Här presenterar vi ett protokoll för att utföra polysome profilering på isolerade perfunderade mus hjärtat. Vi beskriver metoder för hjärtat perfusion, polysome profilering och analys av polysome fraktioner med avseende på mRNA, MicroRNA och det polysome proteomet.
Studier i dynamiska förändringar i protein översättning kräver specialiserade metoder. Här undersökt vi förändringar i nyligen-synthesized proteiner som svar på ischemi och reperfusion använder isolerade perfunderade mus hjärtat tillsammans med polysome profilering. För att ytterligare förstå de dynamiska förändringarna i protein översättning, vi kännetecknas av mRNA som var lastade med cytosoliska ribosomer (polyribosomes eller polysomes) och också återvinnas mitokondriella polysomes och jämförs mRNA och protein distribution i den högeffektiv fraktioner (många ribosomer knutna till mRNA), låg effektivitet (färre ribosomer knutna) som också ingår mitokondriell polysomes och icke-översätta fraktioner. MicroRNA kan också associera med mRNA som översätts, vilket minskar effektiviteten i översättning, vi undersökt fördelningen av MicroRNA över fraktioner. Fördelningen av mRNA, MicroRNA och proteiner undersöktes under basala perfunderade förhållanden, i slutet av 30 min av globala utan flöde ischemi och efter 30 min reperfusion. Här presenterar vi de metoder som används för att utföra denna analys – i synnerhet metoden till optimering av protein utvinning från sackaros övertoningen, eftersom detta inte har beskrivits innan — och ge några representativa resultat.
Hjärtat svarar på skadan av ischemi (I) och reperfusion (R) på ett dynamiskt sätt. Det finns dock lite insikt i akuta ändringar i proteinsyntesen under svaret. För att åtgärda detta, tog vi fördel av väletablerade metoden för polysome profilering1 för att identifiera ändringar i protein överflöd som återspeglar omfördelning av ribosomer och translationell reglerande faktorer från cytosolen till polysomes, och ökning av nyligen syntetiserade proteiner (nål-och sprututbyte). I inställningen av I / R, ökningen av nya proteinsyntesen inträffar i en tidsram som är oförenligt med transkription av nya mRNA2; discordance mellan mRNA-uttrycksnivåerna och protein överflöd har dessutom varit rapporterade3. Av dessa skäl valde vi att analysera förändringar i det dynamiska proteomet som återspeglas av protein översättning. Detta gör vi kvantifiera mRNA i polysome fraktioner och analysera protein sammansättningen i polysome fraktioner. Slutligen, eftersom mikroRNA (miRs) reglera tillgängligheten av mRNA för översättning och kan störa effektiviteten av protein översättning4,5, vi har granskat fördelningen av miRs i polysome fraktioner, med fokus på den svar till jag / R.
Vi valde att använda isolerade musmodell av perfusion och skördade vävnad under basala förhållanden av fortlöpande perfusion, efter 30 min globala utan flöde ischemi, och efter 30 min av ischemi följt av 30 min reperfusion. Vi sedan solubilized hjärtat vävnaden och separerade polysomes över en sackaros lutning, följt av proteomiska analys och selektiv upptäckt av mRNA och MicroRNA av PCR och microarray, respektive. Denna kombination av metoder representerar en kraftfull metod att förstå det dynamiska proteomet, som möjliggör samtidig identifiering av mRNA, miRNA, och nål-och sprututbyte, samt omfördelning av reglerande proteiner, miRNA och mRNA mellan nontranslating fraktioner, låg-effektivitet polysomes och högeffektiv polysomes (se figur 1). Insikter i dynamiska regleringen av denna process kommer att förlängas med ytterligare analys av fosforylering av reglerande faktorer t.ex eIF2α eller mTOR. Dessa individuella stegen nu beskrivs i detalj.
Polysome profil analys möjliggör studiet av protein översättning genom att analysera den translationella delstaten en specifik mRNA eller hela transkriptom6,7. Det är också till stor hjälp när lokal översättning behöver studeras såsom synaptosomes8. Denna metod innebär traditionellt, separation av mono – och polyribosomes och den associerade mRNA på sackaros toning som kunde kopplas till genomisk eller proteomiska tekniker f?…
The authors have nothing to disclose.
NIH P01 HL112730 (RAG, JVE), NIH R01 HL132075 (RAG, JVE), Barbra Streisand kvinnors hjärta Center (RAG, JVE), Dorothy och E. Phillip Lyon stol i molekylär kardiologi (RAG), Erika Glazer begåvad stol i kvinnans hjärthälsa (JVE) och tjeckiska vetenskapsakademin Institutionellt stöd RVO: 68081715 (MS).
Pentobarbital | Vortech Phamaceuticals | 9373 | for euthansia |
Heparin | Sagent | 103424 | used in langendorff preparation |
forceps | Fine Science Tools | 91110-10 | used to hang the heart |
Langendorff system | Radnoti + home made | n/a | A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths |
NaCl | Sigma | S7653-5KG | Krebs buffer and Sucrose gradient |
KCl | Sigma | P5405 | Krebs buffer and Lysis buffer |
KH2PO4 | Sigma | P-5504 | Krebs buffer |
MgSO4 | Sigma | M7774-500G | Krebs buffer |
Glucose | Sigma | G5767 | Krebs buffer |
CaCl2 | Sigma | C1016-500G | Krebs buffer |
Sucrose powder | Sigma | S0389-1KG | Sucrose gradient |
MgCl2 | Sigma | 208337 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
Tris-base | Sigma | T1503-1KG | Sucrose gradient and Lysis buffer |
Xylene Cyanole | Sigma | X-4126 | Sucrose gradient |
Cycloheximide | Sigma-aldrich | 239763 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
RNaseOUT | Life Technologies | C00019 | RNAse inhibitor for Lysis buffer |
Igepal CA-360 (NP40) | Sigma | I3021 | Lysis buffer |
Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free | Roche | 5056489001 | |
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
Ultracentrifuge | Beckman | LE-80K | Ultracentrifugation of the gradients |
Rotor | Beckman | SW41 | Ultracentrifugation of the gradients |
Biologic LP (pump) | Biorad | 731-8300 | Fractionation of the gradients |
BioFrac | Biorad | 741-0002 | Fractionation of the gradients |
Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube | Sigma | Z666513-100EA | Gradient fraction and RNA extraction |
TRIzol Reagent | Life technologies | AM9738 | RNA extraction |
Luciferase Control RNA | Promega | L4561 | RNA extraction |
Chloroform | Fisher Scientific | C606-4 | RNA extraction |
Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | RNA extraction |
Isopropanol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
Ethanol | Sigma | E7023-1L | RNA extraction |
iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 170-8891 | Reverse transcription |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 175-5122 | Quantative PCR |
miRNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 217084 | Kit for total RNA isolation |
miScript II RT Kit (50) | Qiagen | 218161 | Kit for miRNA reverse transcription |
miScript Sybr Green PCR Kit (200) | Qiagen | 218073 | Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs |
Centrifuge 5424R | Eppendorf | For centrifugation of 1.5ml or 2.0ml tubes at different temperatures. Max speed – 21130g | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed – 2039g | |
My Cycler Thermal Cycler | Bio-Rad | For reverse transcription | |
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | For real-time PCR analysis | |
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | For quality control of RNA isolation |
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear | Bio-Rad | HSP9641 | For real-time PCR analysis |
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | For real-time PCR plate sealing |
Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL | Eppendorf | UX-24505-02 | For pipetting |
PIPETMAN Classic Pipets, P20 | Gilson | F123600G | For pipetting |
PIPETMAN Classic Pipets, P200 | Gilson | F144565 | For pipetting |
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL | Gilson | 17011782 | For pipetting |
Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | Improves total RNA isolation efficiency |
Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color | Denville | C2170 | RNA isolation and storage; reagent mix |
Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically | Denville | C18098-4 (1000910) | Reverse transcription reaction |
Sharp 10 Precision barrier Tips | Denville | P1096-FR | For pipetting |
Sharp 20 Precision barrier Tips | Denville | P1121 | For pipetting |
Sharp 200 Precision barrier Tips | Denville | P1122 | For pipetting |
Tips LTS 1 mL Filter | Rainin | RT-L1000F | For pipetting |
miScript Primer Assay (200) | Qiagen | (it changes according to the miRNA) | For real-time PCR analysis |
Gradient Master ver 5.3 Model 108 | BioComp Instruments | For preparation of sucrose gradients | |
trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
acetone | Sigma Aldrich | 650501 | |
Tris hydrochloride | Amresco | M108 | |
dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172 | |
iodoacetamide | Gbiosciences | RC-150 | |
sequencing grade modified trypsine, porcine | Promega | V5111 | |
ammonium bicarbonate | BDH | BDH9206 | |
formic acid, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A117 | |
methanol, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A454 | |
acetonitrile, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A996 | |
Protein LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf AG | 22431064 | |
Protein LoBind tubes 1.5 mL | Eppendorf AG | 22431081 | |
HLB µElution plate 30 µm | Oasis | 186001828BA | |
SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Savant SPD2010 | |
sonicator | Qsonica | Oasis180 | |
centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend micro 21R | |
LC trap column PepMap 100 C18 | Thermo Scientific | 160454 | |
LC separation column PepMap RSLC C18 | Thermo Scientific | 164536 | |
mass spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer | |
MSConvert software | ProteoWizard Toolkit | ||
Sorcerer-SEQUEST software | Sage-N Research, Inc. |