Summary
この記事では骨髄での蛍光融合蛋白質の表現のための詳しいプロトコル由来樹状細胞とマクロファージを提供します。手法は骨髄の伝達レトロ ウイルス構造続いてマクロファージへの分化と樹状に前駆細胞の in vitro細胞します。
Abstract
樹状細胞やマクロファージは、病原体に対する防御の最初の行を形成する重要な細胞です。彼らはまた、適応免疫応答の開始に重要な役割を果たします。これらの細胞と実験的な作品はかなり困難です。彼らの豊富な臓器や組織には比較的低いです。その結果、彼らは大量に分離することはできません。また、cDNA の構造と transfect に困難です。マウス モデルにおけるこれらの問題は、M-CSF のマクロファージや樹状細胞に GM-CSF 存在下で骨髄前駆細胞から生体外で分化によって部分的に解決できます。この方法で非常に少数の動物から多量のこれらのセルを取得することが可能です。また、骨髄前駆細胞は、骨髄由来の樹状細胞とマクロファージに分化させ前に栽培の初期段階中に cDNA の構造を運ぶレトロ ウイルスのベクトルを使用導入できます。したがって、これらのセルのさまざまな cDNA の構造を表現するための in vitro分化続くレトロ ウイルスの伝達を使用できます。実質的に異所性の蛋白質を表現する能力は、蛍光タンパク質、タンデム精製インタラクトーム解析、構造機能解析のための生きているセルイメージ投射を含むこれらのセルに対して実行できる実験の範囲を拡張します。バイオ センサーおよび他の多くの細胞の機能を監視します。この記事では蛍光付けられた蛋白質のためのコーディングのベクトルとマウス骨髄由来の樹状細胞とマクロファージのレトロ ウイルスの伝達のための詳しいプロトコルについて説明します。OPAL1 と PSTPIP2、2 つのアダプター蛋白質の例には、フローサイトメトリーと顕微鏡でその実用的なアプリケーションを示します。利点とこのアプローチの限界についても述べる。
Introduction
骨髄系細胞は、病原体に対する私達の防衛メカニズムの不可欠な部分を表します。彼らは急速に死細胞と同様に、微生物を除去することができます。さらに、彼らは組織開発・修理調整や恒常性1,2,3を維持に関与しています。すべての骨髄細胞は骨髄で一般的な骨髄前駆細胞から区別します。多くの機能的および形態学的に明瞭なサブセットに分化させサイトカインとのさまざまな組み合わせの4によって制御される大規模な程度です。好中球の顆粒球、マクロファージ、樹状細胞、最も集中的に調査の骨髄細胞のサブセットが含まれます。これらの集団のいずれかの欠陥は、潜在的に生命にかかわる結果とヒトとマウス1,2,3,5,の免疫システムの機能不全を深刻な原因につながる6。
異なり、好中球の顆粒は、樹状細胞やマクロファージ、組織細胞と免疫器官における生息が比較的低い。その結果、分離・精製主樹状細胞と多数のこれらのセルを必要とする実験のためマクロファージは高価で、多くの場合不可能です。この問題を解決するために大量の同種のマクロファージや樹状細胞の培養を取得するプロトコルが開発されています。これらのアプローチは、サイトカインの存在下での骨髄細胞の分化に基づいています: マクロファージ コロニー刺激因子 (M-CSF) マクロファージや顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF) の Flt3 リガンドの樹状細胞7,8,9,10、11,12。このメソッドによって生成された細胞は、骨髄由来マクロファージ (BMDMs) と骨髄由来樹状細胞 (黒谷) は、文献のとおり一般的です。彼らはプライマリ マクロファージまたは対応する細胞より樹状細胞と共通の生理学的プロパティがあります。もう一つの主要な利点は、遺伝子これらの細胞の形態を得る可能性変更マウス13です。野生型細胞間比較研究し、遺伝子改変マウス由来の細胞は、遺伝子の発見の新しい機能または興味の蛋白質のために重大。
生きている細胞の蛋白質の細胞内局在性の解析には、体内の興味の蛋白質に蛍光ラベルの結合が必要です。蛍光蛋白質に (多くの場合短いリンカー) を介して結合解析タンパク質から成る遺伝的コード化の融合構造を表現することにより、最も一般的これ (e.g、緑の蛍光蛋白質 (GFP))14,15 。,16. 樹状細胞やマクロファージの蛍光付けられた蛋白質の表現は難しい。これらの細胞は一般的に transfect に困難で標準的なトランスフェクション プロシージャによって、効率は非常に低い傾向にあります。また、遺伝子導入は一時的なもの、細胞ストレスを生成する、蛍光の強度を実現した顕微鏡17のためできない可能性があります。十分な骨髄前駆細胞にレトロ ウイルスの感染、遺伝子発現レベルでこれらの細胞の合理的な割合を得るためにベクトルと BMDMs や黒谷にそれに続く分化が非常に効率的ななっています。アプローチ。それは彼らのネイティブ セルラ環境、定常状態または貪食能、免疫シナプス形成や移行など免疫反応にとって重要な工程で骨髄由来のタンパク質の解析ができました。ここでは、マウス骨髄由来マクロファージと樹状細胞に関心の蛍光タグ付きタンパク質を安定に発現を可能にするプロトコルについて述べる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ここで説明したすべてのメソッドは、チェコ共和国の科学アカデミー、分子遺伝学の研究所の実験動物福祉の専門家委員会によって承認されています。
1. 試薬の準備
