Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att kvantitativt bestämma phycobiliprotein innehåll i Cyanobakterien Synechocystis med en spektrofotometrisk metod. Extraktionsmetod tillämpades också till andra cyanobakterier och alger stammar; på grund av variationer i pigment Absorptionsspektra är det dock nödvändigt att testa spektrofotometrisk ekvationerna för varje stam individuellt.
Abstract
Detta är ett enkelt protokoll för kvantitativ bestämning av phycobiliprotein innehåll i den modell Cyanobakterien Synechocystis. Phycobiliproteins är de viktigaste komponenterna i phycobilisomes, stora ljus-skörd antenner i cyanobakterier och flera alger taxa. Phycobilisomes av Synechocystis innehåller två phycobiliproteins: phycocyanin och allophycocyanin. Det här protokollet beskriver en enkel, effektiv och tillförlitlig metod för kvantitativ bestämning av både phycocyanin och allophycocyanin i denna modell Cyanobakterien. Vi jämförde flera metoder för phycobiliprotein utvinning och spektrofotometrisk kvantifiering. Extraktionsmetod som beskrivs i detta protokoll tillämpades också till andra cyanobakterier stammar såsom Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., och Nostoc sp., samt att röda alger Porphyridium cruentum. Dock utrotning koefficienter av specifika phycobiliproteins från olika taxa kan variera och därför rekommenderas att validera metoden spektrofotometrisk kvantifiering för varje enskild stam individuellt. Protokollet kräver lite tid och kan utföras i ett laboratorium som standard life science eftersom det kräver endast standardutrustning.
Introduction
fPhycobiliproteins är vattenlösliga pigment-proteinkomplex som representerar stora delar av ljus-skörd antenner i prokaryota cyanobakterier (Cyanophyta) och flera eukaryota taxa (Glaucophyta, Rhodophyta , och Cryptophyta)1. De förekommer främst som Supramolekylära komplex kallas phycobilisomes och de är oftast knutna till ytan av fotosyntetiska membran på stromaceller sida, med undantag för Cryptophyta, där phycobiliproteins är lokaliserade i de tylakoida lumen2. Fyra typer av phycobiliproteins har identifierats upp till datum: den core allophycocyanin och perifera phycocyanin, phycoerythrin och phycoerythrocyanin1. Som de viktigaste ljus-skörd komplex representerar phycobilisomes en av de avgörande faktorerna av alger och cyanobakterier massa kulturer produktivitet. Det har visats att phycobilisomes trunkering kan förbättra biomassa ackumulering under starkt ljus3. Däremot, under blygsamma eller låg irradians resulterade antenn trunkering i tillväxttakten och biomassa ackumulering minskning3,4. Phycobiliproteins används kommersiellt som mat färgämnen, läkemedel och livsmedelstillsatser, i den kosmetiska industrin, samt fluorescens sonder med tillämpningar i flödescytometri, fluorescerande immunanalyser och fluorescence mikroskopi5.
Detta protokoll fokuserar på kvantitativ bestämning av phycobiliproteins i den modell Cyanobakterien Synechocystis. Cyanobakterier är de tidigaste syrerik fotosyntetiska autotrofer; de har bildar jordens biosfär för mer än 2,4 miljarder år6. De har en avgörande roll i globala biogeokemiska cykler av kväve, kol, syre och andra element. Bland cyanobakterier, en encellig stam Synechocystis fick en särställning eftersom det var den första Cyanobakterien med hela genomet sekvenserade7,8, är det naturligt omvandlingsbara av exogent DNA9, och utför stabil och relativt snabb tillväxt10,11. I Synechocystis, antenn Huvudkomponenten, allophycocyanin, är associerade med de integrerad membranproteiner, och den bifogade phycocyanin ligger på tylakoida membran periferin.
Flera metoder för phycobiliprotein utvinning och kvantifiering jämförs i detta protokoll. Den slutliga extraktionsmetod tillämpades till Synechocystissamt till andra cyanobakterier stammar, inklusive Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira SP., och Nostoc sp., och det var också tillämpats korrekt rödalger Porphyridium cruentum. Den metod som utvecklats i detta protokoll kan därför betraktas som en generell metod för extraktion av phycobiliprotein. Även om några av de testade extraktionsmetoder resulterade i högre totalprotein avkastning, här beskrivs extraktionsmetod förutsatt den högsta phycobiliprotein ger tillsammans med det lägsta innehållet av klorofyll en resthalt i den phycobiliprotein extrakt. Att minska innehållet av klorofyll en var viktigt för rätt phycocyanin och allophycocyanin spektrofotometrisk kvantifiering.
Phycobiliprotein vis-absorptionsspektra kan variera betydligt mellan olika alger och cyanobakterier arter12,13,14,15,16,17 och även bland flera stammar av en enda cyanobakterier släkte18. Därför, den specifika våglängder och absorption koefficienter som används för bestämning av phycocyanin och allophycocyanin i Synechocystis är inte allmänt tillämpliga för andra stammar. Dessutom innehåller inte Synechocystis fykoerytrin och phycoerythrocyanin som kan hittas i vissa andra alger och cyanobakterier. För bestämning av phycobiliproteins i stammar än Synechocystisrekommenderas det att utvärdera spektrofotometrisk ekvationerna för varje stam individuellt.
