Summary
In dit artikel geven wij dat een gedetailleerd protocol voor de expressie van fluorescerende fusion eiwitten in lymfkliertest beenmerg-afgeleide dendritische cellen en macrofagen. De methode is gebaseerd op de transductie van het beenmerg progenitoren met retrovirale constructies gevolgd door differentiatie in macrofagen en dendritische cellen in vitro.
Abstract
Dendritische cellen en macrofagen zijn cruciale cellen die de eerste lijn van verdediging tegen ziekteverwekkers vormen. Zij spelen ook belangrijke rollen in de inleiding van een adaptieve immuunrespons. Experimenteel werk met deze cellen is nogal uitdagend. Hun overvloed in organen en weefsels is relatief laag. Dientengevolge, kunnen niet zij worden afgezonderd in grote aantallen. Ze zijn ook moeilijk te transfect met cDNA constructies. In het lymfkliertest model, kunnen deze problemen ten dele worden overwonnen door in vitro differentiatie van beenmerg progenitoren in aanwezigheid van M-CSF voor macrofagen of GM-CSF voor dendritische cellen. Op deze manier is het mogelijk om grote hoeveelheden van deze cellen te verkrijgen uit de weinige dieren. Bovendien kunnen het beenmerg progenitoren worden transduced met de retrovirale vectoren uitvoering van cDNA constructies tijdens de vroege stadia van de teelt voorafgaand aan hun differentiatie in het beenmerg-afgeleide dendritische cellen en macrofagen. Dus, kan de retrovirale transductie gevolgd door differentiatie in vitro wil verschillende cDNA constructies in deze cellen worden gebruikt. De mogelijkheid om uit te drukken ectopische eiwitten aanzienlijk vergroot het bereik van experimenten die kunnen worden uitgevoerd op deze cellen, met inbegrip van de levende cel beeldvorming van fluorescente proteïnen, tandem zuivering voor interactome analyses, structuur-functie-analyses, bewaking van cellulaire functies met biosensoren en vele anderen. In dit artikel beschrijven we een gedetailleerd protocol voor retrovirale transductie van lymfkliertest beenmerg afgeleide dendritische cellen en macrofagen met vectoren codering voor fluorescently-gelabelde proteïnen. Op het voorbeeld van twee adaptor eiwitten, OPAL1 en PSTPIP2, we laten zien op de praktische toepassing ervan in de stroom cytometry en microscopie. Ook bespreken we de voordelen en beperkingen van deze aanpak.
Introduction
Myeloïde cellen vormen een onmisbaar onderdeel van onze afweermechanismen tegen ziekteverwekkers. Ze kunnen snel elimineren microben, evenals de stervende cellen. Daarnaast zijn zij ook betrokken bij de regulering van weefsel ontwikkeling en reparatie en ter handhaving van de homeostase1,2,3. Alle myeloïde cellen onderscheiden van gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen in het beenmerg. Hun differentiatie in vele functioneel en morfologisch verschillende subsets is voor een groot deel gecontroleerd door cytokines en hun verschillende combinaties4. De meest intensief bestudeerde myeloïde cel subsets omvatten neutrofiele granulocyten, macrofagen en dendritische cellen. Defecten in om het even welk van deze bevolkingsgroepen leiden tot potentieel levensbedreigende gevolgen en oorzaak ernstige stoornissen van het immuunsysteem bij de mens en muizen1,2,3,5, 6.
In tegenstelling tot de neutrofiele granulocyten, dendritische cellen en macrofagen zijn verblijfplaats weefselcellen en hun overvloed in immuun organen is relatief laag. Dientengevolge, is de isolatie en zuivering van primaire dendritische cellen en macrofagen voor experimenten waarbij een groot aantal van deze cellen duur en vaak onmogelijk. U kunt dit probleem oplossen, zijn protocollen ontwikkeld voor het verkrijgen van grote hoeveelheden van homogene macrofagen en dendritische cellen in vitro. Deze benaderingen zijn gebaseerd op de differentiatie van lymfkliertest beenmergcellen in aanwezigheid van cytokines: macrofaag kolonie-stimulerende factor (M-CSF) voor macrofagen en granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) of Flt3 ligand voor dendritische cellen7,8,9,10,11,12. Cellen die zijn gegenereerd door deze methode worden vaak beschreven in de literatuur als beenmerg afgeleid macrofagen (BMDMs) en het beenmerg-dendritische cellen (BMDCs afgeleide). Ze hebben meer fysiologische eigenschappen gemeen met primaire macrofagen of dendritische cellen dan met bijbehorende cellijnen. Een ander groot voordeel is de mogelijkheid van het verkrijgen van deze cellen vormen genetisch gemodificeerde muizen13. Vergelijkende studies tussen wild-type cellen en cellen die zijn afgeleid van genetisch gemodificeerde muizen zijn vaak essentieel voor het blootleggen van de nieuwe functies van genen of eiwitten van belang.
