Summary
Her presenterer vi en protokoll for å finne kvantitativt phycobiliprotein innhold i cyanobacterium Synechocystis med en Spektrofotometri metode. Utvinning prosedyren ble også brukt til andre Cyanobakterie og alger stammer; men på grunn av variasjoner i pigment absorpsjon spectra er det nødvendig å teste hver stamme Spektrofotometri ligninger individuelt.
Abstract
Dette er en enkel protokoll for kvantitative fastsettelse av phycobiliprotein innhold i modellen cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins er de viktigste komponentene i phycobilisomes, store lys-fangst antenner i Cyanobakterie og flere alger taxa. Phycobilisomes av Synechocystis inneholder to phycobiliproteins: phycocyanin og allophycocyanin. Denne protokollen beskriver en enkel, effektiv og pålitelig metode for kvantitative fastsettelse av både phycocyanin og allophycocyanin i denne modellen cyanobacterium. Vi sammenlignet flere metoder for phycobiliprotein utvinning og Spektrofotometri kvantifisering. Utvinning prosedyren som beskrevet i denne protokollen ble også brukt til andre Cyanobakterie belastninger Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., og Nostoc sp., samt om Rødalger Porphyridium cruentum. Men utryddelse koeffisientene til bestemte phycobiliproteins fra ulike taxa kan variere og, derfor anbefales det å validere Spektrofotometri kvantifisering metoden for hver enkelt belastning individuelt. Den krever lite tid og kan utføres i alle standard biovitenskap laboratorium siden det krever bare standard utstyr.
Introduction
fPhycobiliproteins er vannløselige pigment-protein komplekser som representerer store deler av lys-fangst antenner i prokaryote Cyanobakterie (Cyanophyta) og flere eukaryote taxa (Glaucophyta, Rhodophyta , og Cryptophyta)1. De oppstår hovedsakelig som supramolecular komplekser kalt phycobilisomes, og de er vanligvis festet til overflaten av fotosynteseaktiviteten membraner på stromal side, med unntak av Cryptophyta, hvor phycobiliproteins er lokalisert i den thylakoid lumen2. Fire typer phycobiliproteins er identifisert oppdatert: core allophycocyanin og den eksterne phycocyanin, phycoerythrin og phycoerythrocyanin1. Som de viktigste lys-fangst kompleksene representerer phycobilisomes en av de avgjørende faktorene alger og Cyanobakterie masse kulturer produktivitet. Det har vist at phycobilisomes trunkering kan forbedre biomasse akkumulering under sterkt lys3. På den annen side, under beskjeden eller lav Irradians resulterte antenne trunkering i vekst og biomasse akkumulering reduksjon3,4. Phycobiliproteins brukes kommersielt som mat colorants, farmasi og tilsetningsstoffer, i kosmetisk industri, og fluorescens sonder programmer flowcytometri, fluorescerende immunanalyser og fluorescens mikroskopi5.
Denne protokollen fokuserer på kvantitative fastsettelse av phycobiliproteins i modellen cyanobacterium Synechocystis. Cyanobakterie er de tidligste oxygenic fotosynteseaktiviteten autotrophs; de har dannet jordens biosfære for mer enn 2,4 milliarder år6. De spiller en avgjørende rolle i globale biogeochemical sykluser av nitrogen, karbon, oksygen og andre elementer. Blant Cyanobakterie, en encellet belastning Synechocystis fikk en unik posisjon siden det var den første cyanobacterium med hele genomet sekvensert7,8, er det naturlig transformable av eksogene DNA9, og Det utfører stabil og relativt rask vekst10,11. I Synechocystis, antennen kjernekomponent, allophycocyanin, er forbundet med integrert membran proteiner og den tilknyttede phycocyanin ligger på thylakoid membran periferi.
Flere metoder for phycobiliprotein utvinning og kvantifisering sammenlignes i denne protokollen. Den endelige uttrekket prosedyren ble brukt til Synechocystisog andre Cyanobakterie stammer, inkludert Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira SP., og Nostoc sp., og det ble også brukt til Rødalger Porphyridium cruentum. Derfor må metoden utviklet i denne protokollen betraktes som en universell metode for phycobiliprotein utvinning. Selv om noen av metodene testet utvinning resulterte i høyere totale protein avkastning, her beskrevet utvinning prosedyre forutsatt den høyeste phycobiliprotein gir sammen med lavest innholdet av klorofyll en rest i den phycobiliprotein ekstrakt. Redusere innholdet av klorofyll en var avgjørende for riktig phycocyanin og allophycocyanin Spektrofotometri kvantifisering.
Phycobiliprotein absorpsjon spectra kan variere betydelig mellom ulike alger og Cyanobakterie arter12,13,14,15,16,17 og blant flere stammer av en enkelt Cyanobakterie slekten18. Derfor er bestemte bølgelengder og absorpsjon koeffisientene som brukes til fastsettelse av phycocyanin og allophycocyanin i Synechocystis ikke generelt gjelder for andre stammer. I tillegg inneholder ikke Synechocystis phycoerythrin og phycoerythrocyanin som finnes i noen andre alger og Cyanobakterie. For fastsettelse av phycobiliproteins i stammer enn Synechocystis, er det anbefalt å evaluere hver stamme Spektrofotometri ligninger individuelt.