- アンモニウム塩化カリウム (ACK) バッファーを準備します。DdH2O の 500 mL を加える NH4Cl の 4.145 g 及び 0.5 g KHCO3の 0.5 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を 100 μ l 添加し、フィルター滅菌します。
- ポリエチレンイミン (PEI) ソリューションを準備します。DdH2O. 90 mL に PEI の 0.1 g を追加します。を攪拌しながら pH が 2.0 未満になるまで 1 M 塩酸を滴下し追加します。3 時間までペイを溶解するまで撹拌、7.2 1 M NaOH で pH を調整します。フィルター滅菌し、ddH2O と 100 mL にボリュームを調整します。1-2 ml をし、-20 ° C で保存
メモ: 解凍後、プリンスエド ワード島が 4 ° C で 2 週間まで保存できるが、再固定されません。 - M-CSF や GM-CSF を含む細胞培養上清を準備します。これらの培養上清を前もって作っておくと-80 ° C で保存することができます。これらの培養上清をするためには、合流点に 10 cm シャーレ ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) でのサイトカイン産生細胞 (GM-CSF 18 J558 細胞) や M-CSF 19CMG 14-12 細胞を成長します。T150 培養フラスコや文化のメディアの 200 ml 5% CO2でさらに 4 日間のすべてのセルを転送 37 ° C0.2 μ m フィルターで清とフィルターを収集します。因数を行いこれら-80 ° C で保存
- 細胞培養液を 100 mL を準備: 10 %dmem 熱不活化 FBS と GM-CSF (腎不全分化) 用または M-CSF (BMDM 分化) の分泌細胞から培養上清を携帯します。
注: これらの培養上清中のサイトカインの量は変わることができます、使用濃度は、経験的に決定します。通常、GM-CSF (推奨される開始濃度は 2%) または CMG から上澄みを 5-10 %14-12 細胞 M-CSF (推奨される開始濃度は 10%) の生産を作り出す細胞からの 2-3% 上清を使用します。また、商業的精製 10 ng/mL で利用可能な M CSF と GM-CSF 20 ng/ml で使用できるサイトカインを含む上清、すなわち実質的に同一の結果、分化、感染効率の速度には影響なし。EGFP タグ構造体の細胞内の局在化。ペニシリンなどの抗生物質、特に明記しない限り、細胞培養プロトコルのすべてのステップでは G (100 IU/mL)、(100 μ g/mL)、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン (40 μ G/ml) を使用できます。
2. レトロ ウイルスの生産
注意: retroviral ベクトルはウイルスのベクトルの他のタイプと比較されたとき比較的安全、彼らまだ安全を脅かす潜在的です。したがって、細心の注意と適切な保護具を使用して、すべての安全規制やウイルス粒子を操作するための法的要件に準拠するために重要です。
- 10 cm シャーレでプラチナ エコ (ぷらっと-E) 包装細胞の単一細胞懸濁液をプレートし、15 ml の 10% を含む DMEM の育成政府短期証券の 50-60% 合流 (24 h) まで。細胞が単層成長する必要があり、文化の塊を形成してはいけません。
- レトロ ウイルスのコンストラクトのピペット 20 μ g (e.g。、pMSCV ベクターへの関心の蛍光タグ蛋白を発現する構造) および DMEM (せずに血清および抗生物質) 1 mL に20をベクトルと優しく混ぜる pCL エコ包装の 10 μ g。
- 2 番目の管に DMEM (血清と抗生物質) なし 1 mL に PEI の 75 μ L を追加します。室温 (RT) で 5 分間インキュベートし、両方の管の内容を一緒に混合し、室温でさらに 10 分間インキュベート
注: pCL-エコの追加はオプションです。それはマウス白血病ウイルスエンベ ウイルス受容体のコーディングしておりウイルス力価を高める可能性があります。 - 8 ml の 2% と新鮮な DMEMsupplemented のぷらっと-E 細胞の中に慎重に取り付けます FBS。事前使用前に 37 ° C の中を温めます。抗生物質は、トランスフェクション効率を減らすことができるので、トランスフェクション、時に抗生物質を使用しないでください。
- 慎重にステップ 2.3 Plat E 細胞で作製した混合物を (低下) 追加し、37 ° C で 4 時間インキュベート
- Plat-E 細胞 10% を含む予め温めておいた DMEM の 10 mL の培地を交換、孵化後 FBS、37 ° C で 24 時間細胞を養うとこの潜伏中にぷらっと-E 細胞メディアにウイルスが生成されます。
- 24 h 後 5 mL ピペットを使用してプラチナ エコ セルからレトロ ウイルス粒子を含む媒体を収集し、(「上清 1「マウス白血病ウイルスエンベ レトロ ウイルス粒子を含む =) 15 mL 遠心管それを転送します。
- ウイルス上清中にぷらっと-E 細胞による汚染を避けるためには、4 ° C で 5 分間 1250 × g で収集されたウイルスをスピンします。最良の結果ウイルスは感染症のためすぐに使用する必要があります。
