यहाँ हम अलग perfused माउस दिल पर polysome रूपरेखा प्रदर्शन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । हम दिल छिड़काव, polysome रूपरेखा के लिए तरीकों का वर्णन है, और mRNAs, miRNAs, और polysome proteome के संबंध में polysome अंशों का विश्लेषण ।
प्रोटीन अनुवाद में गतिशील परिवर्तन में अध्ययन के लिए विशेष तरीकों की आवश्यकता होती है । यहां हम ischemia और reperfusion अलग perfused माउस polysome रूपरेखा के साथ युग्मित दिल का उपयोग कर के जवाब में नव संश्लेषित प्रोटीन में परिवर्तन की जांच की । आगे प्रोटीन अनुवाद में गतिशील परिवर्तन को समझने के लिए, हम mRNAs कि cytosolic ribosomes (polyribosomes या polysomes) के साथ भरी हुई थी और भी mitochondrial polysomes और तुलना में mRNA और प्रोटीन वितरण में बरामद की विशेषता उच्च दक्षता भिंन (mRNA से जुड़ी कई ribosomes), कम दक्षता (कम ribosomes संलग्न) जिसमें mitochondrial polysomes भी शामिल थे, और गैर अनुवाद अंश । miRNAs भी mRNAs के साथ संबद्ध कर सकते है कि अनुवाद किया जा रहा है, जिससे अनुवाद की दक्षता को कम करने, हम भागों भर में miRNAs के वितरण की जांच की । mRNAs, miRNAs के वितरण, और प्रोटीन बेसल perfused शर्तों के तहत जांच की थी, वैश्विक नहीं प्रवाह के ischemia के 30 मिनट के अंत में, और reperfusion के 30 मिनट के बाद । यहां हम इस विश्लेषण को पूरा करने के लिए इस्तेमाल की विधियां प्रस्तुत-विशेष रूप से, सुक्रोज ढाल से प्रोटीन निष्कर्षण के अनुकूलन के लिए दृष्टिकोण, के रूप में यह पहले नहीं बताया गया है-और कुछ प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करते हैं ।
दिल के ischemia (I) और reperfusion (आर) की चोट का जवाब एक गतिशील फैशन में । हालांकि, वहां प्रतिक्रिया के दौरान प्रोटीन संश्लेषण में तीव्र परिवर्तन में थोड़ा अंतर्दृष्टि है । यह पता करने के लिए, हम polysome की अच्छी तरह से स्थापित विधि का लाभ ले लिया1 के लिए प्रोटीन बहुतायत में परिवर्तन की पहचान है कि cytosol से ribosomes और शोधों विनियामक कारकों के पुनर्वितरण को प्रतिबिंबित polysomes, और नव संश्लेषित प्रोटीन (NSPs) में वृद्धि । I/R की सेटिंग में, नए प्रोटीन संश्लेषण में वृद्धि नई mRNAs2की प्रतिलेखन के साथ असंगत है कि एक समय सीमा में होता है; इसके अलावा, mRNA अभिव्यक्ति स्तर और प्रोटीन बहुतायत के बीच कलह3बताया गया है । इन कारणों के लिए, हम के रूप में प्रोटीन अनुवाद द्वारा परिलक्षित गतिशील proteome में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए चुना है । ऐसा करने के लिए, हम polysome भागों में mRNA मात्रा, और polysome भागों में प्रोटीन संरचना का विश्लेषण । अंत में, क्योंकि microRNAs (miRs) अनुवाद के लिए mRNAs की उपलब्धता को विनियमित और प्रोटीन अनुवाद की दक्षता के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं4,5, हम polysome अंशों में miRs के वितरण की जांच की, पर ध्यान केंद्रित मैं प्रतिक्रिया/
हम लगातार छिड़काव की बेसल शर्तों के तहत अलग माउस Langendorff छिड़काव मॉडल और काटा ऊतक का उपयोग करें, 30 मिनट के बाद वैश्विक नहीं प्रवाह ischemia, और ischemia के 30 मिनट के बाद reperfusion के 30 मिनट के बाद चुना । हम तो दिल के ऊतकों solubilized और एक सुक्रोज ढाल पर polysomes अलग, proteomic विश्लेषण और पीसीआर और mRNAs द्वारा miRNAs और microarray के चुनिंदा पता लगाने के बाद क्रमशः । तरीकों का यह संयोजन गतिशील proteome को समझने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है, mRNA, miRNA, और NSPs का एक साथ पता लगाने को सक्षम करने के साथ ही विनियामक प्रोटीन के पुनर्वितरण, miRNA, और mRNA के बीच विअनुवाद अंश, कम दक्षता polysomes, और उच्च दक्षता polysomes ( चित्रा 1देखें) । इस प्रक्रिया के गतिशील विनियमन में अंतर्दृष्टि eIF2α या mTOR जैसे प्रमुख विनियामक कारकों के फास्फारिलीकरण के आगे विश्लेषण द्वारा विस्तारित किया जाएगा । ये व्यक्तिगत कदम अब विस्तार से बताए गए हैं ।
Polysome प्रोफ़ाइल विश्लेषण एक विशिष्ट mRNA या पूरे transcriptome6,7के शोधों की स्थिति का विश्लेषण करके प्रोटीन अनुवाद के अध्ययन के लिए अनुमति देता है । यह बहुत मदद की भी है जब स्थानीय अनुवाद ऐसे synap…
The authors have nothing to disclose.