Selv om protokollen inneholder to lengre trinn (over natten Frysetørring mobilnettet pellets og 1-timers protein utvinning), er den totalantallet phycobiliproteins kvantifiseringen lengre enn 2 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cyanobakterie dyrking
- Dyrke Synechocystis celler i Erlenmeyer flasker eller photobioreactors10,19 i bufret BG11 middels20 å opprettholde en pH på < 10 (f.eksbruker 17 mM HEPES10).
Merk: Standard dyrking betingelser krever en kontrollert temperatur (vanligvis 30 ° C, den optimale temperaturen er 35 ° C)21, belysning (vanligvis et hvitt lys med en intensitet til 800 µmol [fotoner] / [m2·s])21, og en CO 2 forsyning (i 400-mL flatskjerm-photobioreactor, veksten mette CO2 konsentrasjonen er 1700 ppm)21. - For å bestemme kultur tetthet, måle kultur optisk densitet spektrofotometrisk på 730 nm (OD730) med søppel med en lett bane på 1 cm. også telle celler under et mikroskop med en hemocytometer eller en automatisert celle teller.
2. prøver forberedelse
- Arbeid under lav Irradians å hindre phycobiliprotein fornedrelse.
- Innhøstingen 3 x 1 mL kultur suspensjon å trygg-lock rør. Bruk triplicates for estimering tekniske feil i målingen. For å utføre kultur prøvetaking under sterile forhold, høste cellene i laminær hette og følg de riktig arbeider og sikkerhets praksis.
- Sentrifuge cellene på 15.000 x g ved laboratoriet temperatur for 5 min. ta hensyn til riktig balansert sentrifuge rotoren. Etter sentrifugering, forkaste supernatants. Sørg for ikke å forstyrre pellet.
- Sett prøvene i en fryser. For langvarig lagring, holde eksemplene på-80 ° C. Dette er nødvendig for å hindre phycobiliprotein fornedrelse. For kortsiktige lagring er 20 ° C tilstrekkelig.
- Freeze-Dry prøvene over natten. For en skikkelig fryse-tørking prosessen, holde temperaturen på fryse-tørker kondensatoren under 60 ° c. og trykket i fryse-tørker kammeret rundt 1 hPa.
- Etter endt fryse-tørking syklusen, nær røret så snart som mulig for å forhindre reabsorpsjon av vann fra luften.
3. celle homogenisering og pigmenter utvinning
- Legge til fire stykker av glassperler (med en diameter på 2 mm) i hvert eksempel rør og Lukk rørene.
Merk: Når lokket av safe-lock rør brukes for homogenisering er for tynn, kan det bryte under homogenisering; Derfor anbefales bare sikker-lock rør med sterk lokk for denne protokollen. - Homogenize prøvene med paljetter 15 s på en homogenizer laboratorium temperatur.
Merk: En riktig homogenisert prøve er spredt over hele indre overflaten av safe-lock rørene. - Legg 1 mL av PBS buffer (pH 7.4), forkjøles og lagres til 4 ° C, prøvene for å trekke ut phycobiliproteins.
Merk: Dette trinnet på, holde prøvene på is for å hindre nedbrytning av utdraget proteiner. Dette er kritisk. - Bland prøvene med PBS 5 s på homogenizer laboratorium temperatur.
Merk: Etter blanding, prøvene er grønn. - Etter miksing, holde prøvene på is 60 min. Cover isbadet med lokk for å hindre pigmenter nedbrytning.
- Etter 60 min phycobiliprotein utvinning, sentrifuge prøvene 15.000 x g ved 4 ° C i 5 min. ta hensyn til riktig balansere sentrifuge rotoren.
Merk: Etter sentrifugering har nedbryting cyan blått.
4. Phycobiliprotein kvantifisering
- Før Spektrofotometri måling, kalibrere spektrofotometer i den opprinnelige planen med PBS bufferen som en tom.
- Når spektrofotometeret er kalibrert, forkaste PBS fra et spektrofotometer cuvette og Pipetter nedbryting med utdraget phycobiliproteins i stedet for med kasserte bufferen.
- Kvantifisere phycobiliprotein konsentrasjonen spektrofotometrisk, bruker en slit bredde på 0,5 nm.
- Måle absorbansen av phycocyanobilins i phycocyanin og allophycocyanin mot PBS bufferen tomt på 615 nm (en615) og 652 nm (en652) henholdsvis og måle absorbansen av mobilnettet avfall på 720 nm (en720).
- Beregn konsentrasjonen av phycocyanin og allophycocyanin i henhold til formlene (1) og (2) av Bennett og Bogorad12:
Merk: En615, en652og en720 skal passe lineær absorbansen utvalg av spektrofotometeret. Eventuelt fortynne prøven med PBS buffer.
- Omberegne pigment konsentrasjonen i det opprinnelige prøvene. Pigment konsentrasjonen i utvalget samsvarer direkte med resultatene av ligninger (1) og (2) når 1 mL av kultur og 1 mL av utvinning bufferen brukes for analyse. Ved å bruke ulike mengder Cyanobakterie prøver og/eller PBS buffer, skal siste pigment konsentrasjonen beregnes i henhold til formelen (3):
(3)
Merk: Hvis en normalisering phycobiliprotein innhold per celle tørr vekt,-siste pigment konsentrasjonen, skal beregnes i henhold til ligningen (4)
(4)
(3)
(4)5. fastsettelse av cellen vekt (valgfritt)
- Veie tre tom safe-lock rør på analytical saldoer.