Även om protokollet innehåller två längre steg (övernattning frystorkning av cellulära pellets och 1 timmes protein utvinning), är den totala arbetstid för phycobiliproteins kvantifiering inte längre än 2 timmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cyanobakterier odling
- Odla Synechocystis celler i Erlenmeyer-kolvar eller fotobioreaktorer10,19 i buffrad BG11 medium20 att upprätthålla pH-värdet < 10 (t.ex., med 17 mM HEPES10).
Obs: Standard odling förhållanden kräver en kontrollerad temperatur (30 ° C, den optimala temperaturen är vanligtvis 35 ° C)21, belysning (vanligtvis ett vitt ljus med en intensitet upp till 800 µmol [fotoner] / [m2·s])21och en CO 2 utbudet (i den 400 mL platta photobioreactor, tillväxten mättar CO2 -koncentration är 1 700 ppm)21. - För att bestämma densiteten kultur, mäta kultur optisk densitet mäts spektrofotometriskt vid 730 nm (OD730) med en kyvetten med en ljus väg på 1 cm. Alternativt räkna cellerna under ett Mikroskop med en hemocytometer eller en automatiserad cell räknaren.
2. prov förberedelse
- Arbeta under låg irradians att förhindra phycobiliprotein nedbrytning.
- Skörda 3 x 1 mL kultur suspension till säker-lås rör. Användning tripletter för skattning av tekniska fel i mätningen. För att utföra kultur provtagning under sterila förhållanden, skörda cellerna i en laminär huva och följer korrekt fungerande och säkerhet praxis.
- Centrifugera cellerna vid 15 000 x g vid laboratoriet temperatur för 5 min. uppmärksamma den väl avvägda centrifugrotorns. Efter centrifugering, kassera supernatanterna. Var noga med att inte störa pelleten.
- Lägg proverna i en frys. För långsiktig lagring, hålla proverna vid-80 ° C. Detta är nödvändigt för att förhindra phycobiliprotein nedbrytning. För korttidslagring är-20 ° C tillräckligt.
- Kaseinbanden proverna över natten. För en korrekt frystorkning process, hålla temperaturen frystork kylarens nedan-60 ° C och trycket i frystork kammaren runt 1 hPa.
- Efter avslutad frystorkning cykeln, Stäng tuben så snart som möjligt för att förhindra reabsorption av vatten från luften.
3. cell homogenisering och pigment utvinning
- Lägga till fyra bitar av glaspärlor (med en diameter av 2 mm) i varje prov tub och Stäng rören.
Obs: När locket på säker-lås röret används för homogenisering är för tunn, det kan bryta under homogenisering; Därför rekommenderas endast säker-lås rören med stark lock för detta protokoll. - Homogenisera proverna med glaspärlor för 15 s på en Homogenisatorer vid laboratoriet temperatur.
Obs: En korrekt homogeniserade provet är spridda över hela insidan av säker-lås rören. - Tillsätt 1 mL PBS-bufferten (pH 7,4), förhandskyld till 4 ° C, till proverna för att extrahera phycobiliproteins.
Obs: Från detta steg på, hålla proverna på is för att förhindra nedbrytning av de extraherade proteinerna. Detta är avgörande. - Blanda proverna med PBS för 5 s på homogenisatorn vid laboratoriet temperatur.
Obs: Efter blandning, proven är grönaktiga. - Efter blandning, hålla proverna på is för 60 min. locket isbadet med ett lock för att förhindra pigment nedbrytning.
- Efter 60 min phycobiliprotein utvinning, Centrifugera proverna vid 15 000 x g vid 4 ° C i 5 min. uppmärksamma ordentligt för att balansera centrifugrotorns.
Obs: Efter centrifugeringen, supernatanten har en cyan blå färg.
4. Phycobiliprotein kvantifiering
- Före den spektrofotometrisk mätningen kalibrera spektrofotometern med baslinjen med PBS-bufferten som en tom.
- När spektrofotometern är kalibrerad, kasta PBS från en spektrofotometer kyvetten och Pipettera supernatanten med extraherade phycobiliproteins i stället för med kasserade bufferten.
- Kvantifiera phycobiliprotein koncentrationen spektrofotometriskt, med en skåra bredd 0,5 nm.
- Mät absorbansen hos phycocyanobilins i phycocyanin och allophycocyanin mot PBS-bufferten tomt på 615 nm (en615) och 652 nm (en652), respektive, och Mät absorbansen hos de cellulära skräpet på 720 nm (en720).
- Beräkna koncentrationen av phycocyanin och allophycocyanin enligt ekvationerna (1) och (2) av Bennett och Bogorad12:
Obs: En615, en652och en720 bör passa till området linjär absorbansen av spektrofotometern. Vid behov späd provet med PBS-bufferten.
- Beräkna koncentrationen av pigment i de ursprungliga proverna. Pigment koncentrationen i provet motsvarar direkt med resultaten av ekvationerna (1) och (2) när 1 mL av kulturen och 1 mL utvinning bufferten används för analys. Vid användning av olika volymer av cyanobakterier prover eller PBS-bufferten, bör den slutliga pigment koncentrationen beräknas enligt ekvation (3):
(3)
Obs: Vid ett normaliserande phycobiliprotein innehåll per cell torr vikt, den slutliga pigment koncentrationen bör beräknas enligt ekvation (4)
(4)
(3)
(4)5. fastställande av cellen torrvikt (tillval)
- Väga tre tomma säker-lås rör på analytisk saldon.
