Vi præsenterer her, en protokol til at bestemme kvantitativt phycobiliprotein indhold i cyanobacterium Synechocystis ved hjælp af en Spektrofotometrisk metode. Ekstraktionsmetode blev også anvendt til andre cyanobakterier og alger stammer; på grund af variationer i pigment absorptionsspektre, er det imidlertid nødvendigt at teste de spektrofotometriske ligninger for hver stamme individuelt.
Dette er en simpel protokol til kvantitativ bestemmelse af phycobiliprotein indhold i model cyanobacterium Synechocystis. Fykobiliproteiner er de vigtigste komponenter i phycobilisomes, de store lys-høst antenner i cyanobakterier og flere alger taxa. Phycobilisomes af Synechocystis indeholder to fykobiliproteiner: phycocyanin og allophycocyanin. Denne protokol beskriver en enkel, effektiv og pålidelig metode til kvantitativ bestemmelse af både phycocyanin og allophycocyanin i denne model cyanobacterium. Vi sammenlignede flere metoder til phycobiliprotein ekstraktion og spektrofotometrisk kvantificering. Ekstraktionsmetode som beskrevet i denne protokol blev også anvendt til andre cyanobakterier stammer som Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., og stenflader sp., samt om rødalger Porphyridium cruentum. Men udryddelse koefficienter af specifikke fykobiliproteiner fra forskellige taxa kan variere og det anbefales derfor, at validere metoden spektrofotometriske kvantificering for hver enkelt stamme individuelt. Protokollen kræver lidt tid og kan udføres i alle standard life science laboratorier, da det kræver kun standard udstyr.
fPhycobiliproteins er vandopløselige pigment-protein komplekser, der udgør væsentlige bestanddele af de lys-høst antenner i prokaryote cyanobakterier (Cyanophyta) og flere eukaryote taxa (Glaucophyta, Rhodophyta , og Cryptophyta)1. De opstår hovedsagelig som Supramolekylær komplekser kaldes phycobilisomes og de er typisk knyttet til overfladen af de fotosyntetiske membraner i stromale side, med undtagelse af Cryptophyta, hvor fykobiliproteiner er lokaliseret i den tylakoid lumen2. Fire typer af fykobiliproteiner er blevet identificeret op til dato: core allophycocyanin og den perifere phycocyanin, phycoerythrin og phycoerythrocyanin1. Som de vigtigste lys-høst komplekser repræsenterer phycobilisomes en af de afgørende faktorer for alger og cyanobakterier masse kulturer produktivitet. Det er blevet påvist, at phycobilisomes afkortning kan forbedre biomasse akkumulering under stærkt lys3. På den anden side under beskedne eller lav irradians resulterede antenne trunkering i vækst og biomasse ophobning reduktion3,4. Fykobiliproteiner bruges kommercielt som mad farvestoffer, lægemidler og tilsætningsstoffer i den kosmetiske industri, samt fluorescens sonder med programmer i flowcytometri, fluorescerende immunassays og Fluorescens mikroskopi5.
Denne protokol fokuserer på den kvantitative bestemmelse af fykobiliproteiner i model cyanobacterium Synechocystis. Cyanobakterier er de tidligste iltdannende fotosyntetiske autotrofer; de har danner Jordens biosfære for mere end 2,4 milliarder år6. De spiller en afgørende rolle i globale biogeokemiske kredsløb af kvælstof, kulstof, ilt og andre elementer. Blandt cyanobakterier, en encellet stamme Synechocystis fik en unik position, da det var den første cyanobacterium med det hele genom sekventeret7,8, det er naturligvis udklappelige af eksogene DNA9, og det udfører stabilt og relativt hurtig vækst10,11. I Synechocystis, antenne kernekomponenter, allophycocyanin, er forbundet med integreret Membranproteiner, og de vedlagte phycocyanin ligger på tylakoid membran periferien.
Flere metoder til phycobiliprotein udvinding og kvantificering er sammenlignet i denne protokol. Den endelige ekstraktionsmetode blev anvendt til Synechocystissamt til andre stammer, cyanobakterier, herunder Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira SP., og stenflader sp., og det var også med held anvendes til rødalger Porphyridium cruentum. Metoden udviklet i denne protokol kan derfor betragtes som en universel metode til phycobiliprotein udvinding. Selv om nogle af de testede udvindingsmetoder resulterede i højere total protein udbytter, her beskrevne ekstraktionsmetode forudsat det højeste phycobiliprotein giver sammen med det laveste indhold af klorofyl en rest i den phycobiliprotein ekstrakt. At reducere indholdet af klorofyl en var afgørende for den korrekte phycocyanin og allophycocyanin spektrofotometriske kvantificering.