Advarsel: Det er viktig at safe-lock rørene er tørr. Ved lagring tørr rør i våte omgivelser, rør i flere timer i en fryse tørketrommel før veiing seg. Manipulere rør forsiktig og bare med Pudderfrie hansker hender for å unngå kontakt mellom materialet og forskeren fingre. Hold alle holdere og sentrifuge rene for å unngå overføring av materiale til rør. - Eksempel 1 x 15 mL kultur suspensjon til 15-mL konisk tube.
- Sentrifuge kultur suspensjon i 15-mL konisk rørene på 4000 x g ved laboratoriet temperatur for 10 min. balanse sentrifuge rotoren med tre ytterligere 15-mL konisk rør, hver som inneholder 15 mL vann. Etter sentrifugering, kaste 12 mL av nedbryting.
- Resuspend pellet i gjenværende nedbryting og overføre 3 x 1 mL av blandingen til tre 1.5-mL safe-lock rør med en pipette. I tilfelle noen rester av pellet forblir i 15-mL konisk røret, legge til 1,5 mL deionisert vann til konisk rør, vortex eller riste røret for å resuspend de resterende pellets og overføre 3 x 0,5 mL av blandingen til tre 1.5-mL safe-lock rør (allerede containi ng 3 x 1 mL av pellets) med en pipette.
Merk: Dele pellet over tre 1.5-mL safe-lock rør kan estimering av tekniske feil av tørrvekt målingen. - Sentrifuge cellene i 1,5-mL safe-lock rør på 15 000 x g ved laboratoriet temperatur for 5 min. balanse sentrifuge rotoren med en ekstra 1.5-mL safe-lock rør som inneholder 1 mL vann. Etter sentrifugering, forkaste supernatants.
- Sett prøvene i fryseren. For langtidslagring, holde eksemplene på-80 ° C; for kortsiktige lagring er 20 ° C tilstrekkelig.
- Freeze-Dry prøvene over natten. For en skikkelig fryse-tørking prosessen, holde temperaturen på fryse tørketrommel kondensatoren under-90 ° C og trykket i fryse-tørker kammeret rundt 1 hPa.
- Etter Frysetørring, Lukk rør og veie prøvene på analytical saldoer.
Merk: Tørrvekt verdien kan brukes for normalisering av phycobiliprotein innholdet per celle tørr vekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For de første metoden testene, Synechocystis ble kultivert som satsvise kulturer i Erlenmeyer flasker på en shaker i BG11 dyrking middels20 (supplert med 17 mM HEPES) ved 25 ° C, under et varmt hvitt lys med en intensitet av 50 µmol (fotoner) / (m 2·s) og med 1% CO2 culturing atmosfære. Under dyrking, kulturer var samplet safe-lock rør og sentrifugeres (15.000 x g laboratorium temperatur i 5 min), nedbryting ble forkastet, og prøvene var enten lagret på-80 ° C og fryse-tørket som forberedelse til den enkelttrinn i denne protokollen eller lagret på 20 ° C eller-80 ° C i komparativ utvinning og quantifications analyse.
Testet utvinning prosedyrer inkludert celle avbrudd av sonication, homogenisering med zirconia perler i PBS buffer og fryse-tining. Resultatene av ulike innhenting oppsummeres i figur 1. Metoden som beskrevet i denne protokollen gitt den høyeste phycobiliproteins gir sammen med lavest klorofyll en forurensning i utvinning bufferen. Klorofyll en ble oppdaget i utvinning bufferen når sonication ble brukt for celle avbrudd. Repeterende sykluser av fryses eksemplene i ultralydbad på is resultert i høyere protein avkastning i utvinning bufferen. Men samtidig, konsentrasjonen av klorofyll en i utvinning bufferen økt (figur 1 innfelt), som utelukket en riktig phycobiliprotein innhold kvantifisering.
Den optimale homogenisering gangen var 15 s. homogenisering både kortere (5 s) og lengre (20 s) perioder gitt litt lavere phycobiliprotein avkastning, som vist i figur 2. Homogenisere cellene med paljetter med 2 mm diameter resulterte i høyeste avkastningen sammenlignet med paljetter med 0,5 mm, 1 mm eller 4 mm diameter, med zirconia perler med 0,5 mm diameter eller med havet sand korn. PBS utvinning bufferen ble testet som den optimale bufferen for phycobiliproteins utvinning (Figur 3). Tillegg av 100 mM NaCl eller 150 mM KCl PBS bufferen eller vann økte ikke phycobiliprotein utvinning effektivitet, og det samme gikk for å bruke 20 mM natrium acetate buffer for utvinning (Figur 3). Optimale phycobiliprotein trekkingen tid var 60 minutter fordi, etter mer tid (opptil 240 minutter), phycobiliprotein konsentrasjonen i utvinning bufferen ikke endret betydelig (Figur 4).
Vi testet spektrofotometer linearitet området for phycobiliprotein måling (figur 5) og forhold flere ligninger av phycobiliprotein kvantifisering, benytter både phycocyanin og allophycocyanin standarder (figur 6). Spektrofotometer brukes i denne protokollen viste en lineær absorbansen varierer mellom 0,1 - 3.0 (figur 5). Siden spektra av protein ekstra hadde sine maksimal absorpsjon rundt 620 nm (en620), og på 652 nm, absorpsjon (en652) var bare 33% av en620 (figur 7), spektrofotometer linearitet for en652 (maksimum allophycocyanin absorbans) ble testet bare opp til et652 av 1,16. Ligninger (1) og (2) av Bennett og Bogorad12 beste gjenoppbyggingen av både phycocyanin og allophycocyanin blant alle testet ligninger (figur 6). Streptomycin sulfate, brukes i flere tidligere studier for eliminering av membran fragmenter som inneholder klorofyll en, ble vist ikke nødvendig for utvinning (figur 7).
