Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Выражение флуоресцентные синтез белков в мышиных костного мозга-производные дендритные клетки и макрофаги

Published: October 30, 2018 doi: 10.3791/58081
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 1
1Laboratory of Leukocyte Signalling, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Faculty of Science, Charles University, 3Department of Biophysical Chemistry, J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry ASCR

Summary

В этой статье мы предоставляем подробный протокол для выражения флуоресцентные синтез белков в мышиных костного мозга, полученных дендритные клетки и макрофаги. Метод основан на трансдукции костного прародителями с ретровирусной конструкции следуют дифференцировку в макрофаги и дендритные клетки в пробирке.

Abstract

Дендритные клетки и макрофаги являются важнейшим клетки, которые образуют первую линию обороны против патогенов. Они также играют важную роль в инициировании адаптивного иммунного ответа. Экспериментальная работа с этими клетками является довольно сложной задачей. Их численность в органах и тканях является относительно низким. В результате они не могут быть изолированы в больших количествах. Они также являются трудно transfect с cDNA конструкции. В мышиных модели в пробирке дифференциации от предшественники костного присутствии M-CSF для макрофаги или ГМ-КСФ для дендритных клеток можно частично преодолеть эти проблемы. Таким образом можно получить большое количество этих клеток от очень мало животных. Кроме того предшественники костного мозга может преобразованы с ретровирусной векторы нося cDNA конструкции ранних этапах выращивания до их дифференцировку в костного мозга, полученных дендритные клетки и макрофаги. Таким образом ретровиральных трансдукции следуют дифференциации в пробирке может использоваться выразить различные конструкции cDNA в эти клетки. Способность выразить внематочная белки существенно расширяет спектр экспериментов, которые могут быть выполнены на эти клетки, включая живой клетки изображения флуоресцентных белков, тандем очищения для interactome анализа, анализа структуры функция, мониторинг клеточных функций с биодатчики и многие другие. В этой статье мы описываем подробный протокол для антиретровирусного лечения трансдукции мышиных костного мозга, полученных дендритные клетки и макрофаги с векторами, кодирующих белки дневно тегами. На примере двух белков адаптер, OPAL1 и PSTPIP2, мы демонстрируем свое практическое применение в проточной цитометрии и микроскопии. Мы также обсудить преимущества и недостатки этого подхода.

Introduction

Миелоидных клеток являются неотъемлемой частью наших защитных механизмов против патогенов. Они способны быстро ликвидировать микробы, а также умирающие клетки. Кроме того они участвуют также в регулировании развития тканей и ремонта и в поддержании гомеостаза1,2,3. Все миелоидных клеток отличить от общих миелоидного предшественники костного мозга. В значительной степени контролируется цитокинов и их различные комбинации4является их дифференциация во многих морфологически и функционально различных подмножеств. Наиболее интенсивно изучали подмножеств миелоидных клеток включают нейтрофильных гранулоцитов, макрофаги и дендритные клетки. Дефекты в любой из этих групп населения приводят к потенциально угрожающих жизни последствий и причиной тяжелой дисфункции иммунной системы в организме человека и мышей1,2,3,5, 6.

В отличие от нейтрофильных гранулоцитов дендритные клетки и макрофаги-резидентов клетки тканей и их обилие в иммунных органов является относительно низким. В результате изоляция и очищение первичных дендритные клетки и макрофаги для экспериментов требующих большое количество этих клеток является дорогостоящей и зачастую невозможно. Для решения этой проблемы, были разработаны протоколы для получения большого количества однородных макрофаги и дендритные клетки в пробирке. Эти подходы основаны на дифференциацию клеток костного мозга мышиных присутствии цитокинов: макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) для макрофагов и гранулоцитарно макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) или Flt3 лигандом для дендритные клетки7,8,9,10,,1112. Клетки, созданный этим методом часто описаны в литературе, как костного производные макрофагов (BMDMs) и костного мозга, полученных дендритных клеток (BMDCs). Они имеют больше физиологические свойства общего первичного макрофаги или дендритные клетки чем с соответствующими клеточных линий. Другим большим преимуществом является возможность получения эти формы клетки генетически измененных мышей13. Сравнительные исследования между одичал тип клеток и клеток, полученных из генетически измененных мышей часто имеют решающее значение для раскрытия новых функций генов или протеинов интереса.