注: ウイルスの因数は、後で使用できる-80 ° C で保存もできます。しかし、それは伝達効率で特定の削減になります。それはウイルスの劣化につながるので、ウイルスの凍結/融解を繰り返しを避けてください。 - 10% FBS Plat-E に細胞、37 ° C で 24 時間のもう一つの育成とに予め温めておいた DMEM の 10 mL を追加します。
- 2.7 の手順を繰り返します。2.8。「清 2"を取得します。
3. 骨髄細胞の分離
- 頚部転位またはその他の承認された方法を使用してマウスを犠牲に。70% のエタノールとマウスをスプレーします。
- ピンセットとはさみを使って、後ろ足から肌だけでなく、筋肉の一部を削除します。大腿骨を壊すことがなく、股関節から寛骨臼を慎重に外します。足関節の足をカットします。70% のエタノールの骨 (大腿骨は脛骨に接続されている) をスプレーし、ペーパー タオルを使用して筋肉の残りの部分を削除します。
- 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2% を含む 5 cm シャーレに骨を置く FBS (PBS-FBS)。 より多くの骨の準備している場合、維持処理まで氷の上シャーレ。
- 栽培無菌性の確保、ティッシュ文化フードのすべての次の手順を実行します。
- 大腿骨脛骨骨端 (曲げ膝関節とハサミで慎重にカット) を壊すことがなく分離します。
- 骨の 1 つずつを処理します。ピンセットで骨を押しながら骨 (約 1-2 mm) の非常に小さい部分をハサミでカットします。
- 30 G の針と 2 を使用して、または 5 mL シリンジ充填 PBS-FBS 15 mL 遠心管に骨の両端から骨髄細胞をフラッシュします。すべてのセルを削除するためにフラッシュの間に骨の中に針を移動します。針が詰まって取得する場合、は、それを変更します。
注: 骨をフラッシュ中に白に赤から回す必要があります。これは細胞の大半が骨から削除されたことを示します。骨ごと PBS FBS の約 2-3 mL を使用します。 - 4 ° C で 5 分間 500 x g で細胞を遠心分離します。
- 上澄みを廃棄し、室温で 2-3 分の ACK バッファーの 2.5 mL にペレットを再で赤の血液細胞を溶解させます。溶解中に 15 mL の新鮮な centrifug チューブに 100 μ m 携帯こし器を通って骨髄細胞をフィルターします。PBS FBS の 12 mL を追加することによって、緊張を復元します。
注: は、細胞死を回避する ACK バッファーと低張性換散の 5 分を超えないようにします。 - すぐに 4 ° C で 5 分間 500 × g で遠心します。
4. 骨髄細胞分化骨髄由来マクロファージ
- 10 %fbs と抗生物質 DMEM で骨髄細胞のペレットを再懸濁します (手順 1.4 後のメモを参照してください。 抗生物質濃度) のセルをカウントすると。BM への分化は、マクロファージを派生、プレート 5-10 × 106骨髄細胞で、10 cm 非組織培養の手順 1.4 から血清と M-CSF と事前に用意された DMEM メディアの 10 ml (細菌) のペトリ皿を扱われます。
注: 骨髄細胞の収量は約 4 x 107 6-8 週-古い c57bl/6 j マウス。 - 5% CO2、37 ° C で 3 日間インキュベート細胞文化のインキュベーター内のセル
注: 最初の 2 日間非常に重要な見ていない細胞アポトーシス細胞数が多いは存在 (細胞骨髄系細胞に最終分化段階の細胞を区別することができません)。 - 3 日後に、骨髄細胞培養が重要に見えてくる、細胞分裂のクラスターが形成されます。最初の付着性のセルが既に見られます。この時点で、新鮮なサイトカイン メディアで細胞を補います。
- 各 10 cm シャーレに mL の血清と M-CSF (手順 1.4) から予め温めておいた DMEM 培地 10 を追加し、携帯文化のインキュベーターで返します。このステップの中に古いメディアを削除する必要はありません。
注: 骨髄マクロファージは、5-7 日間の培養後完全に区別されます。収穫に最適な時間は、6-8 細胞の大半が付着し、ペトリ皿は完全に覆われている日です。 - 5 日目、携帯文化フードにペトリ皿を取るし、メディアはほとんど料理の端に到達するまで皿を傾斜します。慎重に端面からメディアの 15 mL を取り出し、セルは、皿の真ん中にとどまる傾向があります。M-CSF に予め温めておいた媒体の同じボリュームを追加し、インキュベーターに皿を置きます。
注: メディアは、ゆっくりと慎重に吸気は、セルがほぼ失われません。しかし、それも吸気メディアを遠心し、細胞を確認なしの非付着性文化に追加する可能です (すなわち。 不完全差別化) 細胞が失われる。 - 実験では, 付着細胞 (マクロファージ) のみが使用されます。6 または 7 の日に細胞を収穫するには、すべてのメディアおよび浮遊細胞を削除します。血清なしに予め温めておいた PBS の一度皿を洗ってください。
- Pbs は、0.02 %edta の 5 mL を追加し、組織文化のインキュベーターで 37 ° C で 3-5 分間インキュベートします。
- 5 mL のピペットを使用して、皿で、ストリームの PBS-EDTA からセルを削除し、PBS の 25 mL と 50 mL の遠心管に配置します。必要な場合より多くの料理を一緒に分かち合います。
- すぐに 4 ° C で 5 分間 500 × g で遠心します。