Varning: Det är viktigt att säker-lås rören är torra. Vid lagring av torra rören i fuktig miljö, rören i flera timmar i en torktumlare före vägning dem frysa. Manipulera rören försiktigt och endast med puderfria handskar på händerna att undvika kontakt mellan materialet och forskarens fingrar. Hålla alla innehavare och centrifugera rent för att undvika överföring av material till rören. - Prov 1 x 15 mL kultur suspension till 15 mL koniska rör.
- Centrifugera kultur suspensionen i 15 mL koniska rören vid 4000 x g vid laboratoriet temperatur under 10 min. balans centrifug rotorn med tre ytterligare 15 mL koniska rör, varje innehållande 15 mL vatten. Efter centrifugering, kassera 12 mL av supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i återstående supernatanten och överför 3 x 1 mL av blandningen till tre 1,5 mL säker-lås rör med en pipett. Om några rester av pelleten kvar i 15 mL koniska röret, lägga till 1,5 mL avjoniserat vatten till konisk tube, vortex eller skaka röret att resuspendera resterande pellet och överföra 3 x 0,5 mL av blandningen till tre 1,5 mL säker-lås rören (redan containi ng 3 x 1 mL av pelleten) med en pipett.
Obs: Dividera pelleten över tre 1,5 mL säker-lås rör gör att uppskattningen av något tekniskt fel av torr vikt mätningen. - Centrifugera cellerna i 1,5 mL säker-lås rör vid 15 000 x g vid laboratoriet temperatur för 5 min. balans centrifug rotorn med en ytterligare 1,5 mL säker-lås röret som innehåller 1 mL vatten. Efter centrifugeringen, kassera supernatanterna.
- Lägg proverna i frysen. För långsiktig lagring, hålla proverna vid-80 ° C; för kortsiktig lagring är-20 ° C tillräckligt.
- Kaseinbanden proverna över natten. För en korrekt frystorkning process, hålla temperaturen av frysning torktumlare kondensorn under-90 ° C och trycket i frystork kammaren runt 1 hPa.
- Efter frystorkning, Stäng rören och väga proverna på analytisk saldon.
Obs: Torr viktvärdet kan användas för normalisering av phycobiliprotein innehåll per cell torrvikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För den ursprungliga metod för proven Synechocystis odlades som batch kulturer i Erlenmeyer-kolvar på en shaker i BG11 odling medium20 (kompletteras med 17 mM HEPES) vid 25 ° C, under ett varmvitt ljus av en stödnivå på 50 µmol (fotoner) / (m 2·s) och med 1% CO2 i culturing atmosfären. Under odling, kulturerna var provtas säker-lås rör och centrifugeras (15 000 x g på laboratoriet temperatur under 5 minuter), supernatanten förkastades, och proverna var antingen lagras vid-80 ° C och frystorkat som förberedelse för den enskilda stegen i detta protokoll eller lagras vid-20 ° C eller -80 ° C för jämförande analys för utvinning och kvantifieringar.
De testade extraktionsprocessen ingår cell störningar av ultraljudsbehandling, homogenisering med zirkonia pärlor inom PBS-bufferten och frysa-upptining. Resultaten av olika extraktionsmetoder sammanfattas i figur 1. Metoden som beskrivs i detta protokoll som den högsta phycobiliproteins ger tillsammans med den lägsta klorofyll en föroreningen i utvinning bufferten. Klorofyll en upptäcktes i utvinning bufferten när ultraljudsbehandling användes för cell störningar. Upprepade cykler av frysning och upptining proverna i ett ultraljudsbad istid medförde högre protein avkastning i utvinning bufferten. Men samtidigt, koncentrationen av klorofyll en i utvinning bufferten ökat (figur 1 infälld), som uteslöt en ordentlig phycobiliprotein innehåll kvantifiering.
Den optimala homogenisering tid var 15 s. homogenisering för både kortare (5 s) och längre (20 s) perioder som något lägre phycobiliprotein avkastning, som visas i figur 2. Homogenisering cellerna med glaspärlor med en diameter av 2 mm resulterade i den högsta möjliga avkastningen jämfört med glaspärlor med en diameter av 0,5 mm, 1 mm eller 4 mm, zirkonia pärlor av en 0,5-mm diameter, eller med sea sand korn. PBS utvinning bufferten testades som det optimala buffert för phycobiliproteins utvinning (figur 3). Tillägg av 100 mM NaCl eller 150 mM KCl att PBS-bufferten eller vatten ökade inte phycobiliprotein utvinning effektivitet, och samma gick för att använda 20 mM natrium acetatbuffert för extraktion (figur 3). Den optimala phycobiliprotein utvinning tid var 60 minuter eftersom, efter mer tid (upp till 240 minuter), koncentrationen av phycobiliprotein i utvinning bufferten inte förändrades betydligt (figur 4).