Анализ локализация внутриклеточных белков в живых клетках требует муфта флуоресцентные метки к протеину интереса в естественных условиях. Чаще всего это достигается путем выражения генетически закодированный фьюжн конструкция состоит из анализируемых белков, сочетании (часто через короткий компоновщика) к флуоресцентный белок (например., Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП))14,15 , 16. выражение дневно тегами белков в дендритные клетки и макрофаги является сложной задачей. Эти клетки обычно трудно transfect трансфекции стандартных процедур и эффективности, как правило, очень низкая. Кроме того transfection является временным, он генерирует клеточного стресса и достигнутые интенсивность флуоресценции не может быть достаточным для микроскопии17. Для того, чтобы получить разумную долю этих клеток с достаточным уровнем экспрессии трансген, инфекции прогениторных клеток костного мозга с антиретровирусной векторов и их последующее дифференцировку в BMDMs или BMDCs стал весьма эффективным подход. Это позволило для анализа белков миелоидного происхождения в их родной среде сотовой, так в стабильном состоянии, или в ходе процессов, которые являются критическими для иммунного ответа как фагоцитоз, иммунологические синапса формирования или миграции. Здесь мы описываем протокол, который обеспечивает стабильное выражение дневно тегами протеинов интереса в мышиных костного мозга, полученных макрофаги и дендритные клетки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все методы, описанные здесь были утверждены Комитетом экспертов по благосостоянию экспериментальных животных Института молекулярной генетики и Академии наук Чешской Республики.

1. Реагент подготовка

  1. Подготовьте аммония хлорид калия (ACK) буфера. Добавить 4.145 g NH4Cl и 0,5 г KHCO3 500 мл ddH2O, а затем 100 мкл 0,5 М Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и фильтр стерилизации.
  2. Готовят раствор polyethylenimine (PEI). Добавить 0,1 г Пей до 90 мл ddH2O. Помешивая, добавьте 1 M HCl каплям до тех пор, пока pH ниже, чем 2.0. Перемешать до 3 ч до растворения Пей, а затем настроить pH 7.2 с 1 M NaOH. Отрегулируйте громкость до 100 мл с ddH2O и фильтра стерилизации. Сделайте 1-2 мл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C.
    Примечание: После оттаивания, пей может храниться при температуре 4 ° C на срок до 2 недель, но не должны быть вновь заморожены.
  3. Подготовьте supernatants культуры клеток, содержащих M-КСФ или ГМ-КСФ. Эти supernatants можно сделать заранее и хранить в-80 ° C. Чтобы сделать эти supernatants, растут cytokine продуцирующих клеток (J558 ячейки для ГМ-КСФ 18 ) или CMG 14-12 M-CSF 19в 10 см Петри в среде Дульбекко изменение орла (DMEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) до слияния. Затем перенесите все ячейки 200 мл СМИ в колбу T150 тканевой культуры и культуры для дополнительных 4 дней на 5% CO237 ° C. Собирайте супернатант и фильтр над 0.2 мкм фильтром стерилизации. Сделать аликвоты и хранить их на-80 ° C.
  4. Подготовка 100 мл среды культуры клеток: DMEM дополнена 10% тепла инактивированных FBS и клеточной supernatants культуры из клетки секретирующие ГМ-КСФ (для дифференциации BMDC) или M-CSF (для дифференциации BMDM).
    Примечание: Количество цитокинов в этих supernatants может варьироваться и рабочие концентрации должен быть определен эмпирически. Как правило используется супернатант 2-3% от клеточных линий производства GM-CSF (рекомендуемая начальная концентрация составляет 2%) или супернатант 5 – 10% от CMG 14 – 12 клетки, вырабатывающие M-CSF (рекомендуемая начальная концентрация составляет 10%). Кроме того, очищенный коммерчески доступных M-CSF в 10 нг/мл и ГМ-КСФ в 20 нг/мл может использоваться с результаты практически идентичен cytokine содержащих supernatants, т.е., без каких-либо воздействие на темпы дифференциации, инфекции эффективность и внутриклеточных локализация EGFP-тегами конструкций. Антибиотики, включая пенициллин G (100 МЕ/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и гентамицин (40 мкг/мл), параметр может использоваться для клеточной культуры на любом этапе протокола, если не указано иное.

2. производство Retrovirus

Предостережение: Хотя ретровиральных векторов относительно безопасны по сравнению с другими видами вирусных векторов, они по-прежнему представляют потенциальную угрозу безопасности. Таким образом важно работать с особой тщательностью и соответствующие средства защиты и придерживаться всех правил безопасности и юридические требования для работы с вирусных частиц.