Analyse van subcellular localisatie van proteïnen in levende cellen vereist de koppeling van een fluorescerende label om de proteïne van belang in vivo. Dit wordt meestal bereikt door het uiten van genetisch gecodeerde fusion constructie bestaat uit een geanalyseerde eiwit gekoppelde (vaak via een korte linker) aan een fluorescente proteïne (bv., groen fluorescente proteïne (GFP))14,15 , 16. de expressie van fluorescently tagged eiwitten in dendritische cellen of macrofagen is een uitdaging. Deze cellen zijn over het algemeen moeilijk te transfect door standaard transfectie procedures en de efficiencyeffecten zijn meestal zeer laag. Bovendien, de transfectie van voorbijgaande aard is, genereert het cellulaire stress en bereikte intensiteit van de fluorescentie misschien niet voldoende voor microscopie17. Met het oog op een redelijke breuk van deze cellen met een voldoende niveau van transgenic expressie, de infectie van het beenmerg voorlopercellen met retrovirale vectoren en hun latere differentiatie in BMDMs of BMDCs is uitgegroeid tot een zeer efficiënt aanpak. Het is toegestaan voor de analyse van de eiwitten van myeloïde oorsprong in hun inheemse cellulaire omgeving, zowel in een stabiele toestand of tijdens processen die essentieel zijn voor de immuunrespons zoals fagocytose, immunologische synapse formatie of migratie. Hier beschrijven we een protocol waarmee stabiele expressie van fluorescently tagged proteïnen van belang in lymfkliertest beenmerg afgeleid macrofagen en dendritische cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door het Comité van deskundigen voor het welzijn van de proefdieren van het Instituut voor moleculaire genetica en door de Academie van Wetenschappen van de Tsjechische Republiek.
1. reagens voorbereiding
- De buffer van ammonium-chloride-kalium (ACK) voor te bereiden. Voeg 4.145 g NH4Cl en 0,5 g voor KHCO3 tot 500 mL van ddH2O, dan Voeg 100 µL van 0.5 M ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) en filter-steriliseren.
- Bereid polyethylenimine (PEI) oplossing. Voeg 0,1 g van PEI aan 90 mL ddH2O. Tijdens het schudden moet toevoegen 1 M HCl ontkleuring totdat de pH lager dan 2.0 is. Schud gedurende maximaal 3 h tot PEI is opgelost en vervolgens Breng pH op 7,2 met 1 M NaOH. Regel het volume met ddH2O tot 100 mL en filter-steriliseren. 1-2 mL aliquots maken en opslaan bij-20 ° C.
Opmerking: Na het ontdooien, PEI kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal 2 weken maar niet opnieuw moet worden bevroren. - Cel cultuur supernatant met M-CSF of GM-CSF voor te bereiden. Deze supernatant kunnen worden van tevoren gemaakt en opgeslagen in-80 ° C. Om deze supernatant, groeien de cytokine-producerende cellen (J558 cellen voor GM-CSF 18 ) of CMG 14-12 cellen voor M-CSF 19in een 10 cm petrischaal in Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS) tot samenkomst. Breng alle cellen tot 200 mL voor media in T150 weefselkweek kolf en cultuur voor extra 4 dagen bij 5% CO237 ° C. Het verzamelen van de bovendrijvende substantie en filter over 0,2 µm sterilisatie filter. Maak aliquots en sla deze op-80 ° C.
- Bereiden van 100 mL cel kweekmedium: DMEM aangevuld met 10% geïnactiveerd FBS verhit en cel cultuur supernatant uit cellen afscheidende GM-CSF (voor differentiatie van de BMDC) of M-CSF (voor differentiatie van de BMDM).
Opmerking: Het bedrag van cytokinen in deze supernatant kan variëren en de concentratie van de werken moet empirisch vastgesteld. Meestal wordt 2-3% supernatant van cellijnen produceren GM-CSF (de aanbevolen beginconcentratie is 2%) of 5 – 10% supernatant van CMG 14 – 12 cellen produceren M-CSF (de aanbevolen beginconcentratie is 10%) gebruikt. Als alternatief gezuiverd commercieel beschikbare M-CB bij 10 ng/mL en GM-CSF bij 20 ng/mL kan worden gebruikt met resultaten vrijwel identiek aan cytokine-bevattende supernatant, dwz., zonder enig effect op het tempo van de differentiatie, infectie-efficiëntie en subcellular localisatie van EGFP-gelabeld constructies. Antibiotica, zoals penicilline G (100 IU/mL), streptomycine (100 µg/mL) en gentamicine (40 µg/mL), kunnen worden gebruikt voor de cultuur van de cel bij elke stap van het protocol tenzij anders vermeld.
2. productie van Retrovirus
Let op: Hoewel retrovirale vectoren relatief veilig in vergelijking met andere soorten virale vectoren zijn, vormen zij nog steeds een potentieel gevaar voor de veiligheid. Daarom is het cruciaal om te werken met de grootste zorg en de juiste beschermende uitrusting, en het voldoen aan alle veiligheidsvoorschriften en wettelijke vereisten voor het werken met virale deeltjes.
- Een eencellige suspensie van Platinum-Eco (Plat-E) verpakking cellen in een 10 cm petrischaal plaat en cultiveren in 15 mL DMEM met 10% FBS tot 50-60% heuvels (24 h). Cellen moeten moeten groeien in een enkelgelaagde en niet klontjes in cultuur.
- Pipetteer 20 µg voor retrovirale construct (bv., de uiting van de fluorescently tagged proteïne van belang in de pMSCV-vector construct) en 10 µg voor pCL-Eco-verpakking20 vector in 1 mL DMEM (zonder serum en antibiotica) en meng voorzichtig.
