötig für Phycobiliproteins Bestimmung) wurde quantifiziert mit einer Lösung von Bicinchoninic Säure, Natrium Carbonat, Natrium-Tartrat und Natriumbicarbonat in 0,1 N NaOH (mit einem endgültigen pH-Wert von 11,25), in Reaktion mit 4 % (w/V) Kupfer(II) Sulfat-Pentahydrat27, bovine Serum Albumin als standard Protein verwenden. Die Gleichungen der Bennett und Bogorad zur Verfügung gestellt der höchsten Rekonstruktion der beiden Pigmente: 96 % der standard Phycocyanin und Allophycocyanin standard 99 %. Die dargestellten Werte repräsentieren Durchschnittswerte von drei technischen Wiederholungen mit der Fehlerbalken Standardabweichungen vertreten. Die gestrichelte Linie zeigt die 100 %-Punkt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7 : Die Wirkung von Streptomycin Sulfat auf das Absorptionsspektrum des Rohproteins Extrakt in der PBS-Puffer. (A) die Extraktion Verfahren wie beschrieben in Schritten 4.1-4.3 dieses Protokolls oder (B) mit Beschallung, wie in der Legende von Abbildung 1 beschrieben Methode F in PBS-Puffer (Kreise) und in PBS-Puffer mit 1 % ergänzt ausgeführt wurde Streptomycin Sulfat (Quadrate). Die Phycobiliprotein Quantifizierung wurde nach Schritte 5.1-5.4 dieses Protokolls durchgeführt. Die dargestellten Werte repräsentieren Durchschnittswerte von drei technischen Wiederholungen mit der Fehlerbalken Standardabweichungen vertreten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8 : Konzentration von Phycocyanin (Kreise) und Allophycocyanin (Quadrate) in Synechocystis unter rot-Orange Licht von einer Intensität von 25-1100 µmol(photons)/(m2·s) kultiviert. Synechocystis Kulturen wurden in ein Photobioreaktor bei 32 ° C, mit 0,5 % CO2 in der Eingabe Luft in BG11 Anbau Medium ergänzt mit 17 mM HEPES in einem Turbidostat Regime nach Zavrel Et Al. angebaut. 11. Phycobiliprotein Konzentrationen wurden nach diesem Protokoll gemessen und die endgültige Phycobiliprotein Inhalt wurde pro zellulären Trockengewicht, normalisiert, wie beschrieben in Abschnitt 2 dieses Protokolls. Die gestrichelten Linien stellen die Kraft-Fit der gemessenen Punkte, durch die Methode der kleinsten Quadrate berechnet. Die dargestellten Werte repräsentieren Durchschnittswerte von drei technischen Wiederholungen mit der Fehlerbalken Standardabweichungen vertreten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache, schnelle und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung der Phycobiliprotein Inhalt in das Modell cyanobakteriums Synechocystis. Verschiedene Methoden der Zelle Homogenisierung, Proteingewinnung und Phycocyanin und Allophycocyanin Quantifizierung werden verglichen und das endgültige Protokoll stellt eine Kombination der optimalen Schritte jedes einzelnen Verfahrens. Als repräsentative Daten wurde der Inhalt des Phycobiliproteins in Synechocystis Zellen unter Erhöhung der Lichtintensität quantifiziert. Obwohl die Analyse ähnliche Zeit und Laborgeräte wie einige der zuvor veröffentlichten Methoden12,13,14,15,16 erfordert, ist der Vorteil dieses Protokolls mit hoher Präzision abgeschätzt werden, dass kein Chlorophyll ein in dem Extraktionspuffer und somit die Messung Phycobiliprotein freigesetzt wird.

