Summary

動的プロテオミクスおよび miRNA 蛍光灌流後分離されたマウス心臓ポリソームの分析

Published: August 29, 2018
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Summary

ポリソーム分離灌流マウスの心臓でプロファイリングを実行するためのプロトコルをご紹介します。心の灌流、プロファイリング、ポリソーム Mrna、Mirna、・ ポリソーム プロテオーム解析に関してポリソーム分数の解析法について述べる。

Abstract

タンパク質翻訳のダイナミックな変化の研究では、特殊なメソッドを必要とします。ここで虚血と再灌流ポリソームのプロファイリングと相まって分離灌流マウスの心臓を使用する新規合成される蛋白質の変化を調べた。タンパク質翻訳のダイナミックな変化をさらに理解する私たちは (ポリゾームまたはポリソーム) ゾル性細胞質のリボソームで読み込まれたともミトコンドリア ポリソームを回復し、mRNA とタンパク質の分布を比較して Mrna を特徴と、高効率分数 (多数リボソームが mRNA に付着)、低効率 (少ないリボソームが付着) ミトコンドリア ポリソームと非翻訳分画も含まれています。Mirna が翻訳されているが, 翻訳の効率を減らす Mrna に関連付けることも、分数の miRNAs の分布を調べた。グローバル ・虚血、再灌流の 30 分後と 30 分の終わりに、基底の灌流条件下で Mrna、Mirna、および蛋白質の分布を調べた。この分析を達成するために使用されるメソッドの紹介-特に、これとしてショ糖密度勾配からの蛋白質の抽出の最適化へのアプローチはないの前に記載されている-いくつかの代表的な結果を提供して。

Introduction

中心部は、(I) 虚血と再灌流 (R) ダイナミックなファッションでの傷害に応答します。ただし、応答の中にタンパク質合成に急性の変化に少し洞察力があります。これに対処するため行ったリボゾームとポリソーム、細胞質から並進規制要因の再分配を反映したタンパク質豊富に変更を識別するために1をプロファイリング ポリソームの確立方法の利点と新しく合成されたタンパク質 (Nsp) の増加します。私の設定で/R、新しい Mrna2; の転写と一貫性がないタイム フレームでの蛋白合成の増加が発生しますまた、mRNA 発現および蛋白質量の不一致は、報告された3をされています。これらの理由から、タンパク質翻訳を反映して動的プロテオームの変化を分析することを選びました。これを行うには、我々 はポリソーム分数の mRNA を定量化し、ポリソーム分数のタンパク質組成を分析します。最後に、マイクロ Rna (miRs) Mrna の翻訳の可用性を調節するタンパク質翻訳45の効率を妨げることができますので、我々 の分布を調べた miRs ポリソーム画に焦点を当て、私への応答/r.

マウス単離蛍光灌流モデルと持続灌流、30 分虚血流入なしと虚血後再灌流の 30 分, 30 分後の基底条件下で収穫された組織を使用決定しました。心臓組織を可溶化し、ショ糖密度勾配をポリソームを区切ってそれぞれプロテオーム解析と Mrna と PCR、マイクロ アレイ、miRNAs の選択的検出が続きます。このメソッドの組み合わせを表す NSPs、マイクロ Rna、mRNA の同時検出だけでなく、nontranslating の分数の間調節タンパク質、マイクロ Rna、mRNA の再配布を有効にするプロテオームを理解するための強力なアプローチ低効率ポリソームと高効率ポリソーム (図 1参照)。この過程の動的調節への洞察力は、神経: Eif2 など mTOR 因子のリン酸化の詳細な分析によって拡張されます。これらの個々 のステップは、今詳細に説明します。

Protocol

すべての動物の研究は制度のガイドラインに従って実施されますされ、機関動物のケアと使用ヒマラヤスギ シナイ医療センター委員会によって承認されました。 1. 蛍光マウス心臓血流 マウスの心臓虚血と再灌流の蛍光灌流 管理腹腔内ペントバルビ タール ナトリウム 70 mg/kg (8 週齢、オス、C57BL6/j) の大人のマウスに。ピンチをつま先に撤退?…

Representative Results

mRNA の解析mRNA の結果は、各画分 (図 3 a); 特定の mRNA の分布として表現できます。定量化, polyribosomal 翻訳分数を結合および非翻訳分数 (図 3 b)、nontranslating の分数に変換する mRNA の豊かさの割合を提示に比較します。追加情報は、高効率ポリソーム分数低効率ポリソーム分数を個別に (または nontranslating 分数とは別…

Discussion

ポリソーム プロフィール分析と、特定の mRNA の全体のトランスクリプトーム6,7並進状態の分析によりタンパク質翻訳の研究。ローカル翻訳シナプトソーム8など検討する必要がある場合、それは大きな助けとだも。伝統的に、この方法は、モノとポリゾームとショ糖密度勾配をゲノムと結合することができるまたは目的の結果<sup c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NIH P01 HL112730 (布、JVE) NIH R01 HL132075 (ぼろきれ、JVE)、バーブラ ・ ストライサンド女性のハート センター (ぼろきれ、JVE)、ドロシーと e. フィリップ リヨン椅子分子循環器 (布) で、女性の心の健康 (JVE)、チェコ科学アカデミー エリカ グレイザー寄附施設支援 RVO: 68081715 (MS)。