- DMEM メディアで大食細胞ペレットを再懸濁し、セルをカウントします。(CD11b と F4/80) マクロファージ表面分化マーカーの発現をフローサイトメトリーによってを確認します。
- 例えば懸濁液中に細胞を必要とする実験のため。、フローサイトメトリー実験、qPCR または西部のしみの分析の流れ、マクロファージを直接使用します。付着性マクロファージ実験、実験のセットアップに従って組織培養プレートの細胞をプレートします。
- セルはすでに完全に区別されます。目的の実験用に最適のメディアまたは M CSF に元の増殖・分化のメディアでそれらを保ちます。
注: 付着性マクロファージでの作業は、新しいそれらを転送の新規のサーフェスに完全な付着を許可するには (理想的には一晩) を使用する前に、少なくとも 6 時間をプレートします。浮遊細胞のごく一部は、実験の前に削除できます。
5. 骨髄細胞分化骨髄由来樹状細胞
- 次の手順 5.2-5.4 で説明黒谷特定調整と BMDMs のプロトコルに従ってください。
- 10 %fbs と抗生物質 DMEMsupplemented の骨髄細胞の得られたペレットを再懸濁します、(によってマクロファージ プロトコルの次のステップの 4.1) のセルをカウントします。樹状細胞への分化、プレート 1-1.57骨髄細胞の 10 倍で、10 cm 非組織培養では、mL の血清と GM-CSF 事前に用意された DMEM 培地 10 での (細菌) ペトリ皿を処理 (手順 1.4.) から。
- BMDM プロトコルのように同じ栽培手順を実行 (手順 4.3-4.5。 マクロファージ プロトコルの)。血清と M-CSF の代わりに GM-CSF DMEM メディアを使用します。黒谷の栽培時間が長いので (通常 10-12 日) 1-2 追加授乳 3 日間隔で (上清を除去し、追加手順 4.5 の説明に従って新しい栽培メディアを追加します。)。
- プロトコルのこの部分は実質的にマクロファージ プロトコルの対応する部分と同じ (ステップ 4.6-4.12。 マクロファージ プロトコル)。実験のため付着性のセルだけを使用します。10-12, EDTA を使用して細胞を収集日にカウントし、新しい面板のそれら。樹状細胞の表面分化マーカーの発現を確認 (CD11c + CD11b + F4/80-) フローサイトメトリーによる。
6. BMDMs の興味の蛋白質をタグ付きの EGFP を表現する黒谷生産
- ステップ 3.10 骨髄細胞のペレットを再懸濁します。10 %fbs と抗生物質添加 DMEM にしセルをカウントします。感染症 2-5 10 x を使用して、6 /6 ウェル培養ウェル BM 細胞の治療プレート。
- 準備された DMEM メディアごとの 1 mL の細胞も、補完 BMDMs への分化の M-CSF もしくは GM-CSF 黒谷の差別化のためプレートが 37 ° C で 5% CO2と組織文化のインキュベーターで 4-6 時間細胞を保つ
- Polybrene (12 μ G/ml、添加後のセルに最終濃度 8 μ g/mL) を添加した新鮮な収集したウイルス (「上清 1」) の 2 mL を追加します。
注: ウイルスを含む上清の冷凍の因数を使用もことができます、しかし、有効性は低くなります。 - (徐々 に加速と減速) 30 ° C で 90 分間 1,250 x g でプレートを遠心します。その後、37 ° C で 5% CO2で 4 時間インキュベートします。
- オプション: 新鮮なの媒体含んでいるそれぞれサイトカイン (M CSF や GM-CSF) と 5% CO2 37 ° C で培養培地 2 mL を置き換える2 日目、培地 2 mL を削除し、2 ml の新鮮な収集したウイルス (「清 2」) 全体の感染手順 (ステップ 6.3-6.4) を繰り返します。
注: この手順では、感染性が増加します。改善後 2 番目の感染症はセル型とターゲット蛋白質に私達の経験に依存して異なります 30% の増加効率の改善をまったくします。 - 収集非付着性のセルは 15 mL 遠心管に移し、5 分間 (4 ° C) 500 x g でスピンします。上清を捨てます。
- M-CSF や GM-CSF と培地 10 mL に細胞ペレットを再懸濁します、10 cm の組織培養処理ペトリ皿にセルを置き、37 ° c、5% CO2文化します。10 cm の皿のためのセルの最適な数は 5-10 × 106骨髄由来マクロファージおよび 10 x 10-156 BM 由来樹状細胞。
注: より小さい料理やプレート使用できますが、細胞の数をそれに応じて調整する必要があります。 - マクロファージをに従って、樹状細胞の培養と分化のプロトコルは 4 と 5 の手順で説明します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
シグナリングのアダプタータンパク質は通常小さい蛋白質の酵素の活動がないです。彼らは様々 な相互作用ドメインを所有している、または21チロシンのキナーゼ、ホスファターゼ、ユビキチンリ ガーゼを含むシグナル伝達に関与するモチーフ、他の蛋白質に結合の調停。このプロトコルの機能のデモンストレーションについては、骨髄球系細胞アダプター PSTPIP2 と OPAL1 が選ばれました。PSTPIP2 はよく特徴付けられてタンパク質22炎症反応の調節に関与です。その F bar ドメインを介して細胞膜に募集するもことができる細胞質タンパク質です。第 2 蛋白質、膜貫通アダプター OPAL1、細胞膜に関連する予想です。生理機能はまだ不明です。ただし、急性リンパ性白血病で OPAL1 の発現はより良い予後23に関連付けられます。