- Toevoegen aan een tweede buis, 75 µL van PEI in 1 mL DMEM (zonder serum en antibiotica). Incubeer 5 min bij kamertemperatuur (RT) en dan meng de inhoud van beide buizen en incubeer gedurende extra 10 min op RT.
Opmerking: Toevoeging van pCL-Eco is optioneel. Het is codering voor de virale ecotropic-receptor en de titer van het virus kan verhogen. - Zorgvuldig het medium op Plat-E cellen vervangen door 8 mL verse DMEMsupplemented met 2% FBS. Vooraf warm het medium tot 37 ° C vóór gebruik. Gebruik geen antibiotica tijdens de transfectie, omdat antibiotica kunnen de transfectie efficiëntie verminderen.
- Zorgvuldig het mengsel bereid in stap 2.3 op de Plat-E cellen (in druppels) toevoegen en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C.
- Na de incubatie, onderling ruilen het medium op Plat-E cellen voor 10 mL voorverwarmde DMEM bevattende 10 gewichtspercenten FBS, en cultiveer de cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C. Tijdens deze incubatie, zal Plat-E cellen virus produceren in de media.
- Na 24 h, het medium retrovirale deeltjes uit platina Eco cellen met behulp van een 5 mL-pipet met verzamelen en overbrengen naar een centrifuge-tube van 15 mL (= "supernatant 1" met ecotropic retrovirale deeltjes).
- Voorkom besmetting met Plat-E cellen in virale supernatant, draai de verzamelde virus bij 1250 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Voor de beste resultaten, het virus dient onmiddellijk voor infectie.
Opmerking: Aliquots van het virus kunnen ook worden opgeslagen bij-80 ° C voor later gebruik. Echter het zal leiden tot bepaalde vermindering in signaaltransductie efficiëntie. Vermijd repetitieve invriezen/ontdooien van het virus, omdat het leidt tot aantasting van het virus. - Voeg 10 mL voorverwarmde DMEM met 10% FBS naar Plat-E cellen en kweken voor een andere 24 uur bij 37 ° C.
- Herhaal stap 2.7. en 2.8. het verkrijgen van "supernatant 2".
3. lymfkliertest beenmerg cel isolatie
- De muis met de cervicale dislocatie of andere goedgekeurde methode offeren. Spray de muis met 70% ethanol.
- Pincet en schaar gebruikt, verwijder de huid evenals deel van spieren van achterpoten. Zorgvuldig het acetabulum van het heupgewricht te verjagen zonder verbreking van het dijbeen. Snijd de poot in het enkelgewricht. Spray de botten (femur verbonden met tibia) met 70% ethanol en verwijderen van de rest van de spieren met behulp van een papieren handdoek.
- Plaats de botten in een 5 cm petrischaal met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 2% FBS (PBS-FBS). Als voorbereiding meer botten, houden de petrischaal op ijs totdat verwerkt.
- Voor het beveiligen van teelt steriliteit, volgt alle in de kap van een weefselkweek.
- Het dijbeen van het scheenbeen scheiden zonder verbreking van de uiteinden van de botten (knik in de knie gezamenlijke en zorgvuldig gesneden met een schaar).
- De botten één voor één worden verwerkt. Een zeer klein deel van de epifyses (ongeveer 1-2 mm) met een schaar afgesneden terwijl het bot in pincet.
- Gebruik een naald 30 G en een 2 of 5 mL spuit gevuld met PBS-FBS te spoelen de beenmergcellen van beide uiteinden van het bot in een centrifugebuis 15 mL. Beweegt de naald in het bot tijdens het afboeken om het verwijderen van alle cellen. Als de naald wordt verstopt, wijzigen.
Opmerking: Bones moet wenden van rood naar wit spuien. Dit betekent dat de meerderheid van de cellen van het bot werden verwijderd. Gebruik ongeveer 2-3 mL PBS-FBS per been. - Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en lyse van de rode bloedcellen door het resuspending van de pellet in 2.5 mL ACK buffer gedurende 2-3 minuten bij kamertemperatuur. Tijdens de lysis, filtreer de beenmergcellen door een zeef 100 μm cel in een tube van vers 15 mL centrifug. De tonus herstellen door toevoeging van 12 mL PBS-FBS.
Opmerking: Niet meer dan 5 min van lysis van de hypotone met ACK buffer te vermijden celdood. - Centrifugeer onmiddellijk bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
4. het beenmerg celdifferentiatie in beenmerg afgeleid macrofagen
- Resuspendeer de pellet van beenmergcellen in DMEM aangevuld met 10% FBS en antibiotica (Zie de opmerking na stap 1.4. voor antibiotica concentratie) en de cellen tellen. Voor differentiatie in BM afgeleid macrofagen, plaat 5 – 10 x 106 van beenmergcellen in een 10 cm niet-Weefselkweek behandeld (bacteriële) petrischaal met 10 mL vooraf bereid DMEM media met serum en M-CSF van stap 1.4.
Opmerking: De opbrengst van de beenmergcellen is ongeveer 4 x 107 per 6-8 week-oude C57BL/6J-muis. - Incubeer de cellen in cel cultuur incubator gedurende 3 dagen bij 5% CO2, 37 ° C.