For representant eksperimentet, Synechocystis ble dyrket i en photobioreactor25 i et turbidostat regime, der cellene ble opprettholdt i eksponensiell vekstfase innenfor et definert område av optisk tetthet (målt på 680 nm, OD 680) av en kontrollert fortynning av en frisk dyrking middels (BG11 middels buffered med 17 mM HEPES)11,26. Kulturer ble dyrket ved 32 ° C og input luften inneholdt 0,5% CO2. Kulturer ble opplyst med et rødt lys (λmax: 633 nm, λ1/2: 20 nm) av en intensitet av 25-1100 µmol (fotoner) / (m2·s), sammen med et blått lys (λmax: 445 nm, λ1/2: 20 nm) av en intensitet av 25 µmol ( fotoner) / (m2·s). Den optiske densitet for kultur suspensjon ble målt av photobioreactor base, og utvalg av OD680 ble satt til 0.52 - 0.58 (2 x 107 til 4 x 107 celler/mL). Kulturer ble dyrket under hver spesifikke lysintensiteten i minst 24 timer å gi nok tid til å akkumulere. Etter å ha nådd vekst stabilitet, ble kulturer valgt for tørr vekt (ifølge trinn 2.1-2.8 i denne protokollen), celletall og phycocyanin og allophycocyanin. Resultatene av phycobiliprotein evalueringen under økende lys intensiteter er vist i Figur 8. Synechocystis redusert phycobiliprotein innholdet fra 12% av mobilnettet tørrvekt (505 fg/celle) under den laveste Irradians 3% av mobilnettet tørrvekt (280 fg/celle) under den høyeste Irradians.
Figur 1 : Sammenligning av utvinning effektiviteten av metoden beskrevet i denne protokollen med flere referanse metoder. Konsentrasjonen av phycocyanin (striper) og allophycocyanin (hvit barer) i råprotein utdrag ble målt etter ekstraksjon i PBS bufferen for 60 min. metode A er beskrevet i denne protokollen. Metoden B ble endret som følger: etter høsting, cellene var sentrifugeres (15.000 x g laboratorium temperatur i 5 min) og oppbevares ved 20 ° C over natten. De frosne prøvene var sonicated for 120 s på 4 ° C, og phycobiliproteins var utdraget PBS buffer for 60 min. metoden C ble endret fra metoden B ved å lagre pellets høstet celler ved-80 ° C i 30 min, Frysetørring mobilnettet pellets , og legge til PBS buffer tørr pellets. Metode D ble endret fra Chung et al. 16: etter Frysetørring (samme som metode C), 0,25 mL Na-acetate med 1% streptomycin sulfate buffer (pH 5.5) ble lagt til det tørre mobilnettet pellet, sammen med 0,25 mL zirkonium perler (med en diameter på 0,5 mm), og prøvene var homogenisert to ganger for 60 s på homogenizer. Etter homogenisering, en annen 0,5 mL Na-acetatark med 1% streptomycin sulfate buffer (pH 5.5) ble lagt til utvalget, rørene ble vortexed og proteiner ble pakket ut på is for 30 min. metoden E besto av en enkelt frysing-tining syklus i PBS buffer og protein utvinning 24 h på 4 ° C. Metoden F (innfelt figur) besto av én til seks sykluser av frysing cellene (først fryse-tørket og resuspended i PBS buffer) i flytende nitrogen, etterfulgt av sonication på is. På grunn av betydelig klorofyll en tilstedeværelse i råprotein utdrag, var phycobiliproteins ikke kvantifisert i metode F. Avbildet verdiene representerer gjennomsnitt fra tre tekniske gjentak, med feilfeltene representerer standardavvik. Pigment konsentrasjoner ble beregnet etter ligninger (1) og (2) i denne protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Effekt av homogenisering tiden på phycobiliprotein utvinning effektiviteten. Lyofilisert pellets Synechocystis celler (etter trinn 3.1-3,5 av denne protokollen) ble avbrutt med paljetter på homogenizer for 5 s, 15 s og 20 s. Avbildet verdiene representerer gjennomsnitt fra tre tekniske gjentak, med feilfeltene representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Phycobiliprotein utvinning effektivitet i ulike utvinning buffere. Phycobiliproteins ble pakket ut i PBS bufferen, i PBS bufferen med et tillegg på 100 mM NaCl eller 150 mM KCl, i deionisert vann med 100 mM NaCl eller 150 mM KCl, ifølge Hemlata og Fareha22, og i 20 mM natrium acetate ifølge Chung et al < / C4 >. 16. utvinning ble utført på 4 ° C etter trinn 4.1-4.3 av denne protokollen. Avbildet verdiene representerer gjennomsnitt fra tre tekniske gjentak, med feilfeltene representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Phycobiliprotein stabilitet i utvinning bufferen tidsnok. Etter utvinning prosedyren utføres som beskrevet i trinn 4.1-4.3 på denne protokollen, lagret phycobiliprotein ekstrakt i PBS buffer (pH 7.4) på 4 ° C i opptil 4 timer, uten betydelig phycocyanin (sirkler) og allophycocyanin (ruter) degradering. Den stiplede linjen representerer den lineære passformen til tidspunkt beregnet med minste kvadraters metode. Avbildet verdiene representerer gjennomsnitt fra tre tekniske gjentak, med feilfeltene representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Representant mål for phycocyanin og allophycocyanin i Synechocystis. En tett kultur suspensjon (phycocyanin: 456 µg/mL, allophycocyanin: 106 µg/mL) ble gradvis utvannet til en konsentrasjon av 19 µg/mL for både phycocyanin og allophycocyanin. Avbildet verdiene representerer gjennomsnitt fra tre tekniske gjentak, med feilfeltene representerer standardavvik. Den stiplede linjen representerer den lineære passformen til konsentrasjon poeng beregnet med minste kvadraters metode. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Estimering av phycocyanin og allophycocyanin konsentrasjoner i pigmenter standarder. Phycocyanin og allophycocyanin i pigment standarder ble spektrofotometer ifølge ligningene Bennett og Bogorad12, Lüder et al. 13, Sampath-Wiley og Neefus15, Evans14og Chung et al. 16. proteininnholdet i standarder (som nødvendig for phycobiliproteins vilje) ble kvantifisert bruker en løsning bicinchoninic acid, natriumkarbonat, natrium tartrate og natrium bikarbonat i 0,1 N NaOH (med en siste pH på 11,25), i reaksjon med 4% (w/v) copper(II) sulfate pentahydrate27, med bovin serum albumin som et protein som er standard. Ligninger av Bennett og Bogorad gitt høyeste gjenoppbyggingen av både pigmenter: 96% av phycocyanin standard og 99% av allophycocyanin standard. Avbildet verdiene representerer gjennomsnitt fra tre tekniske gjentak, med feilfeltene representerer standardavvik. Den stiplede linjen understreker 100% poenget. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Effekten av streptomycin sulfate på absorpsjon spekteret av grov protein ekstrakt i PBS bufferen. (A) utvinning prosedyre som beskrevet i trinnene 4.1-4.3 til denne protokollen eller (B) bruke sonication som beskrevet i legenden om figur 1 for metoden F ble utført i PBS buffer (sirkler) og i PBS buffer med 1% Streptomycin sulfate (ruter). Phycobiliprotein kvantifiseringen ble utført i henhold til trinnene 5.1-5.4 av denne protokollen. Avbildet verdiene representerer gjennomsnitt fra tre tekniske gjentak, med feilfeltene representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8 : Konsentrasjonen av phycocyanin (sirkler) og allophycocyanin (ruter) i Synechocystis dyrket under rød-oransje lys av en intensitet av 25-1100 µmol(photons)/(m2·s). Synechocystis kulturer ble dyrket i et photobioreactor på 32 ° C, med 0,5% CO2 i input luften i BG11 dyrking medium med 17 mM HEPES i en turbidostat-regimet etter Zavrel et al. 11. phycobiliprotein-konsentrasjoner ble målt i henhold til denne protokollen og siste phycobiliprotein innholdet var normalisert per mobilnettet tørr vekt, som beskrevet i del 2 av denne protokollen. De stiplede linjene representerer den makt passformen til målt poeng, beregnet med minste kvadraters metode. Avbildet verdiene representerer gjennomsnitt fra tre tekniske gjentak, med feilfeltene representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en enkel, rask og reproduserbar metode for kvantifisering av phycobiliprotein innhold i modellen cyanobacterium Synechocystis. Flere metoder for cellen homogenisering, protein utvinning og phycocyanin og allophycocyanin kvantifisering blir sammenliknet, og den endelige protokollen representerer en kombinasjon av optimal trinnene på hver enkelt prosedyre. Som representant, ble innholdet i phycobiliproteins kvantifisert i Synechocystis celler under økende lysintensiteten. Selv om analysen krever samme tid og laboratorieutstyr som noen av de tidligere publiserte metoder12,13,14,15,16, er fordelen med denne protokollen at ingen klorofyll en slippes ut i utvinning bufferen, og dermed phycobiliprotein målingen bestemmes med høy presisjon.
Mengden av cellen suspensjon kreves for phycobiliprotein analyse kan variere kultur tetthet. Eksempel volumet av 1 mL er optimalisert for kulturer med et OD730 på 1.5, en celle tetthet av ca 2 x 107 celler/mL eller kulturer med phycobiliprotein innhold av ca 20 mg/L. Ved utvannet kulturer, høste en større kultur-volum. Derimot, når det gjelder tett kulturer, høste en lavere kultur volum i høy tetthet kulturer er det en risiko for at phycobiliproteins delvis forblir i cellene etter utvinning. Tilsvarende beløpet celle suspensjon kreves for tørr vekt fastsettelse kan variere med kultur tetthet. Prøvetaking volumet av 15 mL er optimalisert for kulturer med et OD730 på 1,5 eller en celle tetthet av ca 2 x 107 celler/mL. Med lavere tetthet kulturer eller lavere volumer, kan måling feilen øke. Tvert imot, gir større kultur volumer eller tettere kulturer bedre metode oppløsninger.