cDNA を構築 PSTPIP2 または OPAL1 が短いリンカーを介してヒューズを符号化 (GSGGGS または Myc タグ、それぞれ) C 末端 EGFP された cDNA クローニングの標準的なメソッドを使用して pMSCV レトロウイルスベクターに複製されます。このコンス トラクターはエコ包装ベクトル pCL と一緒に Plat E 細胞にトランスフェクションし。レトロ ウイルスを含む結果の培養上清は、BMDMs と黒谷に分化が続いて骨髄細胞の情報伝達に使用されました。ぷらっと-E トランスフェクションの効果は、2 番目のウイルスを含む上清のコレクションの後フローサイトメトリーによって評価されました。OPAL1 と結果が再現性が高い (図 1 a, B) の平均のトランスフェクション効率 62% PSTPIP2 EGFP と 53% であった。OPAL1 構築 transfected セルの割合の減少に終って Plat E 細胞は (浮動死にかけている培養細胞の出現によって評価される) のより有毒であるように見えた。
フローサイトメトリーによる骨髄由来マクロファージと樹状細胞 (PSTPIP2 EGFP と OPAL1 EGFP のレトロ ウイルス構造増殖型) の分化状態を評価しました。樹状細胞は CD11c 系列マーカーを表現しながら、成熟したマクロファージの人口は CD11b と F4/80 式によって定義されます。彼らのそれぞれのマーカー (図 2 aB) の文化の両方のタイプの細胞の 90% 以上が陽性。最後に、我々 は蛍光の単純なフロー フローサイトメトリー測定による BMDMs と黒谷 PSTPIP2 EGFP と OPAL1 EGFP の発現レベルを構築を決定しました。EGFP 陽性マクロファージの平均割合は PSTPIP2 EGFP の 71%、62% OPAL1 EGFP (図 3 a)。樹状細胞の場合効率が低く, PSTPIP2 の 32%、9 %opal1 (図 3 b)。複数の実験の結果では、このメソッド (図 3) の再現性を示します。
我々 は通常の感染症で使用する培養上清中のウイルス量を判断できません。ウイルス抗体価測定に 3 つの追加日が必要ですが、コレクションの後すぐにウイルス培養上清フレッシュを使うことが望ましい。その結果、ウイルス力価の情報のみ取得できます事後。ただし、技術的な問題や問題をアドレス指定するとき有用なそれまだすることができます。PSTPIP2 EGFP Plat E から培養上清中のウイルス量を評価するために細胞をトランスフェクトしたと OPAL1 EGFP を構築, 我々 は transfected Plat E 細胞から収集した希釈したウイルスを含む上清と NIH 3T3 細胞を培養し、以前に発行されたゼウスの記事24の Zjablovskajaらによって上記のとおりウイルス価を決定します。3 つの独立実験のウイルス価 1.1 × 10 〜 4.4 × 106 6 TU/mL。PSTPIP1 EGFP と OPAL1 EGFP 構造と清 1 日目と 2 日目の間任意の実質的な違いは見られなかった。ときこれらの培養上清は 1.1 〜 4.4 感染 (MOI) の多様性は、この資料で説明しているプロトコルによると骨髄細胞感染を使用しました。興味深いことに、この範囲内では見られなかったモイと感染効率の相関。
図 4、PSTPIP2 EGFP と OPAL1 EGFP BMDMs と黒谷で表現された共焦点顕微鏡による可視化。完全に分化したマクロファージや樹状細胞は、特徴的な形をしています。小さな丸みを帯びた前駆細胞から不規則な形の大型の細胞の形態の変化は、正常な分化を確認します。PSTPIP2 は年マクロファージ、細胞質膜に部分的なローカライズで。細胞膜にも部分的に対象となる OPAL1 が登場しました。残りの部分は、可能性が高い小胞体とゴルジ複合体などの細胞内膜に関連付けられていた。しかし、この局在を確認するは特定の細胞小器官のマーカーは使用するにでしょう。樹状細胞の膜のローカリゼーションはより少なく明らかだった。
図 1: ぷらっと-E 細胞トランスフェクションの効率です。ぷらっと-E セルの transfection のため (PSTPIP2 EGFP と OPAL1 EGFP) EGFP とアダプター蛋白質を符号化する PSTPIP2 と OPAL1 が融合した 2 つの構造 pMSCV ベクターにクローニングを行った.標準的なペイ トランスフェクションを行った。トランスフェクションの効率は、2 番目のウイルス上清のコレクションの後 Plat E 細胞のフローサイトメトリーによって評価されました。(A). 代表的な流れの cytometry のプロット。(B). 4 つの独立した実験の結果を示すグラフします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: BMDMs (A) と (B) 黒谷の分化状態を評価します。特定マクロファージ, 樹状細胞の系統のマーカーの発現をフローサイトメトリーによる栽培の 8 日目に測定しました。死んだ細胞はうちゲートされた側、前方散乱特性に基づくし、ヘキスト 33258 で染色します。結果は、少なくとも 3 の独立実験の代表です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: PSTPIP2 EGFP と OPAL1 EGFP の発現の評価します。