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Biology

Murine अस्थि मज्जा में फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति-व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं और मैक्रोफेज

Published: October 30, 2018 doi: 10.3791/58081
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 1
1Laboratory of Leukocyte Signalling, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Faculty of Science, Charles University, 3Department of Biophysical Chemistry, J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry ASCR

Summary

इस अनुच्छेद में, हम murine अस्थि मज्जा व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं और मैक्रोफेज में फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । विधि retroviral के साथ अस्थि मज्जा progenitors के transduction पर आधारित है और इन विट्रो मेंमैक्रोफेज और वृक्ष कोशिकाओं में भेदभाव द्वारा पीछा किया ।

Abstract

वृक्ष कोशिकाओं और मैक्रोफेज महत्वपूर्ण कोशिकाओं है कि रोगजनकों के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में कर रहे हैं । उंहोंने यह भी एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की दीक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इन कोशिकाओं के साथ प्रयोगात्मक काम नहीं बल्कि चुनौतीपूर्ण है । अंगों और ऊतकों में इनकी बहुतायत अपेक्षाकृत कम होती है. नतीजतन, वे बड़ी संख्या में अलग नहीं किया जा सकता है । सीडीएनए के साथ transfect करना भी मुश्किल होता है । murine मॉडल में इन समस्याओं को आंशिक रूप से इन विट्रो में अस्थि मज्जा progenitors से मैक्रोफेज या जीएम वृक्ष कोशिकाओं के लिए सीएसएफ के लिए एम सीएसएफ की उपस्थिति में भेदभाव से दूर किया जा सकता है । इस तरह, यह बहुत कुछ जानवरों से इन कोशिकाओं की बड़ी मात्रा प्राप्त करने के लिए संभव है । इसके अलावा, अस्थि मज्जा progenitors retroviral वैक्टर के साथ transduced किया जा सकता है खेती की प्रारंभिक अवस्था के दौरान सीडीएनए constructs ले जाने से पहले अपने विभेद करने के लिए अस्थि मज्जा व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं और मैक्रोफेज में । इस प्रकार, retroviral transduction इन विट्रो में भेदभाव द्वारा पीछा किया इन कोशिकाओं में विभिंन सीडीएनए निर्माण व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अस्थानिक प्रोटीन व्यक्त करने की क्षमता काफी प्रयोगों की सीमा है कि इन कोशिकाओं पर किया जा सकता है, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लाइव सेल इमेजिंग सहित, interactome विश्लेषण के लिए मिलकर शुद्धीकरण, संरचना समारोह का विश्लेषण प्रदान करता है, और कई अंय लोगों के साथ सेलुलर कार्यों की निगरानी । इस अनुच्छेद में, हम retroviral transduction के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन murine अस्थि मज्जा व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं और मैक्रोफेज वैक्टर के लिए कोडिंग के साथ-प्रोटीन टैग की गईं । दो एडेप्टर प्रोटीन, OPAL1 और PSTPIP2 के उदाहरण पर, हम प्रवाह cytometry और माइक्रोस्कोपी में अपने व्यावहारिक अनुप्रयोग का प्रदर्शन । हम भी इस दृष्टिकोण के लाभों और सीमाओं पर चर्चा ।

Introduction

माइलॉयड कोशिकाओं रोगजनकों के खिलाफ हमारे रक्षा तंत्र का एक अनिवार्य हिस्सा प्रतिनिधित्व करते हैं । वे तेजी से रोगाणुओं को खत्म करने में सक्षम हैं, साथ ही मरने कोशिकाओं । इसके अलावा, वे भी ऊतक के विकास और मरंमत और homeostasis1,2,3को बनाए रखने में विनियमित करने में शामिल हैं । सभी माइलॉयड कोशिकाओं अस्थि मज्जा में आम माइलॉयड progenitors से अंतर । कई कार्यात्मक और आकृति विज्ञान अलग सबसेट में उनके भेदभाव एक बड़ी साइटोकिंस द्वारा नियंत्रित सीमा तक है और उनके विभिंन संयोजनों4। सबसे अधिक गहन अध्ययन माइलॉयड कोशिका उपसमुच्चय neutrophilic granulocytes, मैक्रोफेज और वृक्ष कोशिकाओं में शामिल हैं । इन आबादियों में से किसी में दोष संभावित जीवन की धमकी परिणामों के लिए नेतृत्व और मानव और चूहों में प्रतिरक्षा प्रणाली के गंभीर रोग के कारण1,2,3,5, 6.