Avgjørende skritt av protokollen er cellen homogenisering og phycobiliprotein utvinning som skal gi både høy avkastning og høy spesifisitet. Den høyeste avkastning og renhet av ekstrakter med samtidige maksimal protein bevaring ble oppnådd ved Frysetørring prøvene, homogenisere tørr mobilnettet pellets av glassperler og utføre phycobiliprotein utvinning i PBS buffer ( Figur 1). Siden selv en liten forurensning av råprotein ekstrakt av klorofyll en kan føre til en phycobiliprotein innhold overvurdering, er det nødvendig å unngå noen klorofyll en utvinning ved å legge til PBS bufferen. Klorofyll en ble oppdaget i råolje utdrag da sonication ble brukt for celle avbrudd. Som vist i rammemargen i figur 1, med gjentatte sonication sykluser, mengden av klorofyll en i utdrag økt. På den annen side, mengden utdraget proteiner (som gjenkjent ved absorbansen på 280 nm) også økt etter gjentatte sonication sykluser. Derfor bruk av sonication (i kombinasjon med frysing-tining sykluser i flytende nitrogen) vises som en egnet metode for totalt protein utvinning (både gratis og membran-bundet proteiner er løslatt fra cellene); Det anbefales imidlertid ikke for å phycobiliprotein Spektrofotometri kvantifisering. Chung et al. anbefalt bruk av 1% streptomycin sulfate for å eliminere membran fragmenter med klorofyll en16. Her, syntes bruk av streptomycin sulfate ikke å være nødvendig, siden det ikke føre til en reduksjon av klorofyll en i protein ekstraktet (figur 7). Selv om en enkelt sonication syklus for 120 s ikke forstyrre cellene effektivt (metoder B og C, figur 1), andre metoder (f.eks, metode F som presentert i figur 1 eller metoder i figur 7B) bekreftet tidligere funn av sonication blir en effektiv celle avbrudd metoden22,28. På den annen side, gitt enkel frysing-tining sykluser, også tidligere rapportert som en effektiv metode for phycobiliproteins utvinning22,28, de laveste rentene i testene beskrevet her (metode E, figur 1 ). Celle homogenisering (i utvinning bufferen, 2 x 60 s) av zirkonium perler ble testet som mindre effektiv enn 15-s homogenisering av det fryse-tørket mobilnettet pellet (metode D, figur 1). Homogenisering prosedyren i utvinning bufferen ble beskrevet tidligere med en lengre homogenisering tid (10 min)29. Vi teste ikke homogenisering lenger enn 2 min siden prøvene varmet opp betydelig under hver homogenisering cycle. I litteraturen var andre celle avbrudd metoder også beskrevet, inkludert bruken av en fransk trykk16 eller griding13,15,30; men ble slike metoder ikke testet i denne studien.
Protein utvinning ble utført for 15 s (figur 2) i PBS buffer. Buffer pH var 7.4, som ble rapportert tidligere som optimalt for phycobiliprotein utvinning22. Tillegg av NaCl eller KCl ble ikke bedre phycobiliprotein utvinning effektivitet (Figur 3), som er motsigelsen tidligere observasjoner22. Men, som vist i Figur 3, saltvann fosfat-bufret i denne protokollen inneholdt 154 mM NaCl (i tillegg til 5,6 mM Na2HPO4 og 1 mM KH2PO4), som ikke tillater oss å etablere den NaCl-fri PBS utvinning bufferen som en kontroll. Vi har også sammenlignet PBS buffer og natrium acetate buffer16 utvinning effektivitet. Kombinasjonen av natrium fosfat og kalium fosfat i PBS bufferen gitt høyere phycobiliproteins gir (Figur 3). Dette funnet korresponderte med tidligere funn av Hemlata et al. 22.
Phycobiliprotein trekkingen tid var optimalisert for 1 h. lengre utvinning ikke føre til betydelig phycobiliprotein fornedrelse eller utvinning forbedring (Figur 4), som korresponderte med tidligere arbeid av Lawrenz et al. 28. en utvinning tid kortere enn 1 time ikke ble testet. Tilsvarende ble utvinning mer enn 4 h ikke testet siden det ble funnet tidligere at de utpakkede phycobiliproteins i fosfat bufferen er stabil for minst 48 h28.
Vi sammenlignet flere ligninger av Spektrofotometri phycocyanin og allophycocyanin kvantifisering som beskrevet tidligere i litteraturen, ved å beregne innholdet i begge phycobiliproteins i kommersielle standarder med kjente protein konsentrasjoner (figur 6). Beste gjenoppbyggingen av både pigmenter ble oppnådd med ligningene Bennett og Bogorad12. Dette resultatet var ikke gjelder for fosfat utvinning buffer siden slik en buffer har vært brukt tidligere12,13,15. Det var ingen spesifikke pigment standarder siden forskjellen mellom en615, en618og en620 (bølgelengder brukes for phycocyanin anslag i tidligere arbeider) i phycocyanin standard var 1% og forskjellen mellom en 650 og en652 (bølgelengder brukt allophycocyanin estimering12,13,14,16) allophycocyanin standard var 3%. Tilsvarende var forskjellen mellom en615 og en620 i protein ekstrakt av Synechocystis bare 2%. Slike små forskjeller i absorpsjon spectra resultere ikke i en siste pigment variant av opptil 36% (figur 6). Derfor knyttet forskjellene mellom individuelle ligningene heller til variasjoner i phycobiliprotein utryddelse koeffisientene av bestemte organismer12,13,14, 15 , 16 , 17. interessant likningene av Chung et al. gitt den laveste phycocyanin rekonstruksjonen (figur 6) selv om forfatterne også brukt Synechocystis for sine eksperimenter16.