蛍光 BMDMs (A) と (B) 黒谷 PSTPIP2 EGFP と OPAL1 EGFP の構造と遺伝子導入は、栽培の 8 日目でフローサイトメトリーにより測定しました。(C). 複数の独立した実験の結果を示すグラフ。BMDMs と黒谷は、図 2のようにゲートだった。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: マクロファージと樹状細胞の PSTPIP2 または OPAL1 を表現する代表的なイメージです。(A) BMDMs と PSTPIP2 と OPAL1 を表現する黒谷 (B) は、ライブの共焦点顕微鏡によって想像されたもの。蛍光グリーンでは、各パネル、右の明るいフィールド画像の左側に表示されます。スケール バー = 10 μ m。結果は、少なくとも 3 つの独立実験の代表です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
標的細胞の興味の蛋白質の表現は、多くの種類の生物学的研究の重要なステップです。分化したマクロファージや樹状細胞が標準のトランスフェクションとレトロ ウイルス伝達技術によって transfect に困難です。これらの異所性 Cdna の発現を許可する重要なステップは、骨髄前駆細胞、分化に続いて彼らは既に目的の構造を運ぶときのレトロ ウイルス伝達のこれらの分化した細胞のトランスフェクションをバイパスします。細胞の種類。このメソッドの使用の成功の例は、私たちの最近の文書25で見つけることが。ここでは、骨髄由来の樹状細胞とマクロファージがこのアプローチを使用して選択の構造を安定に発現を実現するコスト効率の高いプロトコルを提供します。提案する手順は、比較的安価な簡単なまだ非常に良い結果を提供することです。このプロトコルで使用する試薬も比較的厳しい予算の下で日常的な使用を可能にします。ぷらっと-E の transfection のためのプロトコルは、トランスフェクション試薬として PEI を採用しています。その他化学トランスフェクション エージェントと比較して、プリンスエド ワード島は非常に低コストの他の大半が広く化合物を使用、効率に似ています。ただし、このステップで効率を損なうことがなく多くの異なる市販トランスフェクション試薬とプリンスエド ワード島を置き換えることができます。基本理念としてトランスフェクション プロトコルが一般的に使用される HEK293 細胞で通常動作するように知られているをぷらっと-E 細胞とよくあまりにも実行します。別の費用対効果測定は、精製組換えサイトカインではなくサイトカインを含む上清の利用です。これらの培養上清の使用には、いくつかの最適化が必要です。しかし、その準備のため標準プロトコルが確立し、続いて、これらの培養上清の各バッチの間変動なります非常に低く、通常作業の個々 のロットの濃度の変化を必要としません。これらの培養上清を BMDM と腎不全の分化の効率性が、我々 の経験では、精製されたサイトカインと同じで。
(通常カチオン脂質や DNA と複合体カチオン性ポリマーを使用して) 化学の導入、エレクトロポレーションの使用など、哺乳類の細胞のトランスフェクションの他の確立された方法が存在レトロ ウイルス伝達に加えて他のタイプのウイルスのベクトル、主にアデノ ウイルス、レンチ ウイルス システム26,27,28,29,30。アデノ ウイルスを用いた遺伝子デリバリー、対応するプラスミッドの準備で非常に高価と効率化を実現し、ウイルス粒子がより難しく、レトロ ウイルス システム29の場合よりも時間がかかる。また、アデノ ウイルス誘発炎症反応マウス造血細胞マウスひずみを運ぶ遺伝子組換えで最適なパフォーマンス、樹状細胞とマクロファージ29,31,32アデノ ウイルス受容体は、必要な33です。その一方で、興味の遺伝子を運ぶレンチ ウイルス粒子の生成は、比較的簡単なプロセスでは、レトロ ウイルスのために利用するものと実質的に同じです。このプロトコルで使われるマウス白血病ウイルスエンベ retroviral ベクトル、対照のレンチは人間34を含む複数種の非増殖細胞を感染させることができます。特定の実験条件下での重要な利点があります。ただし、この機能は、これらのベクトルの安全性も大幅低下します。BMDMs、黒谷、遺伝子送達のための我々 の意見では、レトロ ウイルスは、効率、安全性と使いやすさの最適なバランスを提供します。レトロ ウイルスの DNA 構造は、単純な標準的な分子クローニング技術を使用して簡単に作成できます。ウイルスは培養上清中に直接細胞を包装と更にウイルスの精製は通常必要ありません。マウス白血病ウイルスエンベ レトロ ウイルスも容易に感染しない人間の細胞の使用を比較的安全になります。しかし、またデメリットがあります一般的な retroviral ベクトルの使用に関連付けられています。主要な制限要因は、これらのウイルス感染だけで35を細胞増殖のことです。この機能は、ここで説明されているプロトコルを与えませんが、レトロウイルスベクターを使用できるアプリケーションの範囲を制限します。これらのベクトルにクローンを作成することができます興味の遺伝子のサイズも限られ、ウイルスの粒子の力価は、チップサイズの増加と共に減少します。PMSCV ベクトルで我々 は通常約 3 kbp 挿入寸法の影響を見てを開始します。チップサイズのさらなる増加と感染効率は徐々 に低下します。