neutrophilic granulocytes के विपरीत, वृक्ष कोशिकाओं और मैक्रोफेज ऊतक निवासी कोशिकाओं और प्रतिरक्षा अंगों में उनकी बहुतायत है अपेक्षाकृत कम है । नतीजतन, इन कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता के प्रयोगों के लिए प्राथमिक वृक्ष कोशिकाओं और मैक्रोफेज के अलगाव और शुद्धि महंगा है और अक्सर असंभव है । इस समस्या को हल करने के लिए, प्रोटोकॉल बड़ी मात्रा में समरूप मैक्रोफेज या वृक्ष कक्षों में इन विट्रोप्राप्त करने के लिए विकसित किया गया है । इन दृष्टिकोण साइटोकिंस की उपस्थिति में murine अस्थि मज्जा कोशिकाओं के भेदभाव पर आधारित हैं: मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक फैक्टर (एम-सीएसएफ) मैक्रोफेज और granulocyte के लिए-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक फैक्टर (जीएम-सीएसएफ) या Flt3 ligand के लिए वृक्ष कोशिकाओं7,8,9,10,11,12. इस विधि द्वारा उत्पन्न कोशिकाओं को सामान्यतः अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMDMs) और अस्थि मज्जा व्युत्पन्न वृक्ष कोशिकाओं (BMDCs) के रूप में साहित्य में वर्णित किया जाता है. वे प्राथमिक मैक्रोफेज या इसी सेल लाइनों के साथ की तुलना में वृक्ष कोशिकाओं के साथ आम में अधिक शारीरिक गुण है । एक अंय प्रमुख लाभ इन कोशिकाओं आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों13फार्म प्राप्त करने की संभावना है । जंगली प्रकार की कोशिकाओं और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से व्युत्पंन कोशिकाओं के बीच तुलनात्मक अध्ययन अक्सर जीन या ब्याज की प्रोटीन के उपंयास कार्यों को उजागर करने के लिए महत्वपूर्ण हैं ।

जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन के उपसेलुलर स्थानीयकरण का विश्लेषण vivo मेंरुचि के प्रोटीन के लिए एक फ्लोरोसेंट लेबल के युग्मन की आवश्यकता है । यह सबसे अधिक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्यूजन व्यक्त करने के द्वारा प्राप्त की है एक विश्लेषण प्रोटीन युग्मित (अक्सर एक लघु लिंक के माध्यम से) एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP))14,15 से बना निर्माण , 16. वृक्ष कोशिकाओं या मैक्रोफेज में फ्लोरोसेंट tagged प्रोटीन की अभिव्यक्ति चुनौतीपूर्ण है. इन कोशिकाओं को आम तौर पर मानक अभिकर्मक प्रक्रियाओं द्वारा transfect मुश्किल है और क्षमता के लिए बहुत कम हो जाते हैं । इसके अलावा, अभिकर्मक क्षणिक है, यह सेलुलर तनाव उत्पंन करता है और प्रतिदीप्ति की तीव्रता हासिल17माइक्रोस्कोप के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है । आदेश में transgene अभिव्यक्ति के एक पर्याप्त स्तर के साथ इन कोशिकाओं का एक उचित अंश प्राप्त करने के लिए, अस्थि मज्जा जनक कोशिकाओं के retroviral वैक्टर और उनके बाद BMDMs या BMDCs में अंतर के साथ संक्रमण एक बहुत ही कुशल बन गया है दृष्टिकोण. यह अपने देशी सेलुलर वातावरण में माइलॉयड मूल के प्रोटीन के विश्लेषण के लिए अनुमति दी है, दोनों एक स्थिर राज्य में या प्रक्रियाओं है कि phagocytosis, प्रतिरक्षा synapse गठन या प्रवास के रूप में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण हैं के दौरान. यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि murine अस्थि मज्जा व्युत्पंन मैक्रोफेज और वृक्ष कोशिकाओं में ब्याज की फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन की स्थिर अभिव्यक्ति की अनुमति देता है का वर्णन ।