Opmerking: Tijdens de eerste 2 dagen, cellen zien er niet zeer vitaal belang, aangezien een groot aantal apoptotic cellen (cellen niet in staat om te differentiëren in myeloïde cellen en terminaal gedifferentieerde cellen) presenteren. - Na 3 dagen, de cultuur van de cel van het beenmerg begint te kijken vitale en clusters van delen van cellen worden gevormd. Eerste Adherente cellen is al waarneembaar. Een aanvulling op dit punt, de cellen met verse cytokine media.
- Voeg 10 mL van voorverwarmde DMEM media met serum en M-CSF (uit stap 1.4) in elk 10 cm petrischaal en terug te sturen in de cel cultuur incubator. Er is geen behoefte om te verwijderen van de oude media tijdens deze stap.
Opmerking: beenmerg macrofagen zijn volledig gedifferentieerde na 5 – 7 dagen in de cultuur. De beste tijd voor de oogst is op dag 6 – 8: waar de meerderheid van de cellen zijn aanhanger en de petrischaal wordt volledig gedekt. - Op dag 5, de petrischaal rekening met de cel cultuur kap en helling van de schotel tot de media is bijna het bereiken van de rand van de schotel. Zorgvuldig neem 15 mL van de media van het oppervlak in de buurt van de rand, en de cellen de neiging te blijven in het midden van de schotel. Voeg een gelijk volume voorverwarmde media met M-CSF en plaats de schotel terug in de incubator.
Opmerking: Als media is aanzuiging langzaam en zorgvuldig, zijn bijna geen cellen verloren. Het is echter ook mogelijk om de aanzuiging media centrifugeren en de cellen opnieuw toevoegen aan de cultuur, om ervoor te zorgen dat geen niet-aanhanger (dwz., onvolledig gedifferentieerde) cellen gaan verloren. - Voor experimenten, worden alleen Adherente cellen (macrofagen) gebruikt. Het verkrijgen van cellen, op dag 6 of 7, door alle media en zwevende cellen te verwijderen. Wassen van de schotel een keer met voorverwarmde PBS zonder serum.
- Voeg 5 mL EDTA 0.02% in PBS en incubeer gedurende 3-5 minuten bij 37 ° C in de weefselkweek incubator.
- Met behulp van een 5 mL-Pipet, de cellen verwijderen uit de schotel door een stroom van PBS-EDTA en plaats ze in een centrifugebuis 50 mL met 25 mL PBS. Indien nodig, meer gerechten samen te bundelen.
- Centrifugeer onmiddellijk bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer de pellet macrophage in DMEM media en cellen tellen. Controleer of u de expressie van macrofaag oppervlakte differentiatie markers (CD11b en F4/80) door stroom cytometry.
- Voor experimenten waarbij de cellen die moeten worden in suspensie, bv., stroom cytometry experimenten, qPCR of westelijke vlekkenanalyse, rechtstreeks gebruik van de macrofagen. Plaat voor experimenten met aanhangend macrofagen, de cellen in de weefselkweek plaat volgens de experimentele opzet.
- De cellen worden reeds volledig onderscheiden. Houd ze in de media die geschikt zijn voor het beoogde experiment of in de originele media van de groei en differentiatie met M-CSF.
Opmerking: Voor het werken met aanhangend macrofagen, ze vervolgens overbrengen naar een nieuwe plaat ten minste 6 uur vóór gebruik (idealiter 's nachts) met het oog op de volledige hechting aan de nieuwe oppervlakte. De kleine fractie van zwevende cellen kan worden verwijderd voordat het experiment.
5. beenmerg celdifferentiatie in beenmerg-afgeleide dendritische cellen
- Volg het protocol voor BMDMs met specifieke aanpassingen voor BMDCs in stappen 5.2-5.4 hieronder beschreven.
- Resuspendeer de verkregen pellet van beenmergcellen in DMEMsupplemented met 10% FBS en antibiotica en tellen van de cellen (door volgende stap 4.1 van macrofaag-protocol). Voor differentiatie in dendritische cellen behandeld plaat 1 – 1,5 x 107 beenmergcellen in een 10 cm niet-weefselkweek (bacteriële) petrischaal in 10 mL vooraf bereid DMEM media met serum en GM-CSF (uit stap 1.4.).
- Dezelfde teelt stappen zoals in BMDM protocol (stappen 4.3 – 4.5. van macrofaag-protocol). DMEM media gebruiken met serum en GM-CSF in plaats van de M-CSF. Omdat voor BMDCs de teeltduur langer is (meestal 10-12 dagen), 1-2 extra voedingen toevoegen in 3 dagen (door de bovendrijvende vloeistof verwijderen en toevoegen van een nieuwe teelt media zoals beschreven in stap 4.5.).
- Dit deel van het protocol is vrijwel hetzelfde als het desbetreffende deel van de macrofaag-protocol (stappen 4.6-4.12. van macrofaag-protocol). Gebruik alleen Adherente cellen voor experimenten. Op dag 10-12, verzamelen de cellen met behulp van EDTA, tellen en ze op een nieuwe ondergrond plaat. Controleer of de expressie van oppervlakte differentiatie markers van dendritische cellen (CD11c +, CD11b +, F4/80-) door stroom cytometry.