I stedet for fastsettelse av enkelt bølgelengder, anbefales det å måle et kontinuerlig spekter av phycobiliprotein ekstrakt mellom 280-720 nm, beregne tilstedeværelsen av klorofyll en i utdrag, som kan forstyrre både den allophycocyanin og phycocyanin absorpsjon. Videre ved å måle absorbansen på 280 nm (en280), renhet av både phycocyanin (en615/A280 eller en620/A280)21,22 og allophycocyanin (en652/A280) 24 i ekstrakt kan estimeres (0.7: mat grade, 3.9: reaktiv klasse, > 4.0: analytisk klasse)21.
Som representant identifiserte konsentrasjonen av både phycocyanin og allophycocyanin i Synechocystis under økende lysintensiteten. Opprettholde kultur tettheten på et konstant nivå innenfor en turbidostat dyrking regimet11var,21 avgjørende for direkte sammenlignende eksperimentet. Phycocyanin og allophycocyanin konsentrasjonen av 2.4% - 10,2% og 0,6% - 1,7% av mobilnettet tørr vekt, henholdsvis var lik som den tidligere rapportert verdier11,31,32. Også var phycobiliprotein innhold per celle grunnlaget som rapportert tidligere11,33. Med økende lys redusert phycobiliproteins innhold. Interessant, selv under høyeste lysintensiteten til 1100 µmol (fotoner) / (m2·s), phycobiliproteins var ikke helt bleket.
Siden protokollen krever bare standardutstyr og er relativt rask, kan det lett vedtatt i et laboratorium som analyseres rutinemessig phycobiliproteins.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Protokollen ble innført fra en tidligere publikasjon11. T. Z., D. Ch. og J. Č. ble støttet av departementet for utdanning, ungdom og sport Tsjekkias nasjonale bærekraft programmet jeg (NPU jeg), gi nummer LO1415. J. Č. ble også støttet av GA CR, bevilgning nummer 18-24397S. Tilgang til instrumenter og andre fasiliteter ble støttet av tsjekkiske forskning infrastrukturen for systemer biologi C4SYS (project ikke LM2015055). M. A. S. ble støttet av et stipend fra russisk Science Foundation [nr. 14-14-00904].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | Institut Pasteur, Paris, France | 6803 | Cyanobacterium strain |
| Roti-CELL PBS | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 9143.1 | Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4 |
| Eppendorf safe-lock tubes | Eppendorf, Hamburk, Germany | 30120086 | Safe-lock tubes 1.5 ml |
| VWR 80-Place Storage System | VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA | 30128-282 | Holder for safe-lock tubes |
| RAININ 100 µl -1000 µl | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 17014382 | Pipette |
| GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8 | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 30389272 | Pipette tips |
| Rotina 420R | Hettich, Kirchlengern, Germany | 4701 | Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes |
| LCexv 4010 | Liebherr, Bulle, Switzerland | 9005382197172 | Refrigerator and freezer -20 °C |
| Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | EXF24086V | Freezer -80 °C |
| CoolSafe | LaboGene, Lillerød, Denmark | 7.001.000.615 | Freeze dryer |
| UV-2600 | Shimadzu, Kyoto, Japan | UV-2600 | Spectrophotometer |
| Hellma absorption cuvettes, semi Micro | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z600288 | VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm |
| Silamat S6 | Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein | 602286WU | Homogenizer |
| Solid-glass beads | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z273627 | Glass bead of the diameter 2 mm |
| CPA225D-0CE | Sartorius AG, Göttingen, Germany | SECURA225D-1OBR | Analytical balances |
| C-Phycocyanin from Spirulina sp. | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P2172 | Phycocyanin standard |
| Allophycocyanin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | A7472 | Allophycocyanin standard |
| Bicinchoninic Acid Kit | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | BCA1, B9643 | Complete kit for total proteins determination |
| AlgaeTron | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | AG 130-ECO | Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere |
| Photobioreactor | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | FMT-150 | Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment |
| Cellometer | Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA | Auto M10 | Cell counter |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS430791 | 15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling |
| Herasafe KS | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 51024579 | Laminar flow hood |
References
- Mimuro, M., Kikuchi, H. Antenna Systems and Energy Transfer in Cyanophyta and Rhodophyta. Light-Harvesting Antennas in Photosynthesis. Green, B. R., Parson, W. W. , Springer. Dordrecht, The Netherlands. 281-306 (2003).
- Spear-bernstein, L., Miller, K. R. Unique location of the phycobiliprotein light-harvesting pigment in the Cryptophyceae. Journal of Phycology. 25 (3), 412-419 (1989).
- Kirst, H., Formighieri, C., Melis, A. Maximizing photosynthetic efficiency and culture productivity in cyanobacteria upon minimizing the phycobilisome light-harvesting antenna size. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1837 (10), 1653-1664 (2014).
- Page, L. E., Liberton, M., Pakrasi, H. B. Reduction of photoautotrophic productivity in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 by phycobilisome antenna truncation. Applied and Environmental Microbiology. 78 (17), 6349-6351 (2012).
- Sonani, R. R. Recent advances in production, purification and applications of phycobiliproteins. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 100 (2016).