  1. Пластина одну ячейку подвеска платины-Эко (Plat-E) упаковка клеток в 10 см Петри и культивировать в 15 мл DMEM, содержащие 10% FBS до 50-60% притока (24 ч). Клетки должны расти в монослое и не должны формировать сгустки в культуре.
  2. Пипетка 20 мкг ретровирусной конструкции (например., конструкция, выражая дневно тегами протеина интереса в векторе pMSCV) и 10 мкг pCL Эко упаковка вектор20 в 1 мл DMEM (без сыворотки и антибиотики) и аккуратно перемешать.
  3. Для второй трубки мкл 75 PEI в 1 мл DMEM (без сыворотки и антибиотиков). Инкубировать 5 мин при комнатной температуре (RT), а затем смешать содержимое обеих трубок и проинкубируйте дополнительные 10 мин на RT.
    Примечание: Добавление pCL-Эко является необязательным. Это кодирование для вирусного рецептора ecotropic и может увеличить титр вируса.
  4. Тщательно заменить средство на клетки Plat-E 8 мл свежего DMEMsupplemented с 2% FBS. Предварительно теплой средой до 37 ° C перед использованием. Не использовать антибиотики в течение трансфекции, так как антибиотиков может снизить эффективность трансфекции.
  5. Тщательно добавить (в каплях) смесь, подготовленный в шаге 2.3 на клетки Plat-E и инкубировать в течение 4 ч при 37 ° C.
  6. После инкубации, Обмен средство на клетки Plat-E для 10 мл подогретым DMEM, содержащие 10% FBS и культивировать клетки для 24 ч при 37 ° C. Во время этой инкубации клетки Plat-E будет производить вирус в средствах массовой информации.
  7. После 24 часов собирать носитель, содержащий ретровирусные частицы из платины эко клеток с помощью пипетки 5 мл и перенести его на 15 мл пластиковых пробирок (= «супернатанта 1», содержащие ecotropic ретровирусные частицы).
  8. Чтобы избежать заражения клеток Plat-E в Вирусный supernatants, спина собранные вирус в 1250 × g 5 мин при 4 ° C. Для достижения наилучших результатов вирус следует использовать немедленно для инфекции.
    Примечание: Аликвоты вируса также может храниться при температуре-80 ° C для последующего использования. Однако это приведет к определенные сокращения в электромеханической эффективности. Избегайте повторяющихся замораживания/оттаивания вируса, так как это приводит к деградации вирус.
  9. Добавить 10 мл подогретым DMEM с 10% FBS-Plat-Е клетки и культивировать для другой 24 ч при 37 ° C.
  10. Повторите шаги 2.7. и 2,8. для получения «супернатанта 2».

3. мышиных костного изоляция клетки

  1. Пожертвуйте мыши с помощью шейки матки вывих или другого утвержденного метода. Спрей мыши с 70% этиловом спирте.
  2. С помощью пинцета и ножницы, удалите кожи, а также часть мышц из задних ног. Осторожно выбить вертлужной впадины от тазобедренного сустава не нарушая бедренной кости. Вырежьте лапы в голеностопного сустава. Спрей кости (бедра, подключенных к голени) с 70% этанола и удалите остальные мышцы с помощью бумажным полотенцем.
  3. Место кости в чашке Петри 5 см, содержащие стерильные фосфатный буфер (PBS) с 2% FBS (PBS-FBS).  Если подготовка более костей, держите Петри на льду до обработки.
  4. Для обеспечения стерильности культивирования, выполните все следующие действия в культуре ткани капюшоном.
  5. Отделите бедренной кости от голени не нарушая концы костей (согнуть в колене, совместные и тщательно вырезать ножницами).
  6. Процесс по одной кости. Отрезать очень небольшая часть эпифизов (примерно 1 – 2 мм) с ножницами удерживая кости в пинцетом.
  7. Используйте иглой 30 G и 2 или 5 мл шприц заполнены с PBS-FBS очистить клетки костного мозга от обоих концов кости в пластиковых пробирок 15мл. Перемещение иглы внутри кости во время промывки для того, чтобы удалить все клетки. Если игла получает забиты, измените его.
    Примечание: Кости следует повернуть от красного до белого во время промывки. Это показывает, что большинство клеток были удалены из кости. Используйте примерно 2-3 мл PBS-FBS на кости.
  8. Центрифуга клетки на 500 g x 5 мин при 4 ° C.
  9. Отменить супернатант и лизируют красных кровяных клеток, resuspending гранулы 2,5 мл буфера ACK для 2-3 мин при комнатной температуре. Во время lysis фильтр клеток костного мозга через стрейнер ячейки 100 мкм в трубу centrifug свежий 15 мл. Восстановите тонус, добавив 12 мл PBS-FBS.
    Примечание: Не превышать 5 мин гипотонический лизис с ACK буфер, чтобы избежать смерти клетки.
  10. Центрифуга сразу на 500 g x 5 мин при 4 ° C.