6. de productie van BMDMs en BMDCs uiten van EGFP-gelabeld proteïne van belang
- Resuspendeer de pellet van beenmergcellen verkregen in stap 3.10. in DMEM aangevuld met 10% FBS en antibiotica en de cellen tellen. Gebruik voor de infectie, 2 – 5 x 106 van BM cellen per putje van een 6-well Weefselkweek behandeld plaat.
- Plaat de cellen in 1 mL van de voorbereide DMEM media per goed, aangevuld met M-CSF voor differentiatie in BMDMs of GM-CSF voor differentiatie in BMDCs. Houd de cellen gedurende 4-6 uur in een incubator weefselkweek met 5% CO2 bij 37 ° C.
- Voeg toe 2 mL vers verzameld is virus ("supernatant 1") aangevuld met polybrene (12 µg/mL, eindconcentratie 8 µg/mL na toevoeging aan de cellen).
Opmerking: Bevroren aliquoot deel van het supernatans dat virus-bevattende kan ook worden gebruikt, maar de werkzaamheid lager zal zijn. - Centrifugeer de plaat bij 1250 x g gedurende 90 min bij 30 ° C (met langzame acceleratie en vertraging). Vervolgens, Incubeer gedurende 4 uur met 5% CO2 bij 37 ° C.
- Optioneel: Het vervangen van 2 mL van de cultuur-media met verse medium met respectieve cytokine (M-CSF of GM-CSF) en cultuur met 5% CO2 bij 37 ° C. Op de tweede dag, verwijderen van 2 mL van cultuurmedia en herhaal de hele infectie procedure (stap 6.3-6.4) met 2 mL vers verzameld is virus ("supernatant 2").
Opmerking: Deze stap kan verhogen infectie werkzaamheid. Verbetering na de tweede infectie afhankelijk van de cel type en doel-eiwit en in onze ervaring is kan variëren van 30% toename in efficiëntie tot geen verbetering op alle. - Verzamel de niet-aanhanger cellen, overbrengen in een centrifugebuis 15 mL, en spin bij 500 x g gedurende 5 min (4 ° C). Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet cel in 10 mL voedingsbodems met M-CSF of GM-CSF, plaatst u de cellen in een 10 cm niet-Weefselkweek behandeld petrischaal en cultuur bij 37 ° C, 5% CO2. Optimale aantal cellen voor een 10 cm schotel is 5-10 x 106 voor BM afkomstige macrofagen en 10-15 x 106 voor BM-afgeleide dendritische cel.
Opmerking: Kleinere gerechten of platen kunnen worden gebruikt, maar cel nummers moeten dienovereenkomstig worden aangepast. - Volg de macrofaag en dendritische cel teelt en differentiatie protocol beschreven in stap 4 en 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Signalering adaptor eiwitten zijn meestal kleine eiwitten zonder een enzymatische activiteit. Ze bezitten verschillende interactie domeinen of motieven, die binding met andere eiwitten bemiddelen die betrokken zijn bij signaaltransductie, met inbegrip van tyrosine kinases, fosfatasen genaamd, ubiquitin ligases e.a.21. Voor de demonstratie van de functionaliteit van dit protocol werden myeloïde cel adapters PSTPIP2 en OPAL1 geselecteerd. PSTPIP2 is een goed gekarakteriseerd eiwit die betrokken zijn bij de regulering van de ontstekingsreactie22. Het is een cytoplasmatische eiwit die ook kan worden aangeworven om de cellulaire membranen via het domein F-bar. Tweede eiwit is een transmembraan adapter OPAL1, moeten gepaard gaan met de cellulaire membranen. De fysiologische functie is nog onbekend. Echter in acute lymfatische leukemie is uitdrukking van OPAL1 geassocieerd met betere prognose23.
cDNA construeert codering voor PSTPIP2 of OPAL1 via een korte linker gesmolten (GSGGGS of Myc-tag, respectievelijk) om te van EGFP in het C-terminus werden gekloond in de pMSCV retrovirale vector met standaardmethoden van cDNA klonen. Deze constructie werd vervolgens transfected in Plat-E cellen samen met de verpakking vector pCL-Eco. De resulterende supernatant met retrovirussen werden gebruikt voor de signaaltransductie van cellen in het beenmerg, gevolgd door de differentiatie in BMDMs en BMDCs. De werkzaamheid van Plat-E transfectie was na de collectie van het tweede virus-bevattende supernatant door stroom cytometry geëvalueerd. Gemiddelde transfectie efficiëntie was 62% voor PSTPIP2-EGFP en 53% voor OPAL1 en de resultaten zeer reproduceerbaar (figuur 1A, B waren). OPAL1 construct leek meer toxisch voor Plat-E cellen (beoordeeld door de verschijning van drijvende/sterven cellen in cultuur), wat resulteert in een vermindering van de percentages van transfected cellen.
De status van de differentiatie van het beenmerg afgeleid macrofagen en dendritische cellen (getransduceerde met PSTPIP2-EGFP en OPAL1-EGFP retrovirale constructies) werd beoordeeld door stroom cytometry. Macrophage van de volwassen bevolking wordt gedefinieerd door CD11b en F4/80 expressie, terwijl dendritische cellen express de CD11c afstamming markering. Meer dan 90% van de cellen in beide soorten cultuur waren positief voor hun respectieve markeringen (figuur 2A, B). Tot slot, wij vastbesloten dat het niveau van de expressie van EGFP-PSTPIP2 en OPAL1-EGFP construeert in BMDMs en BMDCs door een eenvoudige stroom cytometry meting van EGFP fluorescentie. Het gemiddelde percentage van EGFP-positieve macrofagen was 71% voor PSTPIP2-EGFP en 62% voor OPAL1-EGFP (figuur 3A). In het geval van dendritische cellen, was het rendement lager, 32% voor PSTPIP2 en 9% voor OPAL1 (figuur 3B). De resultaten van meerdere experimenten tonen aan dat de reproduceerbaarheid van deze methode (Figuur 3 c).
We bepalen de concentratie van het virus in het supernatant die we in infecties gebruiken meestal niet. We geven de voorkeur aan het virus supernatant vers, onmiddellijk na het verzamelen, terwijl de vaststelling van de titer virus drie extra dagen vereist. Dientengevolge, de informatie over virus titer kan alleen worden verkregen achteraf. Echter, het kan nog steeds zijn nuttig bij het opstellen van technische vraagstukken en problemen. Om te beoordelen van de concentratie van het virus in supernatant van Plat E transfected cellen met PSTPIP2-EGFP en OPAL1-EGFP construeert, we geïncubeerd NIH-3T3 cellen met serieel verdunde virus-bevattende supernatant verzameld uit deze transfected cellen Plat-E en virus titer precies zoals beschreven door Zjablovskaja et al. in eerder gepubliceerde JoVE artikel24bepaald. In drie onafhankelijke experimenten, het virus-titer varieerde van 1.1 x 106 tot en met 4.4 x 106 TU/mL. Wij deden niet eventuele aanzienlijke verschillen tussen PSTPIP1-EGFP en OPAL1-EGFP constructies en tussen supernatant vanaf dag 1 en dag 2 observeren. Toen deze supernatant werden gebruikt voor het beenmerg cel infecties volgens het protocol dat we in dit artikel, de veelheid van infectie (MOI beschrijven) varieerde van 1.1 tot 4.4. Interessant is dat binnen dit bereik, deed niet zien we geen correlatie tussen de MOI en infectie efficiëntie.
In Figuur 4, werden PSTPIP2-EGFP en OPAL1-EGFP uitgedrukt in BMDMs en BMDCs gevisualiseerd door confocale microscopie. Volledig gedifferentieerde macrofagen en dendritische cellen hebben een karakteristieke vorm. De verandering in de morfologie van kleine afgeronde voorlopercellen aan de grote cellen van onregelmatige vormen bevestigt succesvolle differentiatie. In macrofagen was PSTPIP2 cytoplasmatische met gedeeltelijke localisatie op het plasma-membraan. OPAL1 leek te worden ook deels gericht op het plasma-membraan. De rest werd waarschijnlijk geassocieerd met intracellulaire membranen, zoals het endoplasmatisch reticulum en het Golgi-complex. Echter, om te bevestigen deze lokalisatie, specifieke organel markeringen zou moeten worden gebruikt. In dendritische cellen was de lokalisatie van het membraan minder duidelijk.
Figuur 1: rendement van Plat-E cel transfectie. Voor transfectie van Plat-E cellen, werden twee constructies coderen adaptor eiwitten, PSTPIP2 en OPAL1 gefuseerd met EGFP (PSTPIP2-EGFP en OPAL1-EGFP) gekloond in de vector pMSCV. Standaard PEI transfectie werd uitgevoerd. De werkzaamheid van transfectie werd beoordeeld door stroom cytometry van de Plat-E cellen na de collectie van het supernatans dat tweede virale. (A). representatieve stroom cytometry plot. (B). grafiek weergegeven: resultaten van vier onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: beoordeling van de toestand van de differentiatie van BMDMs (A) en BMDCs (B). Oppervlakte expressie van specifieke macrophage en dendritische cel lineage markers werd gemeten door stroom cytometry op dag 8 van de teelt. Dode cellen werden omheinde uit op basis van hun kant en voorwaartse scatter eigenschappen en kleuring met Hoechst 33258. De resultaten zijn representatief voor ten minste 3 onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: beoordeling van de expressie van EGFP-PSTPIP2 en OPAL1-EGFP. Fluorescentie van EGFP in BMDMs (A) en BMDCs (B) retrovirally getransduceerde met PSTPIP2-EGFP en OPAL1-EGFP constructies werd gemeten door stroom cytometry op dag 8 van de teelt. (C) . Grafiek die de resultaten van meerdere onafhankelijke experimenten. BMDMs en BMDCs werden omheinde zoals in Figuur 2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: representatieve beelden van macrofagen en dendritische cellen, uiting van PSTPIP2 of -OPAL1. BMDMs (A) en BMDCs (B) uiten van PSTPIP2 en OPAL1 werden gevisualiseerd door levende imaging confocale microscopie. EGFP fluorescentie in groen wordt weergegeven aan de linkerzijde van elk paneel, helder veld afbeelding aan de rechterkant. Schaal bar = 10 µm. De resultaten zijn representatief voor ten minste drie onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De uitdrukking van de proteïne van belang in de doelcellen is een belangrijke stap in vele soorten biologische studies. Gedifferentieerde macrofagen en dendritische cellen zijn moeilijk te transfect door standaard transfectie en retrovirale transductie technieken. Het omzeilen van de transfectie van deze gedifferentieerde cellen met retrovirale transductie van beenmerg