- Bryant, D. A. The Molecular Biology of Cyanobacteria. , Springer Netherlands. Dordrecht, The Netherlands. (1994).
- Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. I. Sequence features in the 1 Mb region from map positions 64% to 92% of the genome. DNA Research. 2, 191-198 (1995).
- Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. II. Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein-coding regions. DNA Research. 3, 109-136 (1996).
- Grigorieva, G., Shestakov, S. Transformation in the cyanobacterium Synechocystis sp 6803. FEMS Microbiology Letters. 13 (4), 367-370 (1982).
- Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp: PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), (2015).
- Zavřel, T., Očenášová, P., Červený, J. Phenotypic characterization of Synechocystis sp. PCC 6803 substrains reveals differences in sensitivity to abiotic stress. PLoS One. 12 (12), e0189130 (2017).
- Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaption in a filamentous blue-green alga. The Journal of Cell Biology. 58, 419-435 (1973).
- Lüder, U. H., Knoetzel, J., Wiencke, C. Acclimation of photosynthesis and pigments to seasonally changing light conditions in the endemic antarctic red macroalga Palmaria decipiens. Polar Biology. 24 (8), 598-603 (2001).
- Evans, L. V. The effects of spectral composition and irradiance level on pigment levels in seaweeds. Experimental Phycology: A Laboratory Manual. Lobban, C. S., Chapman, D. J., Kremer, B. P. , Cambridge University Press. Cambridge, New York, New Rochelle, Melbourne, Sydney. 123-133 (1988).
- Sampath-Wiley, P., Neefus, C. D. An improved method for estimating R-phycoerythrin and R-phycocyanin contents from crude aqueous extracts of Porphyra (Bangiales, Rhodophyta). Journal of Applied Phycology. 19 (2), 123-129 (2007).
- Chung, Y. H., Park, Y. M., Moon, Y. J., Lee, E. M., Choi, J. S. Photokinesis of Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Photoscience. 11 (3), 89-94 (2004).
- Sun, L., et al. Phycobilisomes from Cyanobacteria. Handbook on Cyanobacteria: Biochemistry, Biotechnology and Applications. Gault, P. M., Marler, H. J. , Nova Science Publishers, Inc. New York, NY. 105-160 (2009).
- Six, C., et al. Diversity and evolution of phycobilisomes in marine Synechococcus spp.: A comparative genomics study. Genome Biology. 8 (12), (2007).
- Sinetova, M. A., Červený, J., Zavřel, T., Nedbal, L. On the dynamics and constraints of batch culture growth of the cyanobacterium Cyanothece sp. ATCC 51142. Journal of Biotechnology. 162 (1), (2012).
- Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, M., Cohen-Bazire, G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacteriological Reviews. 35 (2), 171-205 (1971).
- Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), 122-132 (2015).
- Hemlata, G., Fareha, B. Studies on Anabaena sp. nccu-9 with special reference to phycocyanin. Journal of Algal Biomass Utilization. 2 (1), 30-51 (2011).
- Rito-Palomares, M., Nuez, L., Amador, D. Practical application of aqueous two-phase systems for the development of a prototype process for c-phycocyanin recovery from Spirulina maxima. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 76 (12), 1273-1280 (2001).
- Zhang, H., et al. Selenium-Containing Allophycocyanin Purified from Selenium-Enriched Spirulina platensis Attenuates AAPH-Induced Oxidative Stress in Human Erythrocytes through Inhibition of ROS Generation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (16), 8683-8690 (2011).
- Nedbal, L., Trtílek, M., Cervený, J., Komárek, O., Pakrasi, H. B. A photobioreactor system for precision cultivation of photoautotrophic microorganisms and for high-content analysis of suspension dynamics. Biotechnology and Bioengineering. 100 (5), 902-910 (2008).
- Zavřel, T., Knoop, H., Steuer, R., Jones, P. R., Červený, J., Trtílek, M. A quantitative evaluation of ethylene production in the recombinant cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 harboring the ethylene-forming enzyme by membrane inlet mass spectrometry. Bioresource Technology. 202, 142-151 (2016).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Lawrenz, E., Fedewa, E. J., Richardson, T. L. Extraction protocols for the quantification of phycobilins in aqueous phytoplankton extracts. Journal of Applied Phycology. 23 (5), 865-871 (2011).
- Lea-Smith, D. J., et al. Phycobilisome-Deficient Strains of Synechocystis sp. PCC 6803 Have Reduced Size and Require Carbon-Limiting Conditions to Exhibit Enhanced Productivity. Plant Physiology. 165 (2), 705-714 (2014).
- Seo, Y. C., et al. Stable isolation of phycocyanin from Spirulina platensis associated with high-pressure extraction process. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1778-1787 (2013).
- Touloupakis, E., Cicchi, B., Torzillo, G. A bioenergetic assessment of photosynthetic growth of Synechocystis sp. PCC 6803 in continuous cultures. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 133 (2015).
- Touloupakis, E., Cicchi, B., Benavides, A. M. S., Torzillo, G. Effect of high pH on growth of Synechocystis sp. PCC 6803 cultures and their contamination by golden algae (Poterioochromonas sp.). Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1333-1341 (2016).
- Ishii, A., Hihara, Y. An AbrB-Like Transcriptional Regulator, Sll0822, Is Essential for the Activation of Nitrogen-Regulated Genes in Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Physiology. 148 (1), 660-670 (2008).