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Protocol

सभी विधियां यहां वर्णित आणविक आनुवंशिकी संस्थान के प्रायोगिक पशुओं के कल्याण पर विशेषज्ञ समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है और चेक गणराज्य के विज्ञान अकादमी द्वारा ।

1. रिएजेंट तैयारी

  1. अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम (ले) बफर तैयार करें । ddH2O के KHCO3 से ५०० मिलीलीटर के एनएच4सीएल और ०.५ जी के ४.१४५ ग्राम जोड़ें, तो ०.५ एम ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) और फिल्टर-बंध्याकरण के १०० µ एल जोड़ें ।
  2. polyethylenimine (पी) समाधान तैयार करें । ddH2ओ के ९० मिलीलीटर के लिए बेई के ०.१ ग्राम जोड़ें । सरगर्मी करते समय, २.० से पीएच कम होने तक 1 मीटर एचसीएल dropwise जोड़ें । अप करने के लिए 3 घंटे के लिए हलचल बेई भंग है और फिर 1 मीटर NaOH के साथ ७.२ करने के लिए पीएच समायोजित । ddH2ओ और फिल्टर-बंध्याकरण के साथ १०० मिलीलीटर के लिए मात्रा समायोजित करें । -20 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 मिलीलीटर aliquots और स्टोर करें ।
    नोट: गल जाने के बाद, बेई को 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह तक जमा किया जा सकता है लेकिन फिर से जम नहीं होना चाहिए ।
  3. सेल कल्चर supernatants युक्त एम-सीएसएफ या जीएम-सीएसएफ तैयार करें. इन supernatants अग्रिम में बनाया जा सकता है और में संग्रहित-८० ° c । इन supernatants बनाने के लिए, cytokine-उत्पादक कोशिकाओं (J558 कोशिकाओं के लिए जीएम-सीएसएफ 18 या CMG 14-12 कक्षों के लिए एम-सीएसएफ 19) में एक 10 सेमी पेट्री डिश में Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के लिए संगम । फिर T150 ऊतक संस्कृति कुप्पी और संस्कृति में अतिरिक्त 4 दिनों के लिए 5% CO2/३७ डिग्री सेल्सियस में मीडिया के २०० एमएल के लिए सभी कोशिकाओं को हस्तांतरण । supernatant और फ़िल्टर पर ०.२ µm नसबंदी फ़िल्टर लीजिए । aliquots बनाओ और इन पर स्टोर-८० ° c ।
  4. १०० एमएल सेल संस्कृति माध्यम के तैयार: DMEM 10% गर्मी निष्क्रिय FBS और कोशिका संस्कृति supernatants से जीएम-सीएसएफ स्रावित कोशिकाओं (BMDC भेदभाव के लिए) या एम सीएसएफ (BMDM भेदभाव के लिए) के साथ पूरक ।
    नोट: इन supernatants में साइटोकिंस की मात्रा भिन्न हो सकती है और कार्यशील एकाग्रता में empirically का निर्धारण करना पड़ता है । आमतौर पर, 2 – 3% supernatant सेल लाइनों जीएम-सीएसएफ (अनुशंसित शुरू एकाग्रता से 2%) या 5 – 10% supernatant से CMG 14 – 12 कोशिकाओं का उत्पादन एम-सीएसएफ (अनुशंसित प्रारंभ एकाग्रता 10%) उपयोग किया जाता है । वैकल्पिक रूप से, शुद्ध व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एम-सीएसएफ पर 10 एनजी/एमएल और जीएम-सीएसएफ में 20 एनजी/एमएल cytokine युक्त supernatants के लिए लगभग समान परिणाम के साथ इस्तेमाल किया जा सकता, यानी, भेदभाव की दर पर कोई प्रभाव के बिना, संक्रमण दक्षता और EGFP-tagged construction का उपसेलुलर स्थानीयकरण । एंटीबायोटिक्स, पेनिसिलिन जी (१०० IU/एमएल), streptomycin (१०० µ जी/एमएल), और gentamicin (४० µ जी/एमएल) सहित, प्रोटोकॉल के किसी भी कदम पर सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जब तक अंयथा नहीं कहा गया है ।