4. костного дифференцировки клеток в костном производные макрофаги

  1. Ресуспензируйте Пелле клеток костного мозга в DMEM, дополненная 10% FBS и антибиотики (см. Примечание после шаг 1.4. антибиотик концентрации) и подсчитать количество ячеек. Для дифференциации в BM производных макрофагов, пластина 5 – 10 x 106 клеток костного мозга в 10 см не культуры ткани лечение (бактериальный) Петри с 10 мл заранее подготовленные СМИ DMEM сыворотки и M-CSF шаг 1.4.
    Примечание: Выход из клеток костного мозга составляет примерно 4 x 107 неделю 6 – 8-старый C57BL/6J мыши.
  2. Инкубации клеток в инкубатор культуры клеток для 3 дней на 5% CO2, 37 ° C.
    Примечание: В течение первых 2 дней, клетки не выглядят очень важно, как большое количество apoptotic клеток в настоящее время (клетки способны дифференцироваться в миелоидных клеток и неизлечимо дифференцированных клеток).
  3. После 3 дней культуры клеток костного мозга начинает выглядеть жизненно важные и формируются кластеры деления клетки. Уже можно наблюдать первые адэрентных клеток. На данный момент дополнение клетки с свежими цитокина СМИ.
  4. Добавить 10 мл подогретым DMEM СМИ с сывороткой и M-CSF (от шаг 1.4) на каждые 10 см Петри и вернуть его в инкубатор культуры клеток. Существует не нужно удалять старые средства массовой информации во время этого шага.
    Примечание: полностью костного макрофаги продифференцированы после 5-7 дней в культуре. День 6 – 8, где большинство клеток являются приверженцем и Петри блюдо полностью покрыта лучшее время для сбора урожая.
  5. На 5 день учитывать Петри капот культуры клеток и раздвиньте блюдо до тех пор, пока средства массовой информации почти достигает края блюдо. Осторожно извлеките 15 мл СМИ от поверхности ближе к краю, и клетки имеют тенденцию оставаться в середине блюдо. Добавьте такой же объем подогретым СМИ с M-CSF и поместите блюдо обратно в инкубаторе.
    Примечание: Если СМИ будет придыханием медленно и осторожно, почти не клетки теряются. Однако, это также возможно центрифуга без наддува СМИ и добавить клетки обратно к культуре, чтобы убедиться, что не приверженца (т.е., неполно дифференцированных) клетки теряются.
  6. Для экспериментов используются только адэрентных клеток (макрофаги). Урожая клеток, на день 6 или 7, удалите все средства массовой информации и плавающей клетки. Вымойте блюдо с подогретым PBS без сыворотки.
  7. Добавьте 5 мл 0,02% ЭДТА в PBS и Инкубируйте 3 – 5 мин при 37 ° C в инкубатор культуры ткани.
  8. С помощью пипетки 5 мл, удалить ячейки из блюдо эфир PBS-ЭДТА и поместите их в 50 мл пластиковых пробирок с 25 мл ФСБ. При необходимости объединения более блюда.
  9. Центрифуга сразу на 500 g x 5 мин при 4 ° C.
  10. Ресуспензируйте Пелле макрофагов в среде DMEM СМИ и подсчитать количество ячеек. Проверьте выражение макрофагов поверхности дифференциация маркеров (CD11b и F4/80), проточной цитометрии.
  11. Для экспериментов требующих клеток в суспензии, например., поток цитометрии эксперименты, ПЦР или Западный анализ помаркой, напрямую использовать макрофаги. Для экспериментов с приверженцами макрофагов плиты клетки культуры ткани пластины по экспериментальной установки.
  12. Клетки уже полностью продифференцированы. Держите их в средствах массовой информации подходит для предполагаемого эксперимент или в оригинальной рост и дифференцировку СМИ с M-CSF.
    Примечание: Для работы с приверженцами макрофагов, передачи их в новую пластины по крайней мере 6 h перед использованием (идеально на ночь), чтобы разрешить для полного прилегания к новой поверхности. Малая часть плавучих клетки могут быть удалены до эксперимента.

5. костного дифференцировки клеток в костном производные дендритные клетки

  1. Следуйте протокол для BMDMs с конкретных коррективов для BMDCs описано ниже 5.2-5.4.
  2. Ресуспензируйте полученные гранулы клеток костного мозга в DMEMsupplemented с 10% FBS и антибиотики и подсчитать количество ячеек (на следующий шаг 4.1 протокола макрофагов). Для дифференциации в дендритные клетки пластина 1 – 1,5 x 107 клеток костного мозга в 10 см не культуры ткани обрабатываются (бактериальный) Петри в 10 мл заранее подготовленные СМИ DMEM сыворотки и ГМ-КСФ (шаг 1.4.).
  3. Выполните те же шаги выращивания как BMDM протокол (шаги 4.3 – 4.5. макрофагов протокола). Использование DMEM СМИ с сывороткой и ГМ-КСФ вместо M-CSF. Поскольку для BMDCs длиннее время культивирования (обычно 10-12 дней), добавить 1-2 дополнительных кормлений в 3 дня интервалы (путем удаления супернатант и добавления новых СМИ культивирования, как описано в шаге 4.5.).
  4. Эта часть протокола является практически совпадает с соответствующей частью протокола макрофагов (шаги 4.6-4.12. макрофагов протокола). Для экспериментов используйте только адэрентных клеток. День 10-12, собрать клетки, используя ЭДТА рассчитывать и пластины их на новую поверхность. Проверка выражения поверхности дифференциация маркеров дендритных клеток (CD11c +, CD11b + F4/80-) подачей cytometry.