Der Betrag der Zellsuspension erforderlich für Phycobiliprotein Analyse mit der Kultur-Dichte variieren kann. Das Probenvolumen von 1 mL ist optimiert für Kulturen mit einem OD-730 1,5, eine Zelldichte von ca. 2 x 107 Zellen/mL oder Kulturen mit einem Phycobiliprotein-Gehalt von ca. 20 mg/L. Im Falle von verdünnten Kulturen ernten Sie ein größeres kulturvolumen. Auf der anderen Seite bei dichten Kulturen ernten eine niedrigere Kultur Volumen-in High-Density-Kulturen, besteht die Gefahr, die Phycobiliproteins teilweise in den Zellen nach der Extraktion bleiben. Ebenso kann die Zellsuspension erforderlich für die Bestimmung der Trockenmasse mit der Kultur-Dichte variieren. Die Probenahme-Volumen von 15 mL ist optimiert für die Kulturen mit einem OD-730 1,5 oder eine Zelldichte von ca. 2 x 107 Zellen/mL. Mit niedriger Dichte Kulturen oder mit geringeren Volumina kann die Messfehler erhöhen. Im Gegenteil, bieten größere Kultur Volumes oder Dichter Kulturen bessere Methode Auflösungen.

Wichtige Schritte des Protokolls sind die Zelle Homogenisierung und Phycobiliprotein Extraktion, die hohe Erträge und hohe Spezifität bieten sollte. Die höchsten Erträge und Reinheit der Extrakte mit gleichzeitiger maximaler Protein Erhaltung gelang durch Gefriertrocknung der Proben, Homogenisieren die trockenen zellulären Pellets durch Glasperlen und Durchführung der Extraktion Phycobiliprotein in PBS-Puffer ( Abbildung 1). Da auch eine kleine Verunreinigung von Rohprotein Extrakt von Chlorophyll ein zu einem Phycobiliprotein Inhalt Überschätzung führen kann, ist es notwendig, alle Chlorophyll eine Extraktion zu vermeiden durch das Hinzufügen des PBS-Puffers. Chlorophyll ein wurde im Rohöl Extrakt erkannt als Beschallung für Zellaufschluss verwendet wurde. Der Einsatz von Abbildung 1, dargestellt mit sich wiederholenden Beschallung Zyklen, die Menge an Chlorophyll ein Extrakt erhöht. Auf der anderen Seite die Höhe der extrahierten Proteine (festgestellt durch die Absorption bei 280 nm) auch nach Wiederholung Beschallung Zyklen erhöht. Daher die Verwendung von Ultraschall (in Kombination mit Einfrieren Auftauen Zyklen in flüssigem Stickstoff) erscheint als eine geeignete Methode für die Extraktion der Gesamt-Protein (freie und Membrane-springen Proteine werden aus den Zellen freigegeben); Es wird jedoch nicht zum Zwecke der Phycobiliprotein spektralfotometrische Quantifizierung empfohlen. Chung Et al.. die Verwendung von 1 % Streptomycin Sulfat empfohlen Beseitigung Membran Fragmente mit Chlorophyll a16. Der Einsatz von Streptomycin Sulfat schien hier nicht notwendig sein, da es nicht zu einer Verringerung des Chlorophyll ein Proteinextrakt (Abbildung 7) führten. Obwohl ein einzelnes Beschallung-Zyklus für 120 s nicht stören, die Zellen effizient (Methoden B und C, Abbildung 1), andere Methoden (z.B. Methode F wie in Abbildung 1 oder in Abbildung 7 bvorgestellten Methoden dargestellt) bestätigt bisherigen Erkenntnisse der Zellulite wird eine effiziente Zelle Störung Methode22,28. Auf der anderen Seite bereitgestellten einfachere Einfrieren Auftauen Zyklen, auch bereits als eine effiziente Methode für Phycobiliproteins Extraktion22,28, berichtet die niedrigsten Erträgen in den hier beschriebenen Tests (Methode E, Abbildung 1 ). Handy-Homogenisierung (innerhalb der Extraktionspuffer, 2 x 60 s) von Zirkonium Perlen wurde als weniger effizient als die 15-s Homogenisierung des gefriergetrockneten zellulären Pellet (Methode D, Abbildung 1) getestet. Die Homogenisierung innerhalb der Extraktionspuffer war zuvor mit einem längeren Homogenisierung Zeit (10 min)29beschrieben. Wir haben nicht getestet, die Homogenisierung für länger als 2 min seit der Proben bei jedem Zyklus Homogenisierung deutlich erwärmt. In der Literatur wurden auch andere Zelle Störungen Methoden beschrieben, einschließlich der Nutzung von einem französischen Presse16 oder Rasterung13,15,30; solche Methoden waren jedoch nicht in dieser Studie getestet.

Die Protein-Extraktion erfolgte für 15 s (Abbildung 2) in PBS-Puffer. Der Puffer pH-Wert wurde 7.4, die zuvor als optimal für Phycobiliprotein Extraktion22gemeldet. Die Zugabe von NaCl oder KCl verbesserte nicht Phycobiliprotein Extraktionseffizienz (Abbildung 3), die bisherigen Beobachtungen22widersprechend ist. Jedoch, wie in Abbildung 3gezeigt, die Phosphat-gepufferte Salzlösung wie in diesem Protokoll verwendet enthalten 154 mM NaCl (zusätzlich 5,6 mM Na2HPO4 und 1 mM KH2PO4), die nicht uns erlaubte zu schaffen die NaCl-freie PBS Extraktionspuffer als Kontrolle. Wir haben auch PBS-Puffer und Natrium Acetat Puffer16 Extraktion Effizienz verglichen. Die Kombination von Natrium Phosphat und Kalium Phosphat innerhalb der PBS-Puffer vorausgesetzt, höhere Phycobiliproteins ergibt (Abbildung 3). Dieser Befund entsprach mit den bisherigen Ergebnissen der Hemlata Et Al. 22.

Die Extraktionszeit Phycobiliprotein wurde optimiert für 1 Stunde länger Extraktion nicht zu signifikanten Phycobiliprotein Abbau oder Extraktion Verbesserung (Abbildung 4), führten die mit der bisherigen Arbeit von Lawrenz Et al.entsprach. 28. eine Extraktionszeit kürzer als 1 h nicht getestet wurde. In ähnlicher Weise wurde Extraktion für mehr als 4 h nicht getestet, da es zuvor festgestellt wurde, dass die extrahierten Phycobiliproteins in der Phosphatpuffer für mindestens 48 h28stabil sind.

Wir verglichen mehrere Gleichungen spektralfotometrische Phycocyanin und Allophycocyanin Quantifizierung, wie bisher in der Literatur beschrieben, durch Neuberechnung des Inhalts der beiden Phycobiliproteins in den kommerziellen Standards mit bekannten protein Konzentrationen (Abbildung 6). Die besten Rekonstruktion der beiden Pigmente wurde durch die Gleichungen von Bennett und Bogorad12erreicht. Dieses Ergebnis wurde nicht speziell für das Phosphat Extraktionspuffer da so ein Puffer wurde früher12,13,15. Es war weder spezifisch für die Pigment-Standards seit der Unterschied zwischen einem615, ein618und einer620 (Wellenlängen für Phycocyanin Schätzung in früheren Werken verwendet) in dem Phycocyanin standard war, 1 % und der Unterschied zwischen einer 650 und eine652 (Wellenlängen verwendet, zuvor für Allophycocyanin Schätzung12,13,14,16) im standard Allophycocyanin betrug 3 %. Ebenso war der Unterschied zwischen einem615 und einer620 in der Proteinextrakt von Synechocystis nur 2 %. Solche kleinen Unterschiede in den Absorptionsspektren können nicht in eine endgültige Pigment-Variante von bis zu 36 % (Abbildung 6) führen. Die Unterschiede zwischen den einzelnen Gleichungen verbanden daher eher auf eine sich ändernde Phycobiliprotein Aussterben Koeffizienten von bestimmten Organismen12,13,14, 15 , 16 , 17. interessant ist, die Gleichungen der Chung Et Al. zur Verfügung gestellt der niedrigsten Phycocyanin Rekonstruktion (Abbildung 6), obwohl die Autoren auch Synechocystis für ihre Experimente16verwendet.

Statt die Bestimmung der einzelnen Wellenlängen, es empfiehlt sich, ein kontinuierliches Spektrum des Extraktes Phycobiliprotein zwischen 280-720 nm, die Anwesenheit von Chlorophyll ein in den Extrakt zu schätzen, die beide stören könnten zu messen die Allophycocyanin und die Absorption von Phycocyanin. Darüber hinaus kann durch Messung der Absorption bei 280 nm (ein280), einer Reinheit von Phycocyanin (ein615/a280 oder ein620/a280)21,22 und Allophycocyanin (eine652/a280) 24 in der Extrakt abgeschätzt werden (0,7: Nahrungsmittelgrad, 3.9: reaktive Grade, > 4.0: analysenrein)21.

Als repräsentative Daten wurde die Konzentration von Phycocyanin und Allophycocyanin in Synechocystis bestimmt unter Erhöhung der Lichtintensität. Aufrechterhaltung der Kultur-Dichte auf einem konstanten Niveau innerhalb einer Turbidostat Anbau Regime11war,21 wesentlich für die direkte vergleichende Experiment. Die Phycocyanin und Allophycocyanin Konzentrationen von 2,4 % 10,2 % und 0,6 % - 1,7 % des zellulären Trockengewicht wurden jeweils ähnlich wie die zuvor aufgezeichneten Werte11,31,32. Darüber hinaus war die Phycobiliprotein Inhalt pro Zelle Basis ähnlich wie bereits berichtet,11,33. Mit der zunehmenden Licht verringert der Phycobiliproteins Inhalt. Interessanterweise auch unter die höchste Lichtstärke 1100 µmol (Photonen) / (m2·s), die Phycobiliproteins waren nicht vollkommen gebleicht.

Da das Protokoll nur Serienausstattung erfordert und relativ schnell ist, kann es leicht in jedem Labor übernommen in dem Phycobiliproteins routinemäßig analysiert werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Das Protokoll wurde von einer früheren Veröffentlichung11angenommen. T. Z. D. ch. und J. Č. wurden gefördert durch das Ministerium für Bildung, Jugend und Sport der Tschechischen Republik im Rahmen des nationalen Programms Nachhaltigkeit ich (NPU ich), Nummer LO1415 zu gewähren. J. Č. wurde auch von GA CR, Grant-Nummer 18-24397S unterstützt. Zugang zu Instrumenten und anderen Einrichtungen wurde von der Tschechischen Forschungsinfrastruktur für Systembiologie C4SYS unterstützt (Projekt keine LM2015055). M. A. S. wurde durch einen Zuschuss aus der russischen Science Foundation [Nr. 14-14-00904] unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synechocystis sp. PCC 6803 Institut Pasteur, Paris, France 6803 Cyanobacterium strain
Roti-CELL PBS Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 9143.1 Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4
Eppendorf safe-lock tubes  Eppendorf, Hamburk, Germany 30120086 Safe-lock tubes 1.5 ml
VWR 80-Place Storage System VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA 30128-282 Holder for safe-lock tubes 
RAININ 100 µl -1000 µl  Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA 17014382 Pipette
GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8 Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA 30389272 Pipette tips
Rotina 420R Hettich, Kirchlengern, Germany 4701 Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes
LCexv 4010 Liebherr, Bulle, Switzerland 9005382197172 Refrigerator and freezer -20 °C
Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA EXF24086V  Freezer -80 °C
CoolSafe LaboGene, Lillerød, Denmark 7.001.000.615 Freeze dryer 
UV-2600 Shimadzu, Kyoto, Japan UV-2600 Spectrophotometer 
Hellma absorption cuvettes, semi Micro Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA Z600288  VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm 
Silamat S6 Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein 602286WU Homogenizer 
Solid-glass beads Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA Z273627 Glass bead of the diameter 2 mm
CPA225D-0CE Sartorius AG, Göttingen, Germany SECURA225D-1OBR Analytical balances
C-Phycocyanin from Spirulina sp.  Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA P2172 Phycocyanin standard
Allophycocyanin Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA A7472 Allophycocyanin standard
Bicinchoninic Acid Kit  Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA BCA1, B9643 Complete kit for total proteins determination
AlgaeTron  Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic AG 130-ECO  Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere
Photobioreactor Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic FMT-150 Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment
Cellometer  Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA Auto M10 Cell counter
Corning 15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA CLS430791  15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling
Herasafe KS Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 51024579 Laminar flow hood

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Photometrische Bestimmung des Cyanobakteriums <em>Synechocystis</em> Phycobiliprotein Inhalt
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