2. Retrovirus का उत्पादन

चेतावनी: हालांकि retroviral वैक्टर अपेक्षाकृत सुरक्षित है जब वायरल वैक्टर के अंय प्रकार की तुलना में, वे अभी भी एक संभावित सुरक्षा खतरा पैदा करते हैं । इसलिए, यह अत्यंत देखभाल और उचित सुरक्षात्मक उपकरणों के साथ काम करने के लिए महत्वपूर्ण है, और सभी सुरक्षा नियमों और वायरल कणों के साथ काम करने के लिए कानूनी आवश्यकताओं का पालन करने के लिए ।

  1. प्लेट एक 10 सेमी पेट्री डिश में प्लैटिनम-पारिस्थितिकी (बेनी-E) पैकेजिंग कोशिकाओं के एक सेल निलंबन और 10% FBS जब तक 50-60% धाराप्रवाह (24 एच) से युक्त DMEM के 15 मिलीलीटर में खेती । कोशिकाओं को एक monolayer में विकसित करना चाहिए और संस्कृति में झुरमुट का रूप नहीं होना चाहिए ।
  2. पिपेट 20 µ जी के retroviral का निर्माण (जैसे, pMSCV वेक्टर में ब्याज की फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन व्यक्त) और pCL के 10 µ जी-पारिस्थितिकी पैकेजिंग वेक्टर20 DMEM के 1 मिलीलीटर में (सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) और धीरे मिश्रण ।
  3. एक दूसरी ट्यूब के लिए, DMEM के 1 मिलीलीटर में पी के ७५ µ एल जोड़ें (सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) । कमरे के तापमान पर 5 मिनट की मशीन (आरटी) और फिर दोनों ट्यूबों की सामग्री एक साथ मिश्रण और आरटी में अतिरिक्त 10 मिनट के लिए मशीन ।
    नोट: pCL के अलावा-पारिस्थितिकी वैकल्पिक है । यह ecotropic वायरल रिसेप्टर के लिए कोडिंग है और वायरस titer को बढ़ा सकता है ।
  4. ध्यान से मध्यम बेनी-E कोशिकाओं पर 2% FBS के साथ ताजा DMEMsupplemented के 8 मिलीलीटर के साथ बदलें । उपयोग करने से पहले ३७ ° c करने के लिए मध्यम पूर्व गर्म । अभिकर्मक के दौरान एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग न करें, क्योंकि एंटीबायोटिक अभिकर्मक क्षमता कम हो सकती है ।
  5. ध्यान से जोड़ें (बूंदों में) बेनी-E कोशिकाओं पर कदम २.३ में तैयार मिश्रण, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए मशीन ।
  6. मशीन के बाद, बेनी-ई कोशिकाओं पर मध्यम 10% FBS युक्त पूर्व गर्म DMEM के 10 मिलीलीटर के लिए विनिमय, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए कोशिकाओं की खेती । इस मशीन के दौरान, बेनी-E कोशिकाओं मीडिया में वायरस का उत्पादन होगा ।
  7. 24 घंटे के बाद, एक 5 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर प्लेटिनम पारिस्थितिकी कोशिकाओं से retroviral कणों से युक्त मध्यम इकट्ठा और एक 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब (= "supernatant 1" युक्त ecotropic retroviral कणों) को हस्तांतरण ।
  8. वायरल supernatants में बेनी ई कोशिकाओं द्वारा संक्रमण से बचने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए १२५० × जी में एकत्र वायरस स्पिन । सबसे अच्छा परिणाम के लिए, वायरस तुरंत संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
    नोट: वायरस के Aliquots भी बाद में उपयोग के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । हालांकि, यह transduction दक्षता में कुछ कमी में परिणाम होगा । वायरस के दोहराव ठंड से बचने के लिए, क्योंकि यह वायरस क्षरण की ओर जाता है ।
  9. बेनी-E कोशिकाओं के लिए 10% FBS के साथ पूर्व गर्म DMEM के 10 मिलीलीटर जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक और 24 घंटे के लिए खेती ।
  10. चरण २.७ दोहराएँ । और २.८. "supernatant 2" प्राप्त करने के लिए ।