6. производство BMDMs и BMDCs, выражая EGFP-тегами протеин интереса

  1. Ресуспензируйте Пелле клеток костного мозга, полученных в шаге 3.10. в среде DMEM дополнена 10% FBS и антибиотики и подсчитать количество ячеек. Для инфекции, используйте 2 – 5 х 106 клеток БМ на хорошо культуры ткани 6-хорошо лечить пластины.
  2. Пластина клеток в 1 мл подготовленный DMEM СМИ за хорошо, дополнены с M-CSF для дифференциации в BMDMs или ГМ-КСФ для дифференциации BMDCs. Держите клетки для 4-6 ч в инкубатор культуры ткани с 5% CO2 при 37 ° C.
  3. Добавьте 2 мл свеже собранных вируса («супернатанта 1») с Полибрен (12 мкг/мл, конечная концентрация 8 мкг/мл после добавления в клетки).
    Примечание: Замороженные Алиготе супернатант содержащий вирус может также использоваться, но эффективность будет ниже.
  4. Центрифуга пластину на 1250 g x 90 мин при 30 ° C (с медленного ускорения и замедления). Затем Проинкубируйте 4 ч с 5% CO2 при 37 ° C.
  5. Дополнительно: Замените 2 мл средства массовой информации культуры свежие среднего содержащие соответствующих цитокинов (M-КСФ или ГМ-КСФ) и культуры с 5% CO2 при 37 ° C. На второй день удалите 2 мл культуры средств массовой информации и повторить весь инфекции (шаг 6.3 – 6,4) с 2 мл свеже собранных вируса («супернатанта 2»).
    Примечание: Этот шаг может увеличить эффективность инфекции. Улучшение после второй инфекции зависит от типа и целевых белков и в наш опыт может варьироваться от 30% увеличение эффективности для улучшения не на всех.
  6. Сбор не сторонник клетки, передать пластиковых пробирок 15мл и спина на 500 g x 5 мин (4 ° C). Выбросите супернатант.
  7. Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл средства массовой информации культуры с M-КСФ или ГМ-КСФ, место клетки в Петри 10 см обработанной ткани культуры и культуры при 37 ° C, 5% CO2. Оптимальное количество ячеек для 10 см блюдо составляет 5 – 10 x 106 для БМ производные макрофагов и 10 – 15 х 106 для БМ производные дендритных клеток.
    Примечание: Небольшие блюда или пластины может использоваться, но номера ячейки должны быть скорректированы соответствующим образом.
  8. Следовать макрофаги и дендритные клетки выращивания и дифференциации протокол описано в шаге 4 и 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Сигнальный адаптер белки, обычно маленькие белки без каких-либо ферментативную активность. Они обладают различные взаимодействия доменов или мотивы, которые посредником связывание с другими белками вовлечены в сигнальной трансдукции, включая тирозин киназ, фосфатаз и убиквитин ligases21. Для демонстрации функциональности этого протокола были выбраны адаптеры миелоидных клеток PSTPIP2 и OPAL1. PSTPIP2 это хорошо характеризуется белок, участвующий в регуляции воспалительной реакции22. Это является цитоплазматический белок, который также могут быть набраны в клеточных мембранах через свой домен F-бар. Второй белок является трансмембранным адаптер OPAL1, ожидается, что будет связано с клеточных мембран. Физиологические функции до сих пор неизвестна. Однако в острый лимфобластный лейкоз, выражение OPAL1 связан с лучше прогноз23.

cDNA конструкции кодирования для PSTPIP2 или OPAL1 сливается через короткий компоновщик (GSGGGS или Myc тега, соответственно) с EGFP в C-terminus были клонированы в pMSCV ретровирусной вектор с использованием стандартных методов cDNA клонирования. Эта конструкция была затем transfected в Plat-E клетки вместе с упаковка вектор pCL Эко. Результате supernatants, содержащие ретровирусы были использованы для трансдукции клеток костного мозга, следуют дифференциация в BMDMs и BMDCs. Эффективность трансфекции Plat-E оценивалась подачей cytometry после сбора второй вирус содержащих супернатант. Средняя трансфекции эффективности был 62% для PSTPIP2-EGFP и 53% для OPAL1 и результаты были весьма воспроизводимость (рис. 1A, B). OPAL1 конструкция, как представляется, более токсичны для клеток Plat-E (оцениваются внешний вид плавающей умирающих клеток в культуре), в результате сокращения в процентах transfected клеток.

Дифференциация состояния костного мозга, полученных макрофаги и дендритные клетки (преобразованы с PSTPIP2-EGFP и OPAL1-EGFP ретровирусной конструкции) оценивали проточной цитометрии. Зрелые макрофаги населения определяется выражением CD11b и F4/80, в то время как дендритные клетки Экспресс линии маркера CD11c. Более чем 90% клеток в обоих типах культуры оказались позитивными на их соответствующих маркеров (рисунок 2A, B). Наконец мы определили, что уровень экспрессии PSTPIP2-EGFP и OPAL1-EGFP конструкций в BMDMs и BMDCs методом простого измерения цитометрии EGFP флуоресценции. Средний процент EGFP-положительных макрофаги был 71% для PSTPIP2-EGFP и 62% для OPAL1-EGFP (рис. 3A). В случае дендритные клетки, эффективность была ниже, 32% для PSTPIP2 и 9% для OPAL1 (рис. 3B). Результаты нескольких экспериментов показывают воспроизводимость этого метода (рис. 3 c).