化学のトランスフェクションとエレクトロポレーション、使いやすく、安全性とウイルス ベースのプロシージャ26,27,28,30のいずれかより少なく時間のかかる。しかし、BMDMs、黒谷外国核酸31レスポンスを刺激することができますより細胞ストレスを生成します。さらに、いくつかの化学のトランスフェクション試薬はセル自動蛍光フローサイトメトリーを妨げる可能性を増減顕微鏡分析します。式の一時的な性質のためにのみ使用できます成熟分化 BMDMs と黒谷。対照的に、レトロウイルスベクターで導入されたシーケンスが完全に標的細胞のゲノムに統合されているし、分化プロトコル34,のタイム スケールと互換性のある安定した長期的な表現を可能にします。35です。 ただし、この機能も挿入のリスクが高まります。ベクトル統合の比較的ランダムな性質のため細胞の大規模な集団への影響は限定されます。しかし、彼らは個々 の細胞のレベルでの表示にことがあります。レトロウイルスベクター影響樹状細胞やマクロファージへの分化、生成に失敗、その結果から表現される構造が感染した前駆細胞から BMDMs または黒谷を区別するとき、追加問題が生じる。ある程度、これは低発現レベルを達成するために感染条件を調整することによって克服することがあります (e.g。、ウイルス価を減らすことによって) または発現誘導システムを使用して。実験の目標および制限事項に対応する式レベルとセルの並べ替えも記者、興味の蛋白質に溶ける EGFP の使用できます。最後に、我々 はすべてのトランスフェクション/伝達手順に共通する問題を言及すべき。主に過剰発現の工芸品、タンパク質フォールディング、サッカード定位誤りと毒性36などが含まれます。タンパク質の毒性は、OPAL1 が比較的言いにくい理由で可能性があります。その例は明らかに発現タンパク質の性質も実質的にこのメソッドの有効性に影響を与えることができますを示します。しかし、それにもかかわらず、OPAL1 EGFP この方法で顕微鏡による解析のための細胞を表現する、困難な対象を扱う場合でも、その有用性を実証の十分な量を取得することができました。さらに、特定のアプリケーションに必要な場合、FACS の並べ替えによって導入された細胞の割合を増やすことが可能ででしょう。低感染効率には、さまざまな方法やすぐに使えるキットを使用してウイルスの粒子濃度の増加で部分的に克服できます。私たちの手でカット 100 kDa の分子量を有する遠心フィルター ウイルス上清の限外ろ過効率と必要な労力の最適なバランスを提供するために証明されています。
骨髄由来マクロファージ、樹状細胞は食細胞免疫学で広く使用されるツールです。利用可能なセルの行よりもっと生理学的に関連しています。彼らは比較的高い数値で生成することができ、同時に細胞の遺伝の不均質性と不安定性の特性がないです。もう一つの利点は、比較的豊富な均一な細胞集団の遺伝的に変更された効果を研究する遺伝子改変マウスから生成されることです。これは比較的多量のセルが通常必要な生化学的研究で便利です。これらの細胞で cDNA の構造を変換する能力は再構成あるいは遺伝的欠陥これらの細胞および構造機能分析の相補性に基づく研究の追加の可能性を開きます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、によってチェコ科学財団 (GACR) (プロジェクト番号 16-07425S)、チャールズ大学グラント機関 (GAUK) (プロジェクト番号 923116) によって、遺伝子、チェコの科学アカデミーの研究所からの資金調達機関でサポートされていた共和国 (RVO 68378050)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | For media suplementation |
| KHCO3 | Lachema, Brno, Czech Republic | N/A | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | A9434 | |
| Penicillin | BB Pharma AS, Prague, Czech Republic | N/A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic | N/A | |
| Polyethylenimine, linear, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| PBS | Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic | N/A | |
| APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 101212 | flow cytometry analysis |
| PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 123110 | flow cytometry analysis |
| APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 117310 | flow cytometry analysis |
| M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-02 | |
| GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-03 | |
| Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | H1398 | flow cytometry analysis use at 1-2 µg/mL |
References
- Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
- Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
- Kondo, M. Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors. Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).
- Andrews, T., Sullivan, K. E. Infections in patients with inherited defects in phagocytic function. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
- Scheicher, C., et al. Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow. Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).
- Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot5080 (2008).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Remington, S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).
- Hoffman, R. M. Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).
- Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. Flow cytometry of fluorescent proteins. Methods. 57 (3), 318-330 (2012).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).
- Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen. Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Janssen, E., Zhang, W. Adaptor proteins in lymphocyte activation. Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).
- Ferguson, P. J., Laxer, R. M. New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice. Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).
- Holleman, A., et al. Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols. Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).
- Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).
- Kralova, J., et al. The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).
- Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).
- Siegert, I., et al. Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells. Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
- Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).
- Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
- Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).
- Tallone, T., et al. A mouse model for adenovirus gene delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).
- Milone, M. C., O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. , (2018).
- McTaggart, S., Al-Rubeai, M. Retroviral vectors for human gene delivery. Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