3. Murine अस्थि मज्जा सेल अलगाव

  1. गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन या अंय अनुमोदित विधि का उपयोग कर माउस बलिदान । ७०% इथेनॉल के साथ माउस स्प्रे ।
  2. चिमटी और कैंची का प्रयोग, त्वचा के साथ ही हिंद पैरों से मांसपेशियों के हिस्से को हटा दें । ध्यान से acetabulum फीमर को तोड़ने के बिना संयुक्त कूल्हे से उखाड़ फेंकना । टखने में पंजा काट संयुक्त । ७०% इथेनॉल के साथ हड्डियों (फीमर टिबिया से जुड़ा) स्प्रे और एक कागज तौलिया का उपयोग कर मांसपेशियों के बाकी हटा दें ।
  3. 2% FBS (पंजाब-FBS) के साथ बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) युक्त एक 5 सेमी पेट्री डिश में हड्डियों प्लेस ।  अगर ज्यादा हड्डियों की तैयारी करें तो प्रोसेस होने तक बर्फ पर पेट्री डिश रखें ।
  4. खेती बांझपन हासिल करने के लिए, एक ऊतक संस्कृति हुड में निंनलिखित चरणों का पालन करें ।
  5. हड्डी समाप्त (घुटने संयुक्त में मोड़ और ध्यान से कैंची के साथ कटौती) के बिना टिबिया से फीमर अलग ।
  6. एक के बाद एक हड्डियों की प्रक्रिया । epiphyses का एक बहुत छोटा सा हिस्सा काट (लगभग 1-2 मिमी) कैंची के साथ, जबकि चिमटी में हड्डी पकड़े ।
  7. एक 30 जी सुई और एक 2 या 5 पंजाबियों-FBS से भरा सिरिंज का प्रयोग करें एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में हड्डी के दोनों सिरों से अस्थि मज्जा कोशिकाओं को फ्लश करने के लिए । सभी कोशिकाओं को हटाने के क्रम में फ्लशिंग के दौरान हड्डी के अंदर सुई ले जाएँ. अगर सुई भरा हो जाता है, इसे बदल जाते हैं ।
    नोट: हड्डियों को फ्लशिंग के दौरान लाल से सफेद रंग में बदल जाना चाहिए । यह इंगित करता है कि अधिकांश कोशिकाओं की हड्डी से हटा दिया गया था । लगभग 2-पंजाब के 3 मिलीलीटर-FBS प्रति हड्डी का उपयोग करें ।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ५०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक ।
  9. supernatant त्यागें और कमरे के तापमान पर 2-3 मिनट के लिए ले बफर के २.५ मिलीलीटर में गोली resuspend द्वारा लाल रक्त कोशिकाओं लाइसे । lysis के दौरान, एक ताजा 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में एक १०० माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से अस्थि मज्जा कोशिकाओं फिल्टर । पंजाब के 12 मिलीलीटर-FBS जोड़कर टॉनिक को बहाल करें ।
    नोट: कक्ष मृत्यु से बचने के लिए पृष्ठ बफ़र के साथ hypotonic lysis के 5 मिनट से अधिक नहीं है ।
  10. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ५०० x g पर तुरंत केंद्रापसारक ।

4. अस्थि मज्जा कोशिका मैक्रोफेज व्युत्पंन में अंतर

  1. DMEM में अस्थि मज्जा कोशिकाओं की गोली resuspend 10% FBS और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक (१.४ कदम के बाद नोट देखें. एंटीबायोटिक एकाग्रता के लिए) और कोशिकाओं की गिनती । बीएम व्युत्पंन मैक्रोफेज में भिंनता के लिए, 5 प्लेट-10 x 106 अस्थि मज्जा कोशिकाओं के एक 10 सेमी गैर ऊतक संस्कृति में इलाज (बैक्टीरियल) पेट्री डिश के साथ पूर्व की 10 मिलीलीटर-तैयार DMEM मीडिया सीरम और एम-सीएसएफ के साथ १.४ कदम से ।
    नोट: अस्थि मज्जा कोशिकाओं की उपज लगभग 4 x 107 प्रति 6-8 सप्ताह पुराने C57BL/6J माउस है ।
  2. 3 दिनों के लिए सेल संस्कृति मशीन में 5% CO2, ३७ ° c में कोशिकाओं की मशीन ।
    नोट: पहले 2 दिनों के दौरान, कोशिकाओं बहुत महत्वपूर्ण नहीं लग रही है, अपोप्तोटिक कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के रूप में मौजूद है (कोशिकाओं माइलॉयड कोशिकाओं और टर्मिनल विभेदित कोशिकाओं में अंतर करने में असमर्थ).
  3. 3 दिनों के बाद, अस्थि मज्जा सेल संस्कृति महत्वपूर्ण और विभाजन कोशिकाओं के समूहों का गठन कर रहे है देखने के लिए शुरू होता है । पहले अनुयाई कोशिकाओं को पहले से ही देखा जा सकता है । इस बिंदु पर, ताजा cytokine मीडिया के साथ कोशिकाओं के पूरक ।
  4. सीरम और एम के साथ पूर्व गर्म DMEM मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें-सीएसएफ (१.४ कदम से) प्रत्येक 10 सेमी पेट्री पकवान में और यह सेल संस्कृति मशीन में वापस । इस कदम के दौरान पुराने मीडिया को हटाने की कोई जरूरत नहीं है ।
    नोट: अस्थि मज्जा मैक्रोफेज पूरी तरह से 5 के बाद विभेदित कर रहे है-संस्कृति में 7 दिन । कटाई के लिए सबसे अच्छा समय 6-8 दिन में है, जहां कोशिकाओं के बहुमत अनुयाई और पेट्री पकवान पूरी तरह से कवर किया जाता है ।
  5. 5 दिन में, सेल संस्कृति डाकू में पेट्री पकवान ले और पकवान इच्छा जब तक मीडिया लगभग पकवान के किनारे तक पहुंच रहा है । ध्यान से धार के पास की सतह से मीडिया के 15 मिलीलीटर बाहर ले, और कोशिकाओं के पकवान के बीच में रहने के लिए करते हैं । एम-सीएसएफ के साथ पूर्व गर्म मीडिया के एक ही मात्रा में जोड़ें और पकवान वापस मशीन में जगह है ।
    नोट: यदि मीडिया धीमे और सावधानीपूर्वक aspirated है, तो लगभग कोई कक्ष खो जाते हैं । हालांकि, यह भी aspirated मीडिया केंद्रापसारक और कोशिकाओं संस्कृति को वापस जोड़ने के लिए संभव है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई गैर अनुयाई (यानी, पूरी तरह से विभेदित) कोशिकाओं खो रहे हैं ।
  6. प्रयोगों के लिए, केवल अनुयाई कोशिकाओं (मैक्रोफेज) का उपयोग किया जाता है । फसल कोशिकाओं के लिए, 6 या 7 दिन पर, सभी मीडिया और फ्लोटिंग कोशिकाओं को हटा दें । बिना सीरम के पूर्व गर्म पंजाबियों के साथ डिश को एक बार धोएं ।
  7. पंजाब में ०.०२% EDTA के 5 मिलीलीटर जोड़ें, और 3 के लिए गर्मी-ऊतक संस्कृति मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट ।
  8. एक 5 मिलीलीटर पिपेट का प्रयोग, पंजाबियों की एक धारा द्वारा पकवान से कोशिकाओं को हटाने-EDTA और उंहें एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में पंजाब के 25 मिलीलीटर के साथ जगह है । यदि आवश्यक हो, पूल और अधिक व्यंजन एक साथ ।
  9. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ५०० x g पर तुरंत केंद्रापसारक ।
  10. DMEM मीडिया में मैक्रोफेज गोली resuspend और कोशिकाओं की गिनती । प्रवाह cytometry द्वारा मैक्रोफेज सतह विभेद मार्करों (CD11b और F4/80) की अभिव्यक्ति की जांच करें ।
  11. कोशिकाओं को निलंबन, जैसे, प्रवाह cytometry प्रयोगों, qPCR या पश्चिमी दाग विश्लेषण में होने की आवश्यकता के प्रयोगों के लिए, मैक्रोफेज सीधे का उपयोग करें । अनुयाई मैक्रोफेज के साथ प्रयोगों के लिए, प्रयोगात्मक सेटअप के अनुसार टिशू कल्चर प्लेट में कोशिकाओं थाली ।
  12. कोशिकाओं को पहले से ही पूरी तरह विभेदित हैं । उंहें इरादा प्रयोग के लिए उपयुक्त मीडिया में रखने के लिए या मूल विकास और एम सीएसएफ के साथ भेदभाव मीडिया में ।
    ध्यान दें: अनुयाई मैक्रोफेज के साथ काम करने के लिए, उंहें एक नई थाली में स्थानांतरण (आदर्श रात भर) का उपयोग करने से पहले सबसे कम 6 घंटे नई सतह के लिए पूर्ण आसंजन के लिए अनुमति देते हैं । प्रयोग से पहले फ्लोटिंग सेल के छोटे अंश को निकाला जा सकता है ।