Мы обычно не определить концентрацию вируса в supernatants, которые мы используем в инфекции. Мы предпочитаем использовать свежие supernatants вирус, сразу после сбора, в то время как определение титра вируса требует три дополнительных дней. В результате, информация о титр вируса могут быть получены только постфактум. Однако она все еще может быть полезным при решении технических вопросов и проблем. Для оценки концентрации вируса в supernatants от Plat E клетки transfected с PSTPIP2-EGFP и создает OPAL1-EGFP, мы инкубировали низ 3T3 клетки с серийно разреженных вирус содержащих supernatants, собранные из этих transfected клеток Plat-E и определить титр вируса точно так, как описано в Zjablovskaja et al в ранее опубликованных JoVE статьи24. В трех независимых экспериментах, титр вируса варьировались от 1,1 х 106 4.4 x 106 ту/мл. Мы не наблюдали любые существенные различия между PSTPIP1-EGFP и OPAL1-EGFP конструкций и supernatants от дня 1 и 2 день. Когда эти supernatants были использованы для инфекции клеток костного мозга согласно протоколу мы описываем в этой статье, обилие инфекции (МВД) варьировались от 1.1 до 4.4. Интересно, что в пределах этого диапазона, мы не наблюдали корреляции между МВД и инфекции эффективность.

На рисунке 4PSTPIP2-EGFP и OPAL1-EGFP, выраженная в BMDMs и BMDCs были визуализированное confocal микроскопии. Полностью дифференцированной макрофаги и дендритные клетки имеют характерную форму. Изменения в морфологии от небольшие округлые прогениторных клеток в большие клетки неправильной формы подтверждает успешное дифференциации. В макрофагах PSTPIP2 был цитоплазматических с частичной локализацией на плазматической мембраны. OPAL1, как представляется, также частично направлены на плазматической мембраны. Все остальное было вероятно связано с внутриклеточные мембраны, например эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи комплекс. Однако для подтверждения этой локализации, определенных органелл маркеры должны использоваться. В дендритные клетки мембраны локализации был менее очевидным.

Figure 1
Рисунок 1: эффективность transfection клетки Plat-Э. Для transfection клетки Plat-E две конструкции, которую кодирования адаптер белки, PSTPIP2 и OPAL1 сливается с EGFP (PSTPIP2-EGFP и OPAL1-EGFP) были клонированы в pMSCV вектор. Стандартный PEI transfection была выполнена. Эффективность трансфекции оценивалась подачей cytometry Plat-E клеток после сбора второй вирусных супернатант. (A). Представитель потока цитометрии сюжет. (B). графике показаны результаты четырех независимых экспериментах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Оценка состояния дифференциация BMDMs (A) и BMDCs (B). Поверхности выражение конкретных макрофаги и дендритные клетки lineage маркеров измерялась подачей cytometry в день 8 культивирования. Мертвые клетки были закрытого основанный на их стороне и вперед разброс свойств и пятнать с Hoechst 33258. Результаты являются представитель по крайней мере 3 независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Оценка выражения PSTPIP2-EGFP и OPAL1-EGFP. EGFP флуоресценции в BMDMs (A) и (B) BMDCs retrovirally преобразованы с PSTPIP2-EGFP и OPAL1-EGFP конструкции была измерена подачей cytometry в день 8 культивирования. (C) . График, показывающий результаты нескольких независимых экспериментов. BMDMs и BMDCs были закрытого как показано на рисунке 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: представитель изображений макрофаги и дендритные клетки, выражая PSTPIP2 или OPAL1. BMDMs (A) и BMDCs (B) выражая PSTPIP2 и OPAL1 были визуализированное живых изображений confocal микроскопии. EGFP флуоресценции в зеленом показано на левой стороне каждой группы, светлые области изображения справа. Шкалы бар = 10 мкм. Результаты являются представитель по меньшей мере три независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Выражение протеина интереса к клеткам-мишеням является ключевым шагом во многих видах биологических исследований. Трудно transfect стандартных transfection и антиретровирусным трансдукции методы дифференцированной макрофаги и дендритные клетки. Обход трансфекции этих дифференцированных клеток с ретровирусной трансдукции предшественники костного мозга, следуют дифференциации, когда они уже несут требуемой конструкции, является важным шагом, позволяя выражение внематочная cDNAs в этих типы клеток. Примером успешного использования этого метода можно найти в нашей недавней публикации25. Здесь мы предоставляем рентабельным протокол для достижения стабильной выражение конструкции выбора в костный мозг производные дендритные клетки и макрофаги, используя этот подход. Процедура, которую мы представляем, относительно недорогой и простой, еще приносит очень хорошие результаты. Реактивы, используемые в настоящем Протоколе позволяют ее рутинного использования даже при относительно ограничительной бюджета. Протокол transfection Plat-E использует PEI как трансфекции реагента. По сравнению с другими агентами химического трансфекции, ПЭЙ является очень низкой стоимости, в то время как его эффективность похож на большинство других широко используется соединений. Однако Пей могут быть заменены многие различные коммерчески доступных трансфекции реагентов в этот шаг без потери эффективности. В качестве руководящего принципа transfection протоколов, известных для работы с часто используемым HEK293 клетки обычно выполняют хорошо с клетками Plat-E, тоже. Еще экономически эффективной мерой является использование cytokine содержащих supernatants вместо очищенный рекомбинантных цитокинов. Использование этих supernatants требует некоторые оптимизации. Однако когда устанавливается и затем стандартный протокол для их подготовки, вариабельность между отдельными партиями этих supernatants становится очень низкий, обычно требующих никаких изменений в рабочих концентрациях между отдельными партиями. Эффективность дифференцировки BMDM и BMDC с этими supernatants являются, по нашему опыту, идентичен очищенный цитокинов.