NIH P01 HL112730 (चीर, JVE), NIH R01 HL132075 (चीर, JVE), Barbra Streisand महिला हार्ट सेंटर (चीर, JVE), डोरोथी और ई. में फिलिप ल्यों कुर्सी आणविक कार्डियोलोजी (चीर), एरिका घुटा हुआ महिला हार्ट हेल्थ में संपंन कुर्सी (JVE) और चेक विज्ञान अकादमी संस्थागत सहायता RVO: ६८०८१७१५ (MS) ।
Pentobarbital | Vortech Phamaceuticals | 9373 | for euthansia |
Heparin | Sagent | 103424 | used in langendorff preparation |
forceps | Fine Science Tools | 91110-10 | used to hang the heart |
Langendorff system | Radnoti + home made | n/a | A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths |
NaCl | Sigma | S7653-5KG | Krebs buffer and Sucrose gradient |
KCl | Sigma | P5405 | Krebs buffer and Lysis buffer |
KH2PO4 | Sigma | P-5504 | Krebs buffer |
MgSO4 | Sigma | M7774-500G | Krebs buffer |
Glucose | Sigma | G5767 | Krebs buffer |
CaCl2 | Sigma | C1016-500G | Krebs buffer |
Sucrose powder | Sigma | S0389-1KG | Sucrose gradient |
MgCl2 | Sigma | 208337 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
Tris-base | Sigma | T1503-1KG | Sucrose gradient and Lysis buffer |
Xylene Cyanole | Sigma | X-4126 | Sucrose gradient |
Cycloheximide | Sigma-aldrich | 239763 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
RNaseOUT | Life Technologies | C00019 | RNAse inhibitor for Lysis buffer |
Igepal CA-360 (NP40) | Sigma | I3021 | Lysis buffer |
Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free | Roche | 5056489001 | |
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
Ultracentrifuge | Beckman | LE-80K | Ultracentrifugation of the gradients |
Rotor | Beckman | SW41 | Ultracentrifugation of the gradients |
Biologic LP (pump) | Biorad | 731-8300 | Fractionation of the gradients |
BioFrac | Biorad | 741-0002 | Fractionation of the gradients |
Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube | Sigma | Z666513-100EA | Gradient fraction and RNA extraction |
TRIzol Reagent | Life technologies | AM9738 | RNA extraction |
Luciferase Control RNA | Promega | L4561 | RNA extraction |
Chloroform | Fisher Scientific | C606-4 | RNA extraction |
Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | RNA extraction |
Isopropanol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
Ethanol | Sigma | E7023-1L | RNA extraction |
iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 170-8891 | Reverse transcription |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 175-5122 | Quantative PCR |
miRNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 217084 | Kit for total RNA isolation |
miScript II RT Kit (50) | Qiagen | 218161 | Kit for miRNA reverse transcription |
miScript Sybr Green PCR Kit (200) | Qiagen | 218073 | Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs |
Centrifuge 5424R | Eppendorf | For centrifugation of 1.5ml or 2.0ml tubes at different temperatures. Max speed – 21130g | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed – 2039g | |
My Cycler Thermal Cycler | Bio-Rad | For reverse transcription | |
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | For real-time PCR analysis | |
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | For quality control of RNA isolation |
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear | Bio-Rad | HSP9641 | For real-time PCR analysis |
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | For real-time PCR plate sealing |
Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL | Eppendorf | UX-24505-02 | For pipetting |
PIPETMAN Classic Pipets, P20 | Gilson | F123600G | For pipetting |
PIPETMAN Classic Pipets, P200 | Gilson | F144565 | For pipetting |
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL | Gilson | 17011782 | For pipetting |
Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | Improves total RNA isolation efficiency |
Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color | Denville | C2170 | RNA isolation and storage; reagent mix |
Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically | Denville | C18098-4 (1000910) | Reverse transcription reaction |
Sharp 10 Precision barrier Tips | Denville | P1096-FR | For pipetting |
Sharp 20 Precision barrier Tips | Denville | P1121 | For pipetting |
Sharp 200 Precision barrier Tips | Denville | P1122 | For pipetting |
Tips LTS 1 mL Filter | Rainin | RT-L1000F | For pipetting |
miScript Primer Assay (200) | Qiagen | (it changes according to the miRNA) | For real-time PCR analysis |
Gradient Master ver 5.3 Model 108 | BioComp Instruments | For preparation of sucrose gradients | |
trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
acetone | Sigma Aldrich | 650501 | |
Tris hydrochloride | Amresco | M108 | |
dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172 | |
iodoacetamide | Gbiosciences | RC-150 | |
sequencing grade modified trypsine, porcine | Promega | V5111 | |
ammonium bicarbonate | BDH | BDH9206 | |
formic acid, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A117 | |
methanol, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A454 | |
acetonitrile, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A996 | |
Protein LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf AG | 22431064 | |
Protein LoBind tubes 1.5 mL | Eppendorf AG | 22431081 | |
HLB µElution plate 30 µm | Oasis | 186001828BA | |
SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Savant SPD2010 | |
sonicator | Qsonica | Oasis180 | |
centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend micro 21R | |
LC trap column PepMap 100 C18 | Thermo Scientific | 160454 | |
LC separation column PepMap RSLC C18 | Thermo Scientific | 164536 | |
mass spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer | |
MSConvert software | ProteoWizard Toolkit | ||
Sorcerer-SEQUEST software | Sage-N Research, Inc. |