Absorptionsspektra phycobiliprotein kan variere betydeligt mellem forskellige alger og cyanobakterier arter12,13,14,15,16,17 og endda blandt flere stammer af en enkelt cyanobakterier slægten18. Derfor er bestemte bølgelængder og absorption koefficienter som anvendes til bestemmelse af phycocyanin og allophycocyanin i Synechocystis ikke generelt gælder for andre stammer. Derudover indeholder Synechocystis ikke phycoerythrin og phycoerythrocyanin, der findes i nogle andre alger og cyanobakterier. Med henblik på bestemmelse af fykobiliproteiner i stammer end Synechocystisanbefales det at evaluere de spektrofotometriske ligninger for hver stamme individuelt.
Selv om protokollen indeholder to længere skridt (natten frysetørring af cellulære pellets og 1 times protein udvinding), er den samlede arbejdsmængde tid til fykobiliproteiner kvantificering ikke længere end 2 timer.
Denne protokol beskriver en enkel, hurtig og reproducerbar metode til kvantificering af phycobiliprotein indhold i model cyanobacterium Synechocystis. Flere metoder til celle homogenisering, protein udvinding og phycocyanin og allophycocyanin kvantificering sammenlignes, og den endelige protokol repræsenterer en kombination af de optimale skridt af hver enkelt procedure. Som repræsentative data, var indholdet af fykobiliproteiner kvantificeret i Synechocystis celler under stigende lysintensitet. Selvo…
The authors have nothing to disclose.
Protokollen blev vedtaget fra en tidligere publikation11. T. Z., D. Ch. og J. C. blev støttet af Ministeriet for uddannelse, Ungdom og sport i Tjekkiet inden for den nationale bæredygtighed Program jeg (NPU jeg), give nummer LO1415. J. C. blev også støttet af GA CR, tilskud antallet 18-24397S. Adgang til instrumenter og andre faciliteter blev støttet af den tjekkiske forskningsinfrastruktur for Systembiologi C4SYS (projekt ingen LM2015055). M. A. S. blev støttet af en bevilling fra den russiske Science Foundation [nr. 14-14-00904].
Synechocystis sp. PCC 6803 | Institut Pasteur, Paris, France | 6803 | Cyanobacterium strain |
Roti-CELL PBS | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 9143.1 | Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4 |
Eppendorf safe-lock tubes | Eppendorf, Hamburk, Germany | 30120086 | Safe-lock tubes 1.5 ml |
VWR 80-Place Storage System | VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA | 30128-282 | Holder for safe-lock tubes |
RAININ 100 µl -1000 µl | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 17014382 | Pipette |
GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8 | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 30389272 | Pipette tips |
Rotina 420R | Hettich, Kirchlengern, Germany | 4701 | Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes |
LCexv 4010 | Liebherr, Bulle, Switzerland | 9005382197172 | Refrigerator and freezer -20 °C |
Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | EXF24086V | Freezer -80 °C |
CoolSafe | LaboGene, Lillerød, Denmark | 7.001.000.615 | Freeze dryer |
UV-2600 | Shimadzu, Kyoto, Japan | UV-2600 | Spectrophotometer |
Hellma absorption cuvettes, semi Micro | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z600288 | VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm |
Silamat S6 | Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein | 602286WU | Homogenizer |
Solid-glass beads | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z273627 | Glass bead of the diameter 2 mm |
CPA225D-0CE | Sartorius AG, Göttingen, Germany | SECURA225D-1OBR | Analytical balances |
C-Phycocyanin from Spirulina sp. | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P2172 | Phycocyanin standard |
Allophycocyanin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | A7472 | Allophycocyanin standard |
Bicinchoninic Acid Kit | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | BCA1, B9643 | Complete kit for total proteins determination |
AlgaeTron | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | AG 130-ECO | Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere |
Photobioreactor | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | FMT-150 | Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment |
Cellometer | Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA | Auto M10 | Cell counter |
Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS430791 | 15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling |
Herasafe KS | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 51024579 | Laminar flow hood |