Дополнение к антиретровирусным трансдукции существуют другие устоявшихся методов transfection клеток млекопитающих, включая химических трансфекции (обычно с использованием катионной липидов или катионные полимеры, образуя комплексы с ДНК), электропорация и использование другие виды вирусных векторов, главным образом систем аденовирусных и лентивирусные26,27,28,29,30. Хотя очень высокие титры и эффективности может быть достигнуто с доставкой на основе аденовирус гена, подготовка соответствующих плазмидов и вирусных частиц более сложным и длительным делом, чем в случае ретровирусной систем29. Кроме того Аденовирус вызывает воспалительный процесс в дендритные клетки и макрофаги29,,3132 и для обеспечения оптимальной производительности в мышиных гемопоэтические клетки мыши штамм перевозящих трансгенных аденовирусы рецепторов — требуется33. С другой стороны поколение лентивирусные частиц, перевозящих гена интереса является относительно простой процесс, практически идентичен для ретровирусы. В отличие от ecotropic ретровиральных векторов, используемые в настоящем Протоколе lentiviruses способны заражать-пролиферирующих клеток нескольких видов, в том числе люди34. Это может быть важным преимуществом в конкретных экспериментальных условиях. Однако эта функция также существенно подрывает безопасность этих векторов. По нашему мнению, для доставки генов BMDMs и BMDCs ретровирусы обеспечивают наилучший баланс эффективности, безопасности и простоты использования. Антиретровирусные ДНК конструкции можно легко приготовить с помощью простых стандартных методов молекулярного клонирования. Вирус производится упаковка линии клетки непосредственно к культуре супернатанта и дальнейшей очистки вируса обычно не является необходимым. Ретровирусы Ecotropic также не заразить легко человеческих клеток, что делает их использование относительно безопасным. Однако существуют некоторые общие недостатки, связанные с использованием ретровиральных векторов. Основным ограничивающим фактором является, что эти вирусы заражают только пролиферирующих клеток35. Эта функция существенно не влияет на протокол, описанные здесь, но это ограничивает диапазон приложений, где может использоваться ретровиральных векторов. Размер гена интереса, которые могут быть клонированы в эти векторы также ограничен и титр вирусных частиц уменьшается с увеличением размера вставки. С pMSCV векторов мы обычно начинаем видеть последствия размер вставки на около 3 kbp. С дальнейшее увеличение размер вставки инфекции эффективность постепенно снижается.

Химические transfection и электропорации проще в использовании, безопасный и меньше времени, чем любой из процедур, основанных на вирус26,27,28,30. Однако в BMDMs и BMDCs, они могут стимулировать ответы на иностранных нуклеиновые кислоты31 и они генерируют более клеточного стресса. Кроме того некоторые реагенты химические трансфекции увеличение клеток авто флуоресценции, которые могут помешать с проточной цитометрии или микроскопия анализирует. Из-за преходящий характер выражения они может использоваться только с зрелой дифференцированных BMDMs или BMDCs. В противоположность этому последовательности, введена с ретровиральных векторов постоянно интегрированы в геном клетки-мишени и позволяют стабильные долгосрочные выражение совместим с шкале времени дифференциация протоколы34, 35. Однако, эта функция также увеличивает риск инсерционному мутагенезу. Благодаря относительно случайный характер вектор интеграции ее влияние на большой популяции клеток являются ограниченными. Однако они могут быть видны на уровне отдельных клеток. Когда конструкция выразил от ретровирусной вектор влияет дендритные клетки или макрофага дифференциации, что приводит к неспособности создать продифференцировано BMDMs или BMDCs от зараженных прародителями, могут возникнуть дополнительные проблемы. В некоторой степени, это могут быть преодолены путем корректировки инфекции условия для достижения низкой выражение уровня (например., уменьшая титр вируса) или с помощью системы индуцибельной выражение. Использование EGFP, сливается с протеином интереса или как репортер также позволяет для сортировки клеток с выражение уровня, соответствующего эксперимента целей и ограничений. Наконец мы должны также упомянуть проблемы, общие для всех процедур трансфекции/трансдукции. К ним относятся главным образом гиперэкспрессия артефакты, такие как белок, сворачиванию, mislocalization и токсичности36. Токсичности белка может быть причиной, почему OPAL1 было довольно трудно выразить. Его пример наглядно иллюстрирует, что характер выраженной белка может существенно повлиять на эффективность данного метода. Однако несмотря на это, мы смогли получить достаточного количества OPAL1-EGFP выражая клетки для микроскопии анализа с помощью этого метода, демонстрируя свою полезность, даже при работе с трудных целей. Кроме того можно было бы увеличить показатели transduced клеток СУИМ сортировки, если требуется для конкретного приложения. Можно также частично преодолеть низкий инфекции эффективность путем увеличения концентрации вирусных частиц с использованием различных методов или готовых к использованию комплектов. В наших руках ультрафильтрации вирусный супернатант на центробежные фильтры с молекулярной массой, cut off 100 кДа оказалось обеспечить лучший баланс между эффективностью и требуемых усилий.