progenitorcellen, gevolgd door differentiatie wanneer ze al de gewenste constructie dragen, is een cruciale stap waardoor de expressie van ectopische cDNAs in deze celtypes. Een voorbeeld van de succesvolle toepassing van deze methode kan worden gevonden in onze recente publicatie25. Hier, bieden wij een kosteneffectieve protocol voor het bereiken van stabiele uitdrukking van de constructie van keuze in beenmerg-afgeleide dendritische cellen en macrofagen met behulp van deze aanpak. De procedure die wij presenteren is relatief goedkoop en eenvoudige, nog zeer goede resultaten. In dit protocol gebruikte reagentia zorgen voor haar routine gebruik zelfs onder een relatief restrictieve begroting. Het protocol voor Plat-E transfectie maakt gebruik van PEI als een transfectiereagens. Vergeleken met andere chemische transfectie agenten, PEI is van een zeer lage kostprijs, terwijl de doeltreffendheid ervan is vergelijkbaar met de meerderheid van de andere gebruikte verbindingen. PEI kan echter worden vervangen door vele verschillende verkrijgbare transfectie reagentia in deze stap zonder verlies van efficiëntie. Als leidend beginsel presteren protocollen van de transfectie bekend dat ze werken met veelgebruikte HEK293 cellen meestal goed met Plat-E cellen, ook. Een ander kosteneffectieve maatregel is het gebruik van cytokine-bevattende supernatant in plaats van gezuiverde recombinante cytokines. Het gebruik van deze supernatant vereist wat optimalisatie. Toen het standaardprotocol voor hun voorbereiding is opgericht en volgde, wordt de variabiliteit tussen de afzonderlijke batches van deze supernatant echter zeer laag is, meestal die vereisen geen veranderingen in de concentraties van de afzonderlijke partijen werken. De efficiëntie van BMDM en BMDC differentiatie met deze supernatant zijn in onze ervaring, identiek aan de gezuiverde cytokines.
Naast retrovirale signaaltransductie bestaan andere gevestigde methoden van zoogdiercellen transfectie, zoals chemische transfectie (meestal met behulp van kationische lipiden of kationogene polymeren vormen complexen met DNA), electroporation en het gebruik van andere soorten virale vectoren, voornamelijk adenovirale en lentivirale systemen26,27,28,29,30. Hoewel zeer hoge titers en efficiëntie kunnen worden bereikt met gene adenovirus gebaseerde levering, de voorbereiding van de overeenkomstige plasmiden en virale deeltjes moeilijker en tijdrovender dan in het geval van retrovirale systemen29 zijn. Bovendien, lokt adenovirus inflammatoire respons in de dendritische cellen en macrofagen29,31,32 en voor optimale prestaties bij lymfkliertest hematopoietische cellen muis stam transgene adenovirus receptor is vereist33. Aan de andere kant, is de generatie van lentivirale deeltjes die het gen van belang een relatief eenvoudig proces, vrijwel identiek aan degene die zijn gebruikt voor retrovirussen. In tegenstelling tot de ecotropic, gebruikt in dit protocol retrovirale vectoren, zijn lentivirussen geschikt voor niet-prolifererende cellen van meerdere soorten, waaronder de mens34infecteren. Dit is een belangrijk voordeel onder specifieke proefomstandigheden. Echter, deze functie ook sterk in het gedrang brengt de veiligheid van deze vectoren. Naar onze mening, voor gene levering aan BMDMs en BMDCs, bieden retrovirussen de beste balans van efficiëntie, veiligheid en gebruiksgemak. Retrovirale DNA constructies kunnen gemakkelijk worden voorbereid met eenvoudige moleculaire klonen standaardtechnieken. Virus wordt geproduceerd door de cel verpakkingslijnen rechtstreeks naar de cultuur supernatant en verdere virus zuivering is meestal niet nodig. Ecotropic retrovirussen ook infecteren gemakkelijk geen menselijke cellen, waardoor het gebruik ervan relatief veilig. Er zijn echter ook enkele algemene nadelen verbonden aan het gebruik van retrovirale vectoren. De belangrijke beperkende factor is dat deze virussen infecteren alleen35prolifererende cellen. Deze functie heeft geen aanzienlijk invloed op het protocol beschreven hier, maar het verkleint u het bereik van toepassingen waar retrovirale vectoren kunnen worden gebruikt. De grootte van het gen van belang dat in deze vectoren kan worden gekloond is ook beperkt en de virale deeltjes titer daalt met invoegen te vergroten. Met pMSCV vectoren beginnen we meestal te zien van de effecten van de grootte van de invoegen bij ongeveer 3 kbp. Met verdere stijgingen van de grootte van de invoegen daalt de efficiëntie van de infectie geleidelijk.
De chemische transfectie en electroporation zijn gemakkelijker te gebruiken, veiliger en minder tijdrovend dan het virus gebaseerde procedures26,27,28,30. Echter in BMDMs en BMDCs, ze kunnen het stimuleren van reacties op buitenlandse nucleïnezuren31 en ze genereren meer cellulaire stress. Bovendien, sommige chemische transfectie reagentia verhogen cel auto-fluorescentie die stroom cytometry kan belemmeren of microscopie analyseert. Vanwege de voorbijgaande aard van meningsuiting, kunnen ze alleen worden gebruikt met volwassen gedifferentieerde BMDMs of BMDCs. In tegenstelling, de sequenties die zijn geïntroduceerd met de retrovirale vectoren permanent zijn geïntegreerd in het genoom van de doelcellen en zorgen voor een stabiele langdurige expressie compatibel met de tijdschaal van de differentiatie protocollen34, 35. echter deze functie verhoogt ook het risico dat mutagenese. Vanwege de relatief willekeurige aard van de integratie van de vector zijn de gevolgen ervan voor grote populaties van cellen beperkt. Zij kunnen evenwel zichtbaar op het niveau van afzonderlijke cellen. Bijkomende problemen kunnen zich voordoen wanneer een construct uitgedrukt uit de retrovirale vector beïnvloedt dendritische cel of macrofaag differentiatie, resulterend in mislukking voor het genereren van BMDMs of BMDCs van de besmette progenitoren onderscheiden. Tot op zekere hoogte kan dit worden overwonnen door de voorwaarden van de infectie tot lage expressie niveaus aan te passen (bv., door vermindering van de virus-titer) of door het gebruik van een afleidbare expressie systeem. Het gebruik van EGFP gesmolten aan de proteïne van belang of als een verslaggever ook zorgt voor het sorteren van cellen met expressie niveau dat beantwoordt aan de doelstellingen van het experiment en beperkingen. Ten slotte moeten we ook vermelden problemen gemeenschappelijk zijn voor alle transfectie/transductie procedures. Het gaat hierbij om voornamelijk overexpressie artefacten, zoals misfolding, mislocalization en toxiciteit36eiwit. Eiwit toxiciteit zou de reden waarom OPAL1 zich relatief moeilijk uitspreken. Dit voorbeeld illustreert duidelijk dat de aard van de uitgesproken proteïne kan aanzienlijk invloed hebben op de effectiviteit van deze methode. Echter, ondanks dit konden we verkrijgen van voldoende hoeveelheden van OPAL1-EGFP cellen microscopie p.a. uitdrukken met deze methode, aan te tonen het nut ervan, zelfs wanneer het behandelen van moeilijke doelstellingen. Daarnaast is het mogelijk om de percentages van getransduceerde cellen door FACS sorteren indien nodig door een bepaalde toepassing. De efficiëntie van de lage infectie kan ook gedeeltelijk worden verholpen door de toenemende concentratie van de virale deeltjes met behulp van verschillende methoden of kant-en-klare kits. In onze handen, heeft ultrafiltratie van het virale supernatant op centrifugaal filters met een moleculair gewicht van cut off van 100 kDa bewezen te bieden het beste evenwicht tussen efficiëntie en vereiste inspanning.
Het beenmerg afgeleid macrofagen en dendritische cellen zijn veel gebruikte instrumenten in fagocytensysteem immunologie. Ze zijn meer fysiologisch relevant dan beschikbare cellijnen. Ze kunnen worden gegenereerd in relatief hoge aantallen en, tegelijkertijd, het ontbreken van het genetische heterogeniteit en instabiliteit kenmerk van cellijnen. Een ander voordeel is dat ze kunnen worden gegenereerd op basis van genetisch gemodificeerde muizen aan het bestuderen van de effecten van genetische modificatie op een relatief rijk en homogene celpopulatie. Dit is vooral nuttig in biochemische studies, waar relatief grote hoeveelheden cellen zijn meestal vereist. De mogelijkheid om de transduce van deze cellen met cDNA constructies opent extra mogelijkheden van het onderzoek op basis van de reconstitutie of complementatie van genetische afwijkingen in deze cellen en de analyse van de structuur-functie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door Tsjechische Science Foundation (GACR) (projectnummer 16-07425S), door Charles Universiteit Grant Agentschap (GAUK) (projectnummer 923116) en door de institutionele financiering van het Instituut voor moleculaire genetica, Academie van Wetenschappen van de Tsjechische Republiek (RVO 68378050).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | For media suplementation |
| KHCO3 | Lachema, Brno, Czech Republic | N/A | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | A9434 | |
| Penicillin | BB Pharma AS, Prague, Czech Republic | N/A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic | N/A | |
| Polyethylenimine, linear, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| PBS | Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic | N/A | |
| APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 101212 | flow cytometry analysis |
| PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 123110 | flow cytometry analysis |
| APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 117310 | flow cytometry analysis |
| M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-02 | |
| GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-03 | |
| Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | H1398 | flow cytometry analysis use at 1-2 µg/mL |
References
- Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
- Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
- Kondo, M. Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors. Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).
- Andrews, T., Sullivan, K. E. Infections in patients with inherited defects in phagocytic function. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
- Scheicher, C., et al. Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow. Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).
- Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot5080 (2008).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Remington, S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).
- Hoffman, R. M. Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).
- Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G.
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).
- Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen. Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Janssen, E., Zhang, W.
- Ferguson, P. J., Laxer, R. M. New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice. Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).
- Holleman, A., et al. Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols. Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).
- Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).
- Kralova, J., et al. The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).
- Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).
- Siegert, I., et al. Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells. Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
- Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).
- Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
- Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).
- Tallone, T., et al. A mouse model for adenovirus gene delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).
- Milone, M. C., O'Doherty, U.
- McTaggart, S., Al-Rubeai, M. Retroviral vectors for human gene delivery. Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A.