Vi har också testat spektrofotometer linjäritet intervallet för phycobiliprotein mätning (figur 5) och jämfört flera ekvationer av phycobiliprotein kvantifieringen, använder både phycocyanin och allophycocyanin standard (figur 6). Den spektrofotometer som används i detta protokoll visade en linjär absorbansen spektrum mellan 0,1 - 3,0 (figur 5). Eftersom spektra av proteinet extrahera hade dess maximal absorption ca 620 nm (en620), och vid 652 nm, absorptionen (en652) var endast 33% av en620 (figur 7), telmisartans spektrofotometer för en652 (maximalt allophycocyanin absorbans) testades endast upp till en652 på 1,16. Ekvationerna (1) och (2) av Bennett och Bogorad12 om bästa återuppbyggnaden av både phycocyanin och allophycocyanin normer bland alla testade ekvationer (figur 6). Streptomycin sulfate, används i flera tidigare studier för eliminering av membran fragment som innehåller klorofyll en, visades inte nödvändigt för utvinning (figur 7).
För representativa experimentet, Synechocystis odlades i en photobioreactor25 i en turbidostat regim, där cellerna var kvar i exponentiell fas inom ett definierat område av optisk densitet (mätt vid 680 nm, OD 680) en kontrollerad spädning av en färsk odling medium (BG11 medium buffras med 17 mM HEPES)11,26. Kulturerna odlades vid 32 ° C och den ingående luften innehöll 0,5% CO2. Kulturerna var upplyst med ett rött ljus (λmax: 633 nm, λ1/2: 20 nm) av en intensitet av 25-1100 µmol (fotoner) / (m2·s), tillsammans med ett blått ljus (λmax: 445 nm, λ1/2: 20 nm) av en intensitet av 25 µmol ( fotoner) / (m2·s). Den optiska densiteten av kultur suspensionen mättes genom photobioreactor basen, och utbud av OD680 sattes till 0,52 - 0,58 (2 x 107 till 4 x 107 celler/mL). Kulturerna odlades under varje specifik ljusintensitet i minst 24 timmar för att ge tillräckligt med tid för acklimatisering. Efter att nå tillväxt stabilitet, var kulturerna provtas för torrvikt (enligt steg 2.1-2.8 i detta protokoll), celltal och phycocyanin och allophycocyanin innehåll. Resultaten av den phycobiliprotein utvärderingen under ökande ljus intensitet visas i figur 8. Synechocystis minskade halten phycobiliprotein från 12% av cellulära torrvikt (505 fg/cell) under den lägsta irradiansen till 3% av cellulära torrvikt (280 fg/cell) under den högsta irradiansen.
Figur 1 : Jämförelse av den metod som beskrivs i detta protokoll med flera referensmetoder utvinning effektivitet. Koncentrationen av phycocyanin (svarta staplar) och allophycocyanin (vita staplar) i råprotein extraktet mättes efter extraktion i PBS-bufferten för 60 min. metod A beskrivs i detta protokoll. Metod B ändrades enligt följande: efter skörd, cellerna var centrifugeras (15 000 x g på laboratoriet temperatur under 5 minuter) och lagras vid-20 ° C över natten. De frysta proverna var sonicated för 120 s vid 4 ° C, och phycobiliproteins utvanns i PBS-bufferten för 60 min. metod C ändrades från metod B genom att lagra pellets av skördade celler vid-80 ° C i 30 min, frystorkning cellulära pellets , och lägga till PBS-bufferten till torra pellets. Metod D ändrades från Chung et al. 16: efter frystorkning (samma som metod C), 0,25 mL Na-acetat med 1% streptomycin sulfat buffert (pH 5,5) lades till den torra cellulära pelleten, tillsammans med 0,25 mL av zirkonium pärlor (med en diameter på 0,5 mm), och proverna var homogeniserad två gånger för 60 s på homogenisatorn. Efter homogenisering, ytterligare 0,5 mL Na-acetat med 1% streptomycin sulfat buffert (pH 5,5) lades till provet, rören var vortexed och proteinerna utvanns på is för 30 min. metod E bestod av en enda frysning-upptining cykel i PBS-bufferten och protein utvinning under 24 timmar vid 4 ° C. Metod F (infälld bild) bestod av en och sex cykler av frysning celler (initialt, frystorkat och resuspended i PBS-bufferten) i flytande kväve, följt av ultraljudsbehandling på is. På grund av betydande klorofyll en närvaro i råprotein extraktet kvantifierades phycobiliproteins inte inom metod F. De avbildade värdena representerar medelvärden från tre tekniska replikat, med felstaplar representera standardavvikelser. Pigment koncentrationer beräknades enligt ekvationerna (1) och (2) i detta protokoll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Effekt av homogenisering tiden på phycobiliprotein utvinning effektivitet. Frystorkade pelletar av Synechocystis celler (enligt steg 3.1-3.5 i detta protokoll) stördes med glaspärlor på Homogenisatorer för 5 s, 15 s, och 20 s. De avbildade värdena representerar medelvärden från tre tekniska replikat, med felstaplar representera standardavvikelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Phycobiliprotein utvinning effektivitet i olika utvinning buffertar. Phycobiliproteins utvanns i PBS-bufferten, i PBS-bufferten med ett tillägg av 100 mM NaCl eller 150 mM KCl, avjoniserat vatten med 100 mM NaCl eller 150 mM KCl, enligt Hemlata och Katarina22, och i 20 mM natriumacetat enligt Chung et al < / C4 >. 16. extraktionen utfördes vid 4 ° C enligt steg 4.1-4.3 i detta protokoll. De avbildade värdena representerar medelvärden från tre tekniska replikat, med felstaplar representera standardavvikelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Phycobiliprotein stabilitet i utvinning bufferten i tid. Efter det extraktionsförfarande, utförs enligt beskrivningen i steg 4.1-4.3 i detta protokoll, var phycobiliprotein extraktet i PBS-bufferten (pH 7,4) lagras vid 4 ° C upp till 4 timmar, utan betydande phycocyanin (cirklar) och allophycocyanin (rutor) nedbrytning. Den streckade linjen representerar den linjära passformen tidpunkter beräknas med minsta kvadratmetoden. De avbildade värdena representerar medelvärden från tre tekniska replikat, med felstaplar representera standardavvikelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Representativa mätningar av phycocyanin och allophycocyanin koncentrationer i Synechocystis. En tät kultur-suspension (phycocyanin: 456 µg/mL, allophycocyanin: 106 µg/mL) försvagades gradvis upp till en koncentration av 19 µg/mL för både phycocyanin och allophycocyanin. De avbildade värdena representerar medelvärden från tre tekniska replikat, med felstaplar representera standardavvikelser. Den streckade linjen representerar den linjära passformen av koncentration pekar beräknas med minsta kvadratmetoden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Uppskattning av phycocyanin och allophycocyanin koncentrationer pigment standarder. Innehållet av phycocyanin och allophycocyanin i pigment standarder mäts spektrofotometriskt enligt ekvationerna Bennett och Bogorad12, Lüder et al. 13, Böös-Wiley och Neefus15, Evans14och Chung et al. 16. proteininnehållet i standarder (beroende på vad som är nödvändigt för phycobiliproteins bestämning) kvantifierades med en lösning av bicinchoninic syra, natriumkarbonat, natrium tartrat och natriumbikarbonat i 0,1 N NaOH (med ett slutligt pH på 11,25), i reaktion med 4% (w/v) copper(II) sulfat pentahydrat27, med bovint serum albumin som ett protein som är standard. Ekvationer av Bennett och Bogorad förutsatt högsta återuppbyggnaden av både pigment: 96% av phycocyanin standard och 99% av allophycocyanin standard. De avbildade värdena representerar medelvärden från tre tekniska replikat, med felstaplar representera standardavvikelser. Den streckade linjen visar den 100%-punkten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : Effekten av streptomycin sulfat på absorptionsspektrum av proteinet rå extrakt i PBS-bufferten. (A), utvinning förfarande som beskrivs i steg 4.1-4.3 i detta protokoll eller (B) med ultraljudsbehandling som beskrivs i legenden om figur 1 för metod F utfördes i PBS-bufferten (cirklar) och PBS-bufferten kompletteras med 1% streptomycin sulfat (rutor). Phycobiliprotein kvantifiering utfördes enligt steg 5.1-5.4 i detta protokoll. De avbildade värdena representerar medelvärden från tre tekniska replikat, med felstaplar representera standardavvikelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8 : Koncentration av phycocyanin (cirklar) och allophycocyanin (rutor) i Synechocystis odlas i röd-orange ljus av en intensitet av 25-1100 µmol(photons)/(m2·s). Synechocystis kulturer odlades i en photobioreactor på 32 ° C, med 0,5% CO2 i ingående luften, i BG11 odling medium kompletteras med 17 mM HEPES i en turbidostat regim enligt Zavrel et al. 11. phycobiliprotein koncentrationerna mättes enligt detta protokoll och de slutliga phycobiliprotein innehållet var normaliserade per cellulära torrvikt, som beskrivs i avsnitt 2 i detta protokoll. De streckade linjerna representerar makt passformen av de uppmätta punkter, beräknas med minsta kvadratmetoden. De avbildade värdena representerar medelvärden från tre tekniska replikat, med felstaplar representera standardavvikelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det här protokollet beskriver en enkel, snabb och reproducerbar metod för kvantifiering av phycobiliprotein innehåll i den modell Cyanobakterien Synechocystis. Flera metoder av cell homogenisering, protein utvinning och phycocyanin och allophycocyanin kvantifiering jämförs och slutprotokollet representerar en kombination av de optimala steg för varje enhetligt förfarande. Som representativa data kvantifierades innehållet i phycobiliproteins i Synechocystis celler under ökande ljusintensiteten. Även om analysen kräver liknande tid och laboratorieutrustning som några av de tidigare publicerade metoder12,13,14,15,16, är fördelen med detta protokoll att inga klorofyll en släpps ut i utvinning bufferten och därmed phycobiliprotein mätningen kan uppskattas med hög precision.
Cellsuspension krävs för phycobiliprotein analys kan variera med kultur densiteten. Provvolymen 1 ml är optimerad för kulturer med en OD730 1,5, en cell densiteten på cirka 2 x 107 celler/mL eller kulturer med ett phycobiliprotein innehåll av cirka 20 mg/L. När det gäller utspädda kulturer, skörda en större kultur-volym. Däremot, när det gäller tät kulturer, skörda en lägre kultur volym-i hög densitet kulturer, finns en risk att phycobiliproteins delvis kvar i cellerna efter extraktionen. Likaså mängden cellsuspension krävs för torrvikt bestämning kan variera med kultur densiteten. Provtagning volymen 15 ml är optimerad för kulturerna med en OD730 1,5 eller med en cell densiteten på cirka 2 x 107 celler/mL. Med lägre densitet kulturer eller med lägre volymer, kan Mätfelet öka. Tvärtom ger större kulturvolymer eller tätare kulturer bättre metod resolutioner.
Kritiska steg i protokollet är den cell homogenisering och phycobiliprotein utvinning som bör ger både hög avkastning och hög specificitet. Den högsta avkastningen och renhet av extrakten med samtidiga maximala protein bevarande uppnåddes genom frystorkning proverna, homogenisering torr cellulära pellets av glaspärlor och utföra phycobiliprotein utvinning i PBS-bufferten ( Figur 1). Eftersom även en liten förorening av råprotein extraktet av klorofyll en kan leda till en phycobiliprotein innehåll överskattning, är det nödvändigt att undvika eventuella klorofyll en extraktion genom att lägga till PBS-bufferten. Klorofyll en upptäcktes i den råa extraktet när ultraljudsbehandling användes för cell störningar. Som visas i infällt i figur 1, med återkommande ultraljudsbehandling cykler, mängden klorofyll en extraktet ökade. Däremot, mängden extraherade proteiner (som identifieras av absorbansen vid 280 nm) ökade också efter upprepande ultraljudsbehandling cykler. Därför, användningen av ultraljudsbehandling (i kombination med frysning-upptining cykler i flytande kväve) visas som en lämplig metod för totalt protein utvinning (både fria och membran-bundna proteiner frigörs från celler); Det rekommenderas dock inte i syfte att phycobiliprotein spektrofotometrisk kvantifiering. Chung et al. rekommenderas användning av 1% streptomycin sulfate för att eliminera membran fragment med klorofyll en16. Här, verkade användning av streptomycin sulfat inte vara nödvändigt eftersom det inte ledde till en minskning av klorofyll en protein extraktet (figur 7). Även om en enda ultraljudsbehandling cykel för 120 s inte störa cellerna effektivt (metoderna B och C, figur 1), andra metoder (t.ex., metod F som presenteras i figur 1 eller de metoder som presenteras i figur 7B) bekräftade tidigare fynd av ultraljudsbehandling är en effektiv cell störningar metod22,28. Däremot, förutsatt enkel frysning-upptining cykler, även tidigare redovisats som en effektiv metod för phycobiliproteins utvinning22,28, den lägsta avkastningen i de provningar som beskrivs här (metod E, figur 1 ). Cell homogenisering (inom utvinning bufferten, 2 x 60 s) av zirkonium testades pärlor som mindre effektiva än 15-s homogenisering av den frystorkade cellulära pelleten (metod D, figur 1). Homogenisering förfarandet inom utvinning bufferten beskrevs tidigare med en längre homogenisering tid (10 min)29. Vi har inte testa homogenisering längre än 2 min sen proverna värms upp betydligt under varje homogenisering cykel. I litteraturen var också andra cell störningar metoder beskrivna, inklusive utnyttjande av en fransk press16 eller griding13,15,30; sådana metoder prövades dock inte i denna studie.
Protein utvinning utfördes för 15 s (figur 2) i PBS-bufferten. Buffert pH var 7,4, som rapporterades tidigare som optimalt för phycobiliprotein utvinning22. Tillsats av NaCl eller KCl förbättrade inte phycobiliprotein utvinning effektivitet (figur 3), som motsäger tidigare observationer22. Men som anges i figur 3, fosfatbuffrad saltlösning som används i detta protokoll innehöll 154 mM NaCl (utöver 5,6 mM Na2HPO4 och 1 mM KH2PO4), som inte tillät oss att upprätta den NaCl-fri PBS utvinning buffert som kontroll. Vi jämförde också PBS-bufferten och natrium acetat buffert16 utvinning effektivitet. Kombinationen av natriumfosfat och kaliumfosfat inom PBS-bufferten som högre phycobiliproteins ger (figur 3). Detta konstaterande korresponderade med de tidigare resultaten av Hemlata et al. 22.
Phycobiliprotein utvinning tiden var optimerad för 1 h. längre utvinning inte ledde till betydande phycobiliprotein nedbrytning eller utvinning förbättring (figur 4), vilket motsvarade med tidigare arbete av Lawrenz et al. 28. en utvinning tid kortare än 1 h inte testades. Likaså testades inte extraktion för mer än 4 h eftersom det konstaterades tidigare att de extraherade phycobiliproteins i fosfatbuffert är stabila i minst 48 h28.
Vi jämförde flera ekvationer spektrofotometrisk phycocyanin och allophycocyanin rapporteringsgräns som tidigare beskrivits i litteraturen, genom omräkning innehållet i båda phycobiliproteins i de kommersiella standarderna med kända protein koncentrationer (figur 6). Den bästa återuppbyggnaden av både pigment uppnåddes med ekvationerna Bennett och Bogorad12. Detta resultat var inte specifika för fosfatet utvinning buffert eftersom sådan buffert har använts tidigare12,13,15. Det var varken specifika pigment standarder sedan skillnaden mellan en615, en618och en620 (våglängder används för phycocyanin uppskattning i tidigare verk) i phycocyanin som standard var 1% och skillnaden mellan en 650 och en652 (våglängder som tidigare använts för allophycocyanin uppskattning12,13,14,16) i allophycocyanin standarden var 3%. På liknande sätt, skillnaden mellan en615 och en620 i protein extrakt av Synechocystis var endast 2%. Sådana små skillnader i Absorberingsspectra kan inte resultera i en slutlig pigment variant av upp till 36% (figur 6). Skillnaderna mellan de individuella ekvationerna var därför ganska anslutna till variationer i phycobiliprotein utplåningkoefficienter av specifika organismer12,13,14, 15 , 16 , 17. intressant, ekvationer Chung et al. som lägsta phycocyanin återuppbyggnad (diagram 6) även om författarna använde också Synechocystis för deras experiment16.
I stället för bestämning av enda våglängder, det rekommenderas att mäta ett kontinuerligt spektrum av phycobiliprotein extraktet mellan 280-720 nm, att uppskatta förekomsten av klorofyll en extraktet, som kan störa både den allophycocyanin och absorption av phycocyanin. Dessutom genom att mäta absorbansen vid 280 nm (en280), en renhet av både phycocyanin (en615/a280 eller en620/a280)21,22 och allophycocyanin (en652/a280) 24 inom extraktet kan uppskattas (0,7: livsmedelskvalitet, 3.9: reaktiva grade, > 4.0: analyskvalitet)21.
Som representativa data bestämdes koncentrationen av både phycocyanin och allophycocyanin i Synechocystis under ökande ljusintensiteten. Att upprätthålla kultur tätheten på en konstant nivå inom en turbidostat odling regimen11var,21 viktigt för det direkta jämförande experimentet. Phycocyanin och allophycocyanin koncentrationerna av 2,4% - 10,2% och 0,6% - 1,7% av cellulära torrvikt, respektive, var liknande som den tidigare rapporterade värden11,31,32. Phycobiliprotein innehåll per cell grunden var också lika som tidigare rapporterats11,33. Med den ökande ljuset minskade phycobiliproteins innehållet. Intressant, även under högsta ljusintensiteten för 1100 µmol (fotoner) / (m2·s), phycobiliproteins var inte helt blekt.
Eftersom protokollet kräver endast standardutrustning och är relativt snabb, kan det lätt antas på alla laboratorier där phycobiliproteins analyseras rutinmässigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Protokollet antogs från en tidigare publikation11. T. Z., D. Ch. och J. Č. stöddes av ministeriet för utbildning, ungdom och sport i Tjeckien inom nationella hållbarhetsprogrammet jag (NPU jag), bevilja nummer LO1415. J. Č. stöddes också av GA CR, licensnummer 18-24397S. Tillgång till instrument och andra faciliteter stöddes av den tjeckiska forskningsinfrastrukturen för systembiologi C4SYS (projekt nr LM2015055). M. A. S. stöddes av ett bidrag från ryska Science Foundation [nr 14-14-00904].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | Institut Pasteur, Paris, France | 6803 | Cyanobacterium strain |
| Roti-CELL PBS | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 9143.1 | Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4 |
| Eppendorf safe-lock tubes | Eppendorf, Hamburk, Germany | 30120086 | Safe-lock tubes 1.5 ml |
| VWR 80-Place Storage System | VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA | 30128-282 | Holder for safe-lock tubes |
| RAININ 100 µl -1000 µl | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 17014382 | Pipette |
| GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8 | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 30389272 | Pipette tips |
| Rotina 420R | Hettich, Kirchlengern, Germany | 4701 | Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes |
| LCexv 4010 | Liebherr, Bulle, Switzerland | 9005382197172 | Refrigerator and freezer -20 °C |
| Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | EXF24086V | Freezer -80 °C |
| CoolSafe | LaboGene, Lillerød, Denmark | 7.001.000.615 | Freeze dryer |
| UV-2600 | Shimadzu, Kyoto, Japan | UV-2600 | Spectrophotometer |
| Hellma absorption cuvettes, semi Micro | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z600288 | VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm |
| Silamat S6 | Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein | 602286WU | Homogenizer |
| Solid-glass beads | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z273627 | Glass bead of the diameter 2 mm |
| CPA225D-0CE | Sartorius AG, Göttingen, Germany | SECURA225D-1OBR | Analytical balances |
| C-Phycocyanin from Spirulina sp. | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P2172 | Phycocyanin standard |
| Allophycocyanin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | A7472 | Allophycocyanin standard |
| Bicinchoninic Acid Kit | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | BCA1, B9643 | Complete kit for total proteins determination |
| AlgaeTron | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | AG 130-ECO | Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere |
| Photobioreactor | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | FMT-150 | Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment |
| Cellometer | Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA | Auto M10 | Cell counter |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS430791 | 15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling |
| Herasafe KS | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 51024579 | Laminar flow hood |
References
- Mimuro, M., Kikuchi, H. Antenna Systems and Energy Transfer in Cyanophyta and Rhodophyta. Light-Harvesting Antennas in Photosynthesis. Green, B. R., Parson, W. W. , Springer. Dordrecht, The Netherlands. 281-306 (2003).
- Spear-bernstein, L., Miller, K. R. Unique location of the phycobiliprotein light-harvesting pigment in the Cryptophyceae. Journal of Phycology. 25 (3), 412-419 (1989).
- Kirst, H., Formighieri, C., Melis, A. Maximizing photosynthetic efficiency and culture productivity in cyanobacteria upon minimizing the phycobilisome light-harvesting antenna size. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1837 (10), 1653-1664 (2014).
- Page, L. E., Liberton, M., Pakrasi, H. B. Reduction of photoautotrophic productivity in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 by phycobilisome antenna truncation. Applied and Environmental Microbiology. 78 (17), 6349-6351 (2012).
- Sonani, R. R. Recent advances in production, purification and applications of phycobiliproteins. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 100 (2016).
- Bryant, D. A. The Molecular Biology of Cyanobacteria. , Springer Netherlands. Dordrecht, The Netherlands. (1994).
- Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. I. Sequence features in the 1 Mb region from map positions 64% to 92% of the genome. DNA Research. 2, 191-198 (1995).
- Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. II. Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein-coding regions. DNA Research. 3, 109-136 (1996).
- Grigorieva, G., Shestakov, S. Transformation in the cyanobacterium Synechocystis sp 6803. FEMS Microbiology Letters. 13 (4), 367-370 (1982).
- Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp: PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), (2015).
- Zavřel, T., Očenášová, P., Červený, J. Phenotypic characterization of Synechocystis sp. PCC 6803 substrains reveals differences in sensitivity to abiotic stress. PLoS One. 12 (12), e0189130 (2017).
- Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaption in a filamentous blue-green alga. The Journal of Cell Biology. 58, 419-435 (1973).
- Lüder, U. H., Knoetzel, J., Wiencke, C. Acclimation of photosynthesis and pigments to seasonally changing light conditions in the endemic antarctic red macroalga Palmaria decipiens. Polar Biology. 24 (8), 598-603 (2001).
- Evans, L. V. The effects of spectral composition and irradiance level on pigment levels in seaweeds. Experimental Phycology: A Laboratory Manual. Lobban, C. S., Chapman, D. J., Kremer, B. P. , Cambridge University Press. Cambridge, New York, New Rochelle, Melbourne, Sydney. 123-133 (1988).
- Sampath-Wiley, P., Neefus, C. D. An improved method for estimating R-phycoerythrin and R-phycocyanin contents from crude aqueous extracts of Porphyra (Bangiales, Rhodophyta). Journal of Applied Phycology. 19 (2), 123-129 (2007).
- Chung, Y. H., Park, Y. M., Moon, Y. J., Lee, E. M., Choi, J. S. Photokinesis of Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Photoscience. 11 (3), 89-94 (2004).
- Sun, L., et al. Phycobilisomes from Cyanobacteria. Handbook on Cyanobacteria: Biochemistry, Biotechnology and Applications. Gault, P. M., Marler, H. J. , Nova Science Publishers, Inc. New York, NY. 105-160 (2009).
- Six, C., et al. Diversity and evolution of phycobilisomes in marine Synechococcus spp.: A comparative genomics study. Genome Biology. 8 (12), (2007).
- Sinetova, M. A., Červený, J., Zavřel, T., Nedbal, L. On the dynamics and constraints of batch culture growth of the cyanobacterium Cyanothece sp. ATCC 51142. Journal of Biotechnology. 162 (1), (2012).
- Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, M., Cohen-Bazire, G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacteriological Reviews. 35 (2), 171-205 (1971).
- Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), 122-132 (2015).
- Hemlata, G., Fareha, B. Studies on Anabaena sp. nccu-9 with special reference to phycocyanin. Journal of Algal Biomass Utilization. 2 (1), 30-51 (2011).
- Rito-Palomares, M., Nuez, L., Amador, D. Practical application of aqueous two-phase systems for the development of a prototype process for c-phycocyanin recovery from Spirulina maxima. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 76 (12), 1273-1280 (2001).
- Zhang, H., et al. Selenium-Containing Allophycocyanin Purified from Selenium-Enriched Spirulina platensis Attenuates AAPH-Induced Oxidative Stress in Human Erythrocytes through Inhibition of ROS Generation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (16), 8683-8690 (2011).
- Nedbal, L., Trtílek, M., Cervený, J., Komárek, O., Pakrasi, H. B. A photobioreactor system for precision cultivation of photoautotrophic microorganisms and for high-content analysis of suspension dynamics. Biotechnology and Bioengineering. 100 (5), 902-910 (2008).
- Zavřel, T., Knoop, H., Steuer, R., Jones, P. R., Červený, J., Trtílek, M. A quantitative evaluation of ethylene production in the recombinant cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 harboring the ethylene-forming enzyme by membrane inlet mass spectrometry. Bioresource Technology. 202, 142-151 (2016).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Lawrenz, E., Fedewa, E. J., Richardson, T. L. Extraction protocols for the quantification of phycobilins in aqueous phytoplankton extracts. Journal of Applied Phycology. 23 (5), 865-871 (2011).
- Lea-Smith, D. J., et al. Phycobilisome-Deficient Strains of Synechocystis sp. PCC 6803 Have Reduced Size and Require Carbon-Limiting Conditions to Exhibit Enhanced Productivity. Plant Physiology. 165 (2), 705-714 (2014).
- Seo, Y. C., et al. Stable isolation of phycocyanin from Spirulina platensis associated with high-pressure extraction process. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1778-1787 (2013).
- Touloupakis, E., Cicchi, B., Torzillo, G. A bioenergetic assessment of photosynthetic growth of Synechocystis sp. PCC 6803 in continuous cultures. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 133 (2015).
- Touloupakis, E., Cicchi, B., Benavides, A. M. S., Torzillo, G. Effect of high pH on growth of Synechocystis sp. PCC 6803 cultures and their contamination by golden algae (Poterioochromonas sp.). Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1333-1341 (2016).
- Ishii, A., Hihara, Y. An AbrB-Like Transcriptional Regulator, Sll0822, Is Essential for the Activation of Nitrogen-Regulated Genes in Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Physiology. 148 (1), 660-670 (2008).