Materials

Pentobarbital Vortech Phamaceuticals 9373 for euthansia
Heparin Sagent 103424 used in langendorff preparation
forceps Fine Science Tools 91110-10 used to hang the heart
Langendorff system Radnoti + home made n/a A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths
NaCl Sigma S7653-5KG Krebs buffer and Sucrose gradient
KCl Sigma P5405 Krebs buffer and Lysis buffer
KH2PO4 Sigma P-5504 Krebs buffer
MgSO4 Sigma M7774-500G Krebs buffer
Glucose Sigma G5767 Krebs buffer
CaCl2 Sigma C1016-500G Krebs buffer
Sucrose powder Sigma S0389-1KG Sucrose gradient
MgCl2 Sigma 208337 Sucrose gradient and Lysis buffer
Tris-base Sigma T1503-1KG Sucrose gradient and Lysis buffer
Xylene Cyanole Sigma X-4126 Sucrose gradient
Cycloheximide Sigma-aldrich 239763 Sucrose gradient and Lysis buffer
RNaseOUT Life Technologies C00019 RNAse inhibitor for Lysis buffer
Igepal CA-360 (NP40) Sigma I3021 Lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free Roche 5056489001
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 x 89 mm Beckman Coulter 344059
Ultracentrifuge Beckman LE-80K Ultracentrifugation of the gradients
Rotor Beckman SW41 Ultracentrifugation of the gradients
Biologic LP (pump) Biorad 731-8300 Fractionation of the gradients
BioFrac Biorad 741-0002 Fractionation of the gradients
Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube Sigma Z666513-100EA Gradient fraction and RNA extraction
TRIzol Reagent Life technologies AM9738 RNA extraction
Luciferase Control RNA Promega L4561 RNA extraction
Chloroform Fisher Scientific C606-4 RNA extraction
Glycogen, RNA grade Thermo Fisher Scientific R0551 RNA extraction
Isopropanol Sigma I9516 RNA extraction
Ethanol Sigma E7023-1L RNA extraction
iScript cDNA Synthesis Kit BioRad 170-8891 Reverse transcription
iTaq Universal SYBR Green Supermix BioRad 175-5122 Quantative PCR
miRNeasy Micro Kit (50) Qiagen 217084 Kit for total RNA isolation
miScript II RT Kit (50) Qiagen 218161 Kit for miRNA reverse transcription
miScript Sybr Green PCR Kit (200) Qiagen 218073 Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs
Centrifuge 5424R Eppendorf For centrifugation of 1.5ml or 2.0ml tubes at different temperatures. Max speed – 21130g
Centrifuge 5810R Eppendorf For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed – 2039g
My Cycler Thermal Cycler Bio-Rad For reverse transcription
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad For real-time PCR analysis
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control Qiagen 219610 For quality control of RNA isolation
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear Bio-Rad HSP9641 For real-time PCR analysis
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical Bio-Rad MSB1001 For real-time PCR plate sealing
Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL Eppendorf UX-24505-02 For pipetting
PIPETMAN Classic Pipets, P20 Gilson F123600G For pipetting
PIPETMAN Classic Pipets, P200 Gilson F144565 For pipetting
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL Gilson 17011782 For pipetting
Glycogen, RNA grade Thermo Fisher Scientific R0551 Improves total RNA isolation efficiency
Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color Denville C2170 RNA isolation and storage; reagent mix
Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically Denville C18098-4 (1000910) Reverse transcription reaction
Sharp 10 Precision barrier Tips Denville P1096-FR For pipetting
Sharp 20 Precision barrier Tips Denville P1121 For pipetting
Sharp 200 Precision barrier Tips Denville P1122 For pipetting
Tips LTS 1 mL Filter Rainin RT-L1000F For pipetting
miScript Primer Assay (200) Qiagen (it changes according to the miRNA) For real-time PCR analysis
Gradient Master ver 5.3 Model 108 BioComp Instruments For preparation of sucrose gradients
trichloroacetic acid Sigma Aldrich T6399
acetone Sigma Aldrich 650501
Tris hydrochloride Amresco M108
dithiothreitol Fisher Scientific BP172
iodoacetamide Gbiosciences RC-150
sequencing grade modified trypsine, porcine Promega V5111
ammonium bicarbonate BDH BDH9206
formic acid, Optima LC/MS Fisher Chemical A117
methanol, Optima LC/MS Fisher Chemical A454
acetonitrile, Optima LC/MS Fisher Chemical A996
Protein LoBind tubes 0.5 mL Eppendorf AG 22431064
Protein LoBind tubes 1.5 mL Eppendorf AG 22431081
HLB µElution plate 30 µm Oasis 186001828BA
SpeedVac concentrator Thermo Scientific Savant SPD2010
sonicator Qsonica Oasis180
centrifuge Thermo Scientific Sorvall Legend micro 21R
LC trap column PepMap 100 C18 Thermo Scientific 160454
LC separation column PepMap RSLC C18 Thermo Scientific 164536
mass spectrometer Thermo Scientific Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer
MSConvert software ProteoWizard Toolkit
Sorcerer-SEQUEST software Sage-N Research, Inc.

References

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Stastna, M., Thomas, A., Germano, J., Pourpirali, S., Van Eyk, J. E., Gottlieb, R. A. Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion. J. Vis. Exp. (138), e58079, doi:10.3791/58079 (2018).

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