Костного производные макрофаги и дендритные клетки являются широко используемых инструментов в иммунологии фагоцитов. Они являются физиологически более актуальными, чем доступные клеточных линий. Они могут создаваться в относительно высоких чисел и, в то же время, отсутствие генетической характеристикой неоднородности и нестабильности клеточных линий. Еще одно преимущество заключается в том, что они могут быть сгенерированы из генетически измененных мышей для изучения последствий генетической модификации на относительно обильные и однородной клеточной популяции. Это особенно полезно в биохимических исследований, где обычно требуются относительно большое количество клеток. Способность передавать эти клетки с конструкциями cDNA открывает дополнительные возможности исследования, основанные на воссоздание или дополнения генетических дефектов в эти клетки и структура функция анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана на Чешской науки фонд (GACR) (проект № 16-07425S), Карлова университета гранта Агентства (ГАУК) (номер 923116 проекта) и институционального финансирования от Института молекулярной генетики, Академия наук Чешской Республики Республика (РВО 68378050).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15028
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270 For media suplementation
KHCO3 Lachema, Brno, Czech Republic N/A
NH4Cl Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) A9434
Penicillin BB Pharma AS, Prague, Czech Republic N/A PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA
Streptomycin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) S9137 Streptomycin sulfate salt powder
Gentamicin Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic N/A
Polyethylenimine, linear, MW 25,000 Polyscience, Warrington, PA, USA 23966
Polybrene Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) H9268
EDTA Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) E5134
PBS Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic N/A
APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 BioLegend (San Diego, CA, USA) 101212 flow cytometry analysis
PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 BioLegend (San Diego, CA, USA) 123110 flow cytometry analysis
APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 BioLegend (San Diego, CA, USA) 117310 flow cytometry analysis
M-CSF PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) 315-02
GM-CSF PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) 315-03
Hoechst 33258 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA H1398 flow cytometry analysis use at 1-2 µg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
  2. Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).
  3. Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
  4. Kondo, M. Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors. Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).
  5. Andrews, T., Sullivan, K. E. Infections in patients with inherited defects in phagocytic function. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).
  6. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  7. Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
  8. Scheicher, C., et al. Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow. Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).
  9. Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).
  10. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot5080 (2008).
  11. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  12. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  13. Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).
  14. Remington, S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).
  15. Hoffman, R. M. Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).
  16. Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. Flow cytometry of fluorescent proteins. Methods. 57 (3), 318-330 (2012).
  17. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).
  18. Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen. Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).
  19. Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
  20. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  21. Janssen, E., Zhang, W. Adaptor proteins in lymphocyte activation. Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).
  22. Ferguson, P. J., Laxer, R. M. New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice. Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).
  23. Holleman, A., et al. Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols. Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).
  24. Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).
  25. Kralova, J., et al. The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).
  26. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).
  27. Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).
  28. Siegert, I., et al. Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells. Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).
  29. Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  30. Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).
  31. Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
  32. Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).
  33. Tallone, T., et al. A mouse model for adenovirus gene delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).
  34. Milone, M. C., O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. , (2018).
  35. McTaggart, S., Al-Rubeai, M. Retroviral vectors for human gene delivery. Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).
  36. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).

Tags

Биология выпуск 140 дендритные клетки макрофаги миелоидных клеток дифференциация клетки костного мозга мышиных цитокины M-CSF ГМ-КСФ вирусные инфекции белка GFP с тегами
Выражение флуоресцентные синтез белков в мышиных костного мозга-производные дендритные клетки и макрофаги
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kralova, J., Glatzova, D., Borna,… More

Kralova, J., Glatzova, D., Borna, S., Brdicka, T. Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages. J. Vis. Exp. (140), e58081, doi:10.3791/58081 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter