Summary
I denna artikel ger vi ett detaljerat protokoll för uttrycket av fluorescerande fusionsproteinerna i murina benmärgen härrör dendritiska celler och makrofager. Metoden är baserad på transduktion av benmärg föräldraparets med retrovirala konstruktioner följt av differentiering till makrofager och dendritiska celler in vitro.
Abstract
Dendritiska celler och makrofager är avgörande celler som bildar den första försvarslinjen mot patogener. De kan också spela viktiga roller i inledandet av ett adaptivt immunsvar. Experimentellt arbete med dessa celler är ganska utmanande. Deras överflöd i organ och vävnader är relativt låg. Som ett resultat, kan inte de isoleras i stort antal. De är också svårt att transfect med cDNA konstruktioner. I murina modellen, kan dessa problem delvis övervinnas genom in vitro- differentiering från benmärgen stamfäder i närvaro av M-CSF för makrofager eller GM-CSF för dendritiska celler. På detta sätt är det möjligt att få stora mängder av dessa celler från mycket få djur. Dessutom kan benmärgen föräldraparets vara sensorik med retrovirala vektorer bära cDNA konstruktioner under tidiga stadier av odling före deras differentiering till benmärgen härrör dendritiska celler och makrofager. Retrovirala transduktion följt av differentiering in vitro- kan således användas för att uttrycka olika cDNA konstruktioner i dessa celler. Förmågan att uttrycka ektopisk proteiner avsevärt utökar räckvidden för experiment som kan utföras på dessa celler, inklusive levande cell avbildning av fluorescerande proteiner, tandem reningar för interactome analyser, struktur och funktion analyser, övervakning av cellulära funktioner med biosensorer och många andra. I den här artikeln beskriver vi ett detaljerat protokoll för retrovirala transduktion murina benmärgen härrör dendritiska celler och makrofager med vektorer som kodar för proteiner som fluorescently-taggade. Exemplet med två adapter proteiner, OPAL1 och PSTPIP2, bevisa vi dess praktiska tillämpning i flödescytometri och mikroskopi. Vi diskuterar också fördelarna och begränsningarna med denna metod.
Introduction
Myeloida celler utgör en oumbärlig del av vår försvarsmekanismer mot patogener. De har möjlighet att snabbt eliminera mikrober, liksom döende celler. Dessutom, är de också involverade i regleringen av vävnad utveckling och reparation och att upprätthålla homeostas1,2,3. Alla myeloida celler skilja från vanliga myeloida i benmärgen. Deras differentiering till många funktionellt och morfologiskt skilda grupper är i stor utsträckning kontrolleras av cytokiner och deras olika kombinationer4. Mest intensivt studerade myeloida cell delmängder inkluderar neutrofila granulocyter, makrofager och dendritiska celler. Defekter i någon av dessa populationer leda till potentiellt livshotande konsekvenser och orsaka svår dysfunktioner av immunsystemet hos människor och möss1,2,3,5, 6.
Till skillnad från neutrofila granulocyter, dendritiska celler och makrofager är vävnad bosatt celler och deras överflöd i immun organ är relativt låg. Som ett resultat, är isolering och rening av primära dendritiska celler och makrofager för experiment som kräver ett stort antal av dessa celler dyra och ofta omöjligt. För att lösa problemet, har protokoll utvecklats för att få stora mängder homogen makrofager och dendritiska celler in vitro. Dessa metoder är baserade på differentieringen av murina benmärgsceller i närvaro av cytokiner: makrofag granulocytkolonistimulerande faktor (M-CSF) för makrofager och granulocyt-makrofag granulocytkolonistimulerande faktor (GM-CSF) eller Flt3 ligand för dendritiska celler7,8,9,10,11,12. Celler som genereras av denna metod beskrivs ofta i litteraturen som benmärg härrör makrofager (BMDMs) och benmärg härrör dendritiska celler (BMDCs). De har mer fysiologiska egenskaper gemensamt med primära makrofager och dendritiska celler än med motsvarande cell linjer. En annan stor fördel är möjligheten att få dessa celler bildar genetiskt modifierade möss13. Jämförande studier mellan vildtyps-celler och celler som härrör från genetiskt modifierade möss är ofta avgörande för avslöjande roman funktioner av gener eller proteiner av intresse.
Analysen av subcellulär lokalisering av proteiner i levande celler kräver kopplingen av en fluorescerande etikett till proteinet av intresse i vivo. Detta uppnås vanligen genom att uttrycka genetiskt kodade fusion konstruktion består av en analyserade protein tillsammans (ofta via en kort länkare) till ett fluorescerande protein (t.ex., grönt fluorescerande protein (GFP))14,15 , 16. uttrycket av fluorescently märkta proteiner i dendritiska celler eller makrofager är utmanande. Dessa celler är generellt svåra att transfect av standard transfection förfaranden och effektivitetsvinsterna tenderar att vara mycket låg. Dessutom transfection är övergående, det genererar cellulär stress och uppnådda intensiteten av fluorescens kan inte räcka för mikroskopi17. För att få en rimlig andel av dessa celler med en tillräcklig nivå av transgenens uttryck, infektionen av benmärg stamceller med retrovirala har vektorer och deras efterföljande differentiering till BMDMs eller BMDCs blivit en mycket effektiv tillvägagångssätt. Det är tillåtet för analys av proteinerna av myeloisk ursprung i deras infödda cellulära miljön, både i ett stabilt tillstånd eller under processer som är kritiska för immunsvar som fagocytos, immunologisk synaps bildandet eller migration. Här beskriver vi ett protokoll som tillåter stabil uttrycket av fluorescently märkta proteiner intresset murina benmärgen härrör makrofager och dendritiska celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av utskottet Expert om välfärd av experimentella djur av Institutet för molekylär genetik och av Vetenskapsakademien i Tjeckien.
1. REAGENSBEREDNING
- Förbereda ammonium-klorid-kalium (ACK) bufferten. Tillsätt 4.145 g NH4Cl och 0,5 g KHCO3 till 500 mL ddH2O, sedan Tillsätt 100 µL 0,5 M etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) och filter-sterilisera.
- Bered polyethylenimine (PEI). Tillsätt 0,1 g av PEI till 90 mL ddH2O. Lägg till 1 M HCl droppvis under omrörning, tills pH är lägre än 2.0. Rör för upp till 3 h tills PEI är upplöst och justera pH-värdet till 7,2 med 1 M NaOH. Justera volymen till 100 mL med ddH2O och filter-sterilisera. Gör 1 – 2 mL alikvoter och förvaras vid-20 ° C.
Obs: Efter upptining, PEI kan lagras vid 4 ° C i upp till 2 veckor men bör inte frysas igen. - Förbereda cell cellkulturer som innehåller M-CSF eller GM-CSF. Dessa supernatanterna kan göras i förväg och förvaras i-80 ° C. För att göra dessa supernatanterna, växa cytokin-producerande cellerna (J558 celler för GM-CSF 18 ) eller CMG 14-12 celler för M-CSF 19i en 10 cm petriskål i Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS) till sammanflödet. Sedan överföra alla celler till 200 mL för media i T150 vävnadsodling kolv och kultur under ytterligare 4 dagar vid 5% CO237 ° C. Samla in supernatanten och filter över 0,2 µm sterilisering filter. Gör alikvoter och lagra dessa vid-80 ° C.
- Bereda 100 mL cellodlingsmedium: DMEM kompletteras med 10% värme inaktiverade FBS och cell cellkulturer från celler som utsöndrar GM-CSF (för BMDC differentiering) eller M-CSF (för BMDM differentiering).
Obs: Mängden cytokiner i dessa supernatanterna kan variera och arbetande koncentrationen har bestäms empiriskt. Normalt är som 2 – 3% supernatanten från cellinjer som producerar GM-CSF (Rekommenderad start koncentrationen är 2%) eller 5 – 10% supernatanten från CMG 14 – 12 celler som producerar M-CSF (Rekommenderad start koncentrationen är 10%) används. Alternativt, renat kommersiellt tillgängliga M-CSF vid 10 ng/mL och GM-CSF vid 20 ng/mL kan användas med resultat nästan identisk med cytokin-innehållande supernatanterna, dvs., utan någon effekt på andelen av differentiering, infektion effektivitet och subcellulär lokalisering av andra-märkta konstruktioner. Antibiotika, inklusive penicillin G (100 IE/mL), streptomycin (100 µg/mL) och gentamicin (40 µg/mL), kan användas för cellodling vid varje steg i protokollet om inget annat anges.
2. produktion av Retrovirus
Varning: Även om retrovirala vektorer är relativt säker när jämfört med andra typer av virala vektorer, de fortfarande utgör en potentiell säkerhetsrisk. Därför är det viktigt att arbeta med största omsorg och lämplig skyddsutrustning, och att följa alla säkerhetsföreskrifter och rättsliga krav för att arbeta med viruspartiklar.
- Plåt en enda cellsuspension av Platinum-Eco (Plat-E) förpackning celler i en 10 cm petriskål och odla i 15 mL DMEM innehållande 10% FBS fram till 50-60% konfluenta (24 h). Cellerna bör växa i en enskiktslager och bör inte bildar klumpar i kultur.
- Pipett 20 µg retrovirala konstruktion (t.ex., den konstruktion som uttrycker fluorescently märkta proteinet av intresset för pMSCV vector) och 10 µg av pCL-Eco förpackning vektor20 in 1 mL DMEM (utan serum och antibiotika) och blanda försiktigt.
- Till ett andra rör, tillsätt 75 µL av PEI i 1 mL DMEM (utan serum och antibiotika). Inkubera i 5 minuter i rumstemperatur (RT) och sedan blanda innehållet i båda rören och inkubera i ytterligare 10 min vid RT.
Obs: Tillägg av pCL-Eco är valfritt. Det är kodning för ecotropic viral receptorn och kan öka virus titern. - Försiktigt ersätta mediet på Plat-E celler med 8 mL färsk DMEMsupplemented med 2% FBS. Pre varma medellång till 37 ° C före användning. Använd inte antibiotika under transfection, eftersom antibiotika kan minska transfection effektivitet.
- Försiktigt lägga (i droppar) blandningen beredd i steg 2.3 på Plat-E cellerna och inkubera i 4 timmar vid 37 ° C.
- Efter inkubering, utbyta mediet på Plat-E celler för 10 mL före värmde DMEM innehållande 10% FBS, och odla cellerna för 24 timmar vid 37 ° C. Under denna inkubation producerar Plat-E celler virus i media.
- Efter 24 h, samla in mediet som innehåller retrovirala partiklar från Platinum Eco celler med 5 mL pipett och överföra den till en 15 mL centrifugrör (= ”supernatanten 1” som innehåller ecotropic retrovirala partiklar).
- För att undvika kontaminering av Plat-E celler i viral supernatanterna, snurra insamlade viruset på 1250 × g i 5 minuter vid 4 ° C. För bästa resultat användas viruset omedelbart för infektion.
Obs: Alikvoter av virus kan också lagras vid-80 ° C för senare användning. Men kommer att det resultera i vissa minskning transduktion effektivitet. Undvik upprepad frysning/upptining av viruset, eftersom det leder till virus nedbrytning. - Tillsätt 10 mL av pre värmde DMEM med 10% FBS till Plat-E celler och odla för en annan 24 h vid 37 ° C.
- Upprepa steg 2,7. och 2,8. Skaffa ”supernatant 2”.
3. murina benmärgen Cell isolering
- Offra musen med cervikal dislokation eller annan godkänd metod. Spray musen med 70% etanol.
- Loss med sax och pincett såväl hud som en del av muskler från bakbenen. Noggrant få bort acetabulum från höftleden utan att bryta lårbenet. Skär tassen i fotleden. Spray ben (femur ansluten till tibia) med 70% etanol och ta bort resten av musklerna med en pappershandduk.
- Placera benen i en 5 cm petriskål som innehåller steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 2% FBS (PBS-FBS). Om förbereder mer ben, hålla petriskål på is tills bearbetas.
- För att säkra odling sterilitet, utför alla följande steg i vävnadsodling huva.
- Separata lårbenet från skenbenet utan att bryta benändarna (krök i knäet gemensamma och försiktigt klippa med sax).
- Behandla benen en efter en. Klipp av en mycket liten del av epifyser (cirka 1 – 2 mm) med sax medan du håller benet i pincett.
- Använda en 30 G nål och en 2 eller 5 mL spruta fylld med PBS-FBS att spola benmärgscellerna från båda ändarna av benet i en 15 mL centrifugrör. Flytta nålen inuti benet under rodnader för att ta bort alla celler. Om nålen blir igensatt, ändra den.
Obs: Ben ska vända från rött till vitt under spolning. Detta tyder på att majoriteten av cellerna togs bort från benet. Använd ca 2 – 3 mL PBS-FBS per ben. - Centrifugera cellerna vid 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och lysera röda blodkroppar genom omblandning pelleten i 2,5 mL ACK buffert för 2 – 3 min i rumstemperatur. Under Lys, filtrera benmärgscellerna genom en sil med 100 μm i cellen till en färsk 15 mL centrifug tub. Återställa tonicity genom att lägga till 12 mL PBS-FBS.
Obs: Inte överstiger 5 minuter av hypoton lysis med ACK buffert att undvika celldöd. - Centrifugera omedelbart 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
4. benmärgen celldifferentiering till benmärgen härrör makrofager
- Återsuspendera pelleten av benmärgsceller DMEM kompletteras med 10% FBS och antibiotika (se anmärkning efter steg 1.4. för antibiotikakoncentrationen) och räkna cellerna. För differentiering till BM härrör makrofager, platta 5 – 10 x 106 av benmärgsceller i en 10 cm icke-vävnadskultur behandlas (bakteriell) petriskål med 10 mL färdiga DMEM medier med serum och M-CSF från steg 1.4.
Obs: Utbytet av benmärgsceller är ungefär 4 x 107 per 6 – 8 veckors-gamla C57BL/6J mus. - Inkubera cellerna i cell kultur inkubator i 3 dagar vid 5% CO2, 37 ° C.
Obs: Under de första 2 dagarna, celler ser inte mycket viktigt, eftersom ett stort antal apoptotiska celler är närvarande (celler inte kan differentieras till myeloida celler och terminalt differentierade celler). - Efter 3 dagar, benmärgen cellkulturen börjar titta vital och kluster av delande celler bildas. Första vidhäftande celler observeras redan. Vid denna punkt, komplettera cellerna med färska cytokin media.
- Tillsätt 10 mL före värmde DMEM medier med serum och M-CSF (från steg 1.4) i varje 10 cm petriskål och returnera det i cell kultur inkubatorn. Det finns ingen anledning att ta bort det gamla mediet under detta steg.
Obs: benmärg makrofager är fullt differentierade efter 5 – 7 dagar i kultur. Den bästa tiden för skörd är på dag 6 – 8, där majoriteten av celler är anhängare och petriskål är helt täckt. - Dag 5, beakta cell kultur huven petriskål och lutar skålen tills media nästan når kanten av skålen. Ta försiktigt ut 15 mL för media från ytan nära kanten, och cellerna tenderar att bo mitt i skålen. Tillsätt samma volym före värmde medier med M-CSF och placera skålen tillbaka in i inkubatorn.
Obs: Om media är aspirerade långsamt och försiktigt, nästan inga celler går förlorade. Men det är också möjligt att Centrifugera aspirerade media och lägga till cellerna tillbaka till kultur, att säkerställa att inga icke-anhängare (dvs., ofullständigt differentierade) celler går förlorade. - För experiment används endast vidhäftande celler (makrofager). Ta bort alla media och flytande celler för att skörda celler, dag 6 eller 7. Tvätta skålen en gång med pre värmde PBS utan serum.
- Tillsätt 5 mL 0,02% EDTA i PBS, och Inkubera under 3 – 5 minuter vid 37 ° C i vävnadsodling inkubator.
- Med 5 mL pipett, ta bort celler från skålen av en ström av PBS-EDTA och placera dem i en 50 mL centrifugrör med 25 mL PBS. Om det behövs, sammanföra fler rätter.
- Centrifugera omedelbart 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Återsuspendera pelleten makrofag i DMEM media och räkna cellerna. Verifiera uttrycket av makrofag ytan differentiering markörer (CD11b och F4/80) av flödescytometri.
- För experiment som kräver cellerna vara i suspension, t.ex., flow flödescytometri experiment, qPCR eller western blot analyser, använda makrofager direkt. För experiment med vidhäftande makrofager, tallrik cellerna i vävnaden kultur plattan enligt experimentella inställningarna.
- Cellerna är redan fullt differentierade. Hålla dem i medieformat som lämpar sig för det avsedda experimentet eller i det ursprungliga tillväxt och differentiering mediet med M-CSF.
Obs: För att arbeta med vidhäftande makrofager, överföra dem till en ny tallrik minst 6 h innan användning (helst över natten) för att möjliggöra full vidhäftning till den nya ytan. Bråkdel av flytande celler kan tas bort innan experimentet.
5. benmärgen celldifferentiering till benmärgen härrör dendritiska celler
- Följa protokollet för BMDMs med justeringar som är specifika för BMDCs som beskrivs nedan i steg 5.2 – 5,4.
- Återsuspendera pelleten erhållna av benmärgsceller i DMEMsupplemented med 10% FBS och antibiotika och räkna cellerna (genom följande steg 4.1 av makrofag protokoll). För differentiering in dendritiska celler behandlas plattan 1-1,5 x 107 benmärgsceller i en 10 cm icke-vävnadskultur (bakteriell) petriskål i 10 mL färdiga DMEM medier med serum och GM-CSF (från steg 1.4.).
- Följ samma steg som odling som i BMDM protokoll (steg 4,3 – 4.5. makrofag protokoll). Använda DMEM media med serum och GM-CSF istället för M-CSF. Sedan för BMDCs odling tiden är längre (normalt 10 – 12 dagar), Lägg till 1 – 2 extra matning i 3 dagars intervall (genom att ta bort supernatanten och lägga till en ny odling media som beskrivs i steg 4.5.).
- Denna del av protokollet är praktiskt taget samma som motsvarande del av protokollet makrofag (steg 4,6 – 4.12. makrofag protokoll). Använd endast vidhäftande celler för experiment. Dag 10-12, samla de celler som använder EDTA, räkna och platta dem på en ny yta. Kontrollera uttrycket av surface differentiering markörer av dendritiska celler (CD11c +, CD11b +, F4/80-) av flödescytometri.
6. produktion av BMDMs och BMDCs uttrycka andra-taggade Protein av intresse
- Återsuspendera pelleten i benmärgsceller erhålls i steg 3.10. DMEM kompletteras med 10% FBS och antibiotika och räkna cellerna. För smitta, använda 2 – 5 x 106 BM celler per väl av en 6-väl vävnadsodling behandlas plattan.
- Platta celler i 1 mL av det förberedda DMEM mediet per Tja, kompletterad med M-CSF för differentiering in BMDMs eller med GM-CSF för differentiering BMDCs. hålla cellerna för 4 – 6 h i en vävnadskultur inkubator med 5% CO2 vid 37 ° C.
- Tillsätt 2 mL av nyligen uppsamlat virus (”supernatanten 1”) kompletteras med polybrene (12 µg/mL, slutlig koncentration 8 µg/mL efter tillägg till cellerna).
Obs: Frysta alikvot av virusinnehållande supernatanten kan också användas, men effekten blir lägre. - Centrifugera plattan vid 1,250 x g i 90 min vid 30 ° C (med långsam acceleration och retardation). Sedan, inkubera i 4 h med 5% CO2 vid 37 ° C.
- Valfritt: Byt 2 mL kultur media med färska medium innehållande respektive cytokin (M-CSF eller GM-CSF) och kultur med 5% CO2 vid 37 ° C. På den andra dagen, ta bort 2 mL odlingssubstrat och upprepa hela infektion procedur (steg 6.3 – 6,4) med 2 mL nyligen uppsamlat virus (”supernatant 2”).
Obs: Detta steg kan öka infektion effekten. Förbättring efter andra infektionen är beroende på det cell typ och mål proteinet och vår erfarenhet kan variera från 30% ökning i effektivitet till ingen förbättring alls. - Samla in icke-anhängare cellerna, överföra till en 15 mL centrifugrör och snurra på 500 x g för 5 min (4 ° C). Kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i 10 mL odlingssubstrat med M-CSF eller GM-CSF, placera cellerna i en 10 cm icke-vävnadskultur behandlade petriskål och kultur vid 37 ° C, 5% CO2. Optimala antalet celler för en 10 cm skålen är 5 – 10 x 106 för BM-derived makrofager och 10 – 15 x 106 för BM-derived dendritiska cellen.
Obs: Mindre rätter eller plattor kan användas, men cell nummer måste justeras. - Följ makrofager och dendritiska cellen odling och differentiering protokollet beskrivs i steg 4 och 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Signalering adapter proteiner är vanligtvis små proteiner utan någon enzymaktivitet. De besitter olika interaktion domäner eller motiv, som medlar bindning till andra proteiner involverade i signaltransduktion, inklusive tyrosinkinaser, fosfataser, ubiquitin ligases och andra21. För demonstration av funktionerna i detta protokoll valdes myeloida cell adaptrar PSTPIP2 och OPAL1. PSTPIP2 är ett väl karakteriserade protein som är involverade i regleringen av inflammatoriskt svar22. Det är ett cytoplasma protein som också kan rekryteras till cellmembran via sin F-bar-domän. Andra protein är en transmembrana adapter OPAL1, förväntas vara associerade med cellmembran. Dess fysiologiska funktion är fortfarande okänd. Men i akut lymfatisk leukemi är uttryck för OPAL1 associerade med bättre prognos23.
cDNA konstruerar kodning för PSTPIP2 eller OPAL1 smält via en kort länkare (GSGGGS eller Myc-tagg, respektive) till andra på C-terminus var klonade in pMSCV retrovirala vektorn med vanliga metoder av cDNA kloning. Denna konstruktion var sedan transfekterade i Plat-E celler tillsammans med förpackningen vektor pCL-Eco. Resulterande supernatanterna innehållande retrovirus användes för transduktion av benmärgsceller, följt av differentiering i BMDMs och BMDCs. Effekten av Plat-E transfection utvärderades av flödescytometri efter insamling av andra virusinnehållande supernatanten. Genomsnittlig transfection effektivitet var 62% för PSTPIP2-andra och 53% för OPAL1 och resultaten var mycket reproducerbara (figur 1A, B). OPAL1 konstruera tycktes vara mer toxiska för Plat-E celler (bedömd med utseendet på flytande/döende celler i kultur), vilket resulterar i en minskning av andelen transfekterade celler.
Differentiering status för benmärg härrör makrofager och dendritiska celler (sensorik med PSTPIP2-andra och OPAL1-andra retrovirala konstruktioner) bedömdes av flödescytometri. Mogen makrofag befolkning definieras av CD11b och F4/80 uttryck, medan dendritiska celler uttrycker CD11c härstamning markören. Mer än 90% av cellerna i båda typerna av kultur var positiva för deras respektive markörer (figur 2A, B). Slutligen, vi bestämda uttryck nivån på PSTPIP2-andra och OPAL1-andra konstruktioner i BMDMs och BMDCs av en enkel flödesmätning flödescytometri av andra fluorescens. Den genomsnittliga andelen andra-positiva makrofager var 71% för PSTPIP2-andra och 62% för OPAL1-andra (figur 3A). Händelse av dendritiska celler, effektiviteten var lägre, 32% för PSTPIP2 och 9% för OPAL1 (figur 3B). Resultaten av flera experiment påvisa reproducerbarhet av denna metod (figur 3 c).
Vi vanligtvis avgöra inte koncentrationen av virus i supernatanterna som vi använder i infektioner. Vi föredrar att använda virus supernatanterna färska, omedelbart efter samlingen, medan virus titerbestämning kräver tre ytterligare dagar. Som ett resultat, information om virus titer kan endast erhållas efterhand. Det kan dock fortfarande vara användbar när man behandlar tekniska frågor och problem. För att bedöma koncentrationen av virus i supernatanterna från Plat E transfekterade celler med PSTPIP2-andra och OPAL1-andra konstruktioner, vi inkuberas NIH-3T3-celler med seriellt utspädda virusinnehållande supernatanterna samlas in från dessa transfekterade Plat-E-celler och beslutsam virus titer exakt som beskrivs av Zjablovskaja et al i tidigare publicerade JoVE artikel24. I tre oberoende experiment, virus titern varierade från 1.1 x 106 till 4.4 x 106 TU/mL. Vi inte observera några väsentliga skillnader mellan PSTPIP1-andra och OPAL1-andra konstruktioner och mellan supernatanterna från dag 1 och dag 2. När dessa supernatanterna användes för benmärgen cell infektioner enligt protokollet beskriver vi i den här artikeln multiplicityen av infektion (MOI) varierade från 1,1 till 4.4. Intressant, inom detta spänner, vi inte iaktta någon korrelation mellan MOI och infektion effektivitet.
I figur 4, var PSTPIP2-andra och OPAL1-andra uttrycks i BMDMs och BMDCs visualiserat av konfokalmikroskopi. Fullt differentierade makrofager och dendritiska celler har en karakteristisk form. Förändringen i morfologi från små rundade stamceller till stora cellerna i oregelbundna former bekräftar framgångsrika differentiering. I makrofager var PSTPIP2 cytoplasmiska med partiell lokalisering vid plasmamembranet. OPAL1 föreföll riktas också delvis till plasmamembranet. Resten var sannolikt associerade med intracellulära membran, såsom det endoplasmatiska retiklet och Golgi komplexet. Dock för att bekräfta denna lokalisering, måste viss organell markörer användas. I dendritiska celler var membran lokaliseringen mindre tydligt.
Figur 1: effektivitet av Plat-E cell transfection. För transfection Plat-E celler, var två konstruktioner kodning adapter proteiner PSTPIP2 och OPAL1 smält med andra (PSTPIP2-andra och OPAL1-andra) klonade in pMSCV vektorn. Standard PEI transfection utfördes. Effekten av transfection utvärderades av flödescytometri av Plat-E cellerna efter insamling av andra virala supernatanten. (A). representativa flöde flödescytometri tomt. (B). diagram visar resultaten av fyra oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: bedömning av differentiering status BMDMs (A) och BMDCs (B). Yta uttryck för specifika makrofager och dendritiska cellen lineage markörer mättes av flödescytometri vid dag 8 av odling. Döda celler var gated ut baserat på deras sida och framåt scatter boenden och färgning med Hoechst 33258. Resultaten är representativa för minst 3 oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: bedömning av uttryck för PSTPIP2-andra och OPAL1-andra. ANDRA fluorescens i BMDMs (A) och BMDCs (B) retrovirally sensorik med PSTPIP2-andra och OPAL1-andra konstruktioner mättes av flödescytometri vid dag 8 av odling. (C) . Diagram som visar resultaten av flera oberoende experiment. BMDMs och BMDCs var gated som i figur 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa bilder av makrofager och dendritiska celler som uttrycker PSTPIP2 eller OPAL1. BMDMs (A) och BMDCs (B) att uttrycka PSTPIP2 och OPAL1 var visualiserat av levande imaging konfokalmikroskopi. ANDRA fluorescens i grönt visas på vänster sida av varje panel, ljusa fält bilden till höger. Skalstapeln = 10 µm. Resultaten är representativa för minst tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uttrycket av protein sevärdheter i målceller är ett viktigt steg i många typer av biologiska studier. Differentierade makrofager och dendritiska celler är svåra att transfect av standard transfection och retrovirala transduktion tekniker. Förbi transfection dessa differentierade celler med retrovirala transduktion av benmärgen progenitorceller, följt av differentiering när de redan bär den önskvärda bygga, är ett viktigt steg så att uttrycket av ektopisk cDNAs i dessa celltyper. Ett exempel på framgångsrik användning av denna metod kan hittas i vår senaste publikation25. Här, ger vi ett kostnadseffektivt protokoll för att uppnå stabil uttryck av konstruktionen av val i benmärgen-derived dendritiska celler och makrofager som använder denna metod. Det förfarande som vi presenterar är relativt billig och enkel, men ger mycket bra resultat. Reagenser som används i detta protokoll möjliggör dess rutinmässig användning även under en relativt restriktiv budget. Protokollet för Plat-E transfection sysselsätter PEI som en transfection reagens. Jämfört med andra kemiska transfection agenter, PEI är av en mycket låg kostnad, medan dess effektivitet är liknar flesta andra utbredda föreningar. PEI kan dock ersättas med många olika kommersiellt tillgängliga transfection reagenser i det här steget utan förlust av effektivitet. Som en vägledande princip utför transfection protokoll befunnits fungera med vanliga HEK293 celler normalt väl med Plat-E celler, alltför. En annan kostnadseffektiv åtgärd är utnyttjandet av cytokin-innehållande supernatanterna istället för renat rekombinant cytokiner. Användningen av dessa supernatanterna kräver vissa optimering. Men när standardprotokollet för deras förberedelser är etablerad och följt, blir variationen mellan enskilda partier av dessa supernatanterna mycket låg, som vanligtvis kräver inga förändringar i koncentrationer mellan enskilda partier. Effektivitetsvinsterna av BMDM och BMDC differentiering med dessa supernatanterna är, enligt vår erfarenhet, identisk med renat cytokiner.
Utöver retrovirala transduktion finns andra väletablerade metoder för däggdjursceller transfection, inklusive kemiska transfection (vanligtvis med katjoniska lipider eller katjoniska polymerer bildar komplex med DNA), elektroporation och användningen av andra typer av virala vektorer, främst adenovirala och lentiviral system26,27,28,29,30. Även om mycket höga titrar och effektivitetsvinster kan uppnås med adenovirus-baserade gen leverans, utarbetandet av motsvarande plasmider och virus partiklarna är svårare och mer tidskrävande än när det gäller retrovirala system29. Dessutom, framkallar adenovirus inflammatorisk reaktion i dendritiska celler och makrofager29,31,32 och för optimal prestanda i murina hematopoetiska celler mus och stam bär transgena adenovirus-receptorn är krävs33. Däremot, är generationen av lentiviral partiklar bär genen av intresse en relativt enkel process, nästan identisk med den som utnyttjas för retrovirus. I motsats till de ecotropic retrovirala vektorer används i detta protokoll, klarar lentiviruses av att infektera icke-frodas celler av flera arter, inklusive människor34. Detta kan vara en viktig fördel särskilda experimentella villkor. Dock äventyrar denna funktion också i hög grad säkerheten för dessa vektorer. I vår åsikt, för gen leverans till BMDMs och BMDCs, ger retrovirus bästa balansen mellan effektivitet, säkerhet och användarvänlighet. Retrovirala DNA konstruktioner kan tillagas enkelt använda enkla standard molekylär kloning tekniker. Virus är producerad av förpackning cell raderna direkt till kulturen supernatanten och ytterligare virus reningen är oftast inte nödvändigt. Ecotropic retrovirus också inte lätt smitta mänskliga celler, vilket gör deras användning relativt säker. Men det finns också vissa allmänna nackdelar förknippade med användning av retrovirala vektorer. Den viktigaste begränsande faktorn är att dessa virus infekterar bara frodas celler35. Den här funktionen påverkar inte signifikant i protokollet som beskrivs här, men det begränsar rad applikationer där retrovirala vektorer kan användas. Storleken på gen som kan klonas till dessa vektorer är också begränsad och virus-partikeln titer minskar med ökande infoga storlek. Med pMSCV vektorer börja vi brukar se effekter av Infoga storlek på runt 3 kbp. Med ytterligare ökningar i Infoga storlek minskar infektion effektiviteten gradvis.
Den kemiska transfection och elektroporation är mindre tidskrävande än någon av de virus-baserade förfaranden26,27,28,30, säkrare och enklare att använda. Men i BMDMs och BMDCs, de kan stimulera Svaren till utländska nukleinsyror31 och de genererar mer cellulär stress. Dessutom vissa kemiska transfection reagenser öka cellen auto-fluorescens som kan interferera med flödescytometri eller mikroskopi analyserar. Övergående pågrund av uttryck, kan de endast användas med mogen differentierade BMDMs eller BMDCs. Däremot de sekvenser som presenterade med retrovirala vektorer är permanent integrerade i genomet hos målceller och möjliggöra en stabil varaktig uttryck kompatibel med tidsskalan för den differentiering protokoll34, 35. denna funktion ökar dock också risken för insertionsmutationer. Relativt slumpmässigt pågrund av vektor integrationen är dess effekter på stora populationer av celler begränsad. Dock kan de vara synliga på nivån för enskilda celler. Ytterligare problem kan uppstå när en konstruktion som uttrycks från retrovirala vektor påverkar dendritiska cellen eller makrofag differentiering, vilket resulterar i underlåtenhet att generera differentierade BMDMs eller BMDCs från infekterade föräldraparets. Till viss del kan detta lösas genom att justera de infektion förutsättningarna för att uppnå låga nivåer (t.ex., genom att minska virus titern) eller med hjälp av ett system för inducerbara uttryck. Användning av andra smält till proteinet av intresse eller som reporter också tillåter sortering av celler med uttrycket nivå motsvarande experiment mål och begränsningar. Slutligen bör vi också nämna problem som är gemensamma för alla transfection/transduktion förfaranden. Dessa inkluderar främst överuttryck artefakter, såsom protein Skellefteåsjukan, mislocalization och toxicitet36. Protein toxicitet kan vara anledningen till OPAL1 var relativt svårt att uttrycka. Dess exempel illustrerar tydligt att arten av uttryckta proteinet väsentligen kan påverka effektiviteten av denna metod. Trots detta var vi dock kunna få tillräckliga mängder av OPAL1-andra uttrycker celler för mikroskopi analys med denna metod, visar dess användbarhet även när man arbetar med svårt mål. Dessutom skulle det vara möjligt att öka andelen sensorik celler med FACS sortering om så krävs av ett visst program. Låg infektion effektivitet kan också delvis övervinnas genom ökande viral partikel koncentration med hjälp av olika metoder eller ready-to-use kit. I våra händer, har ultrafiltrering av viral supernatanten på centrifugal filter med en molekylvikt som skär bort av 100 kDa visat sig ge bästa balans mellan effektivitet och krävs ansträngning.
Benmärgen härrör makrofager och dendritiska celler är utbredda verktyg i fagocytsystemet immunologi. De är mer fysiologiskt relevanta än tillgängliga cellinjer. De kan genereras i relativt höga siffror och, samtidigt, saknar genetisk heterogenitet och instabilitet kännetecken av cellinjer. En annan fördel är att de kan genereras från genetiskt modifierade möss att studera effekterna av genetisk modifiering på en relativt riklig och homogen cell befolkning. Detta är särskilt användbart i biokemiska studier, där relativt stora mängder celler krävs normalt. Förmågan att transduce dessa celler med cDNA konstruktioner öppnar ytterligare möjligheter forskning baserat på beredning eller komplettering av genetiska defekter i dessa celler och struktur och funktion analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete fick stöd av tjeckiska Science Foundation (GACR) (projektnummer 16-07425S), av Charles universitet Grant byrån (GAUK) (projektnummer 923116) och av institutionell finansiering från Institutet för molekylär genetik, akademin av vetenskaper av tjeckiska Republiken (RVO 68378050).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | For media suplementation |
| KHCO3 | Lachema, Brno, Czech Republic | N/A | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | A9434 | |
| Penicillin | BB Pharma AS, Prague, Czech Republic | N/A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic | N/A | |
| Polyethylenimine, linear, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| PBS | Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic | N/A | |
| APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 101212 | flow cytometry analysis |
| PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 123110 | flow cytometry analysis |
| APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 117310 | flow cytometry analysis |
| M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-02 | |
| GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-03 | |
| Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | H1398 | flow cytometry analysis use at 1-2 µg/mL |
References
- Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
- Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
- Kondo, M. Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors. Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).
- Andrews, T., Sullivan, K. E. Infections in patients with inherited defects in phagocytic function. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
- Scheicher, C., et al. Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow. Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).
- Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot5080 (2008).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Remington, S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).
- Hoffman, R. M. Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).
- Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G.
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).
- Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen. Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Janssen, E., Zhang, W.
- Ferguson, P. J., Laxer, R. M. New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice. Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).
- Holleman, A., et al. Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols. Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).
- Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).
- Kralova, J., et al. The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).
- Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).
- Siegert, I., et al. Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells. Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
- Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).
- Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
- Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).
- Tallone, T., et al. A mouse model for adenovirus gene delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).
- Milone, M. C., O'Doherty, U.
- McTaggart, S., Al-Rubeai, M. Retroviral vectors for human gene delivery. Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A.