5. अस्थि मज्जा कोशिका वृक्ष कोशिकाओं में भेदभाव व्युत्पंन

  1. BMDCs के लिए विशिष्ट समायोजन के साथ BMDMs के लिए प्रोटोकॉल का पालन करें चरणों में नीचे वर्णित 5.2 – 5.4 ।
  2. 10% FBS और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ DMEMsupplemented में अस्थि मज्जा कोशिकाओं की प्राप्त गोली resuspend और कोशिकाओं (मैक्रोफेज प्रोटोकॉल के ४.१ कदम का पालन करके) गिनती । वृक्ष कोशिकाओं में भिंनता के लिए, 1 प्लेट-1.5 x 107 अस्थि मज्जा कोशिकाओं में एक 10 सेमी गैर ऊतक संस्कृति उपचार (बैक्टीरियल) पेट्री डिश पूर्व के 10 मिलीलीटर में सीरम और जीएम के साथ DMEM मीडिया तैयार-सीएसएफ (१.४ कदम से.) ।
  3. BMDM प्रोटोकॉल (कदम 4.3 – 4.5. of मैक्रोफेज प्रोटोकॉल) के रूप में एक ही खेती चरणों का पालन करें । एम-सीएसएफ के बजाय सीरम और जीएम-सीएसएफ के साथ DMEM मीडिया का उपयोग करें । BMDCs के लिए के बाद से खेती का समय अब (आमतौर पर 10-12 दिन) है, 3 दिन के अंतराल में 1 – 2 अतिरिक्त भक्षण जोड़ें (supernatant को हटाकर और एक नई खेती मीडिया जोड़ने के रूप में ४.५ कदम में वर्णित है.) ।
  4. प्रोटोकॉल का यह हिस्सा वस्तुतः मैक्रोफेज प्रोटोकॉल के इसी भाग के रूप में एक ही है (कदम 4.6-4.12. मैक्रोफेज प्रोटोकॉल के) । प्रयोगों के लिए केवल अनुयाई कोशिकाओं का उपयोग करें. दिन 10-12 पर, EDTA का उपयोग कर कोशिकाओं को इकट्ठा, गिनती और एक नई सतह पर उन्हें थाली. वृक्ष कोशिकाओं की सतह विभेद मार्करों की अभिव्यक्ति की जाँच करें (CD11c +, CD11b +, F4/80-) प्रवाह cytometry द्वारा.

6. BMDMs और BMDCs व्यक्त EGFP का उत्पादन-ब्याज के प्रोटीन टैग

  1. ३.१० चरण में प्राप्त अस्थि मज्जा कोशिकाओं की गोली resuspend । DMEM में 10% FBS और एंटीबायोटिक दवाओं और गिनती कोशिकाओं के साथ पूरक । संक्रमण के लिए, 2 का उपयोग करें-5 x 106 -अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति का इलाज प्लेट की अच्छी तरह से प्रति बीएम कोशिकाओं के 9 ।
  2. अच्छी तरह से प्रति तैयार DMEM मीडिया के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं प्लेट, BMDMs में भेदभाव के लिए या जीएम-सीएसएफ के साथ BMDCs में अंतर के लिए एम-सीएसएफ के साथ या तो पूरक । 4-6 के लिए कोशिकाओं रखें 5% CO2 के साथ एक ऊतक संस्कृति मशीन में एच ३७ डिग्री सेल्सियस ।
  3. ताजा एकत्र वायरस के 2 मिलीलीटर जोड़ें ("supernatant 1") polybrene के साथ पूरक (12 µ जी/एमएल, अंतिम एकाग्रता 8 µ g/एमएल के साथ कोशिकाओं के अलावा) ।
    नोट: वायरस युक्त supernatant के जमे हुए aliquot भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन प्रभावकारिता कम हो जाएगा.
  4. 30 डिग्री सेल्सियस (धीमी त्वरण और मंदी के साथ) में ९० मिनट के लिए १,२५० x g पर थाली केंद्रापसारक । फिर, 5% CO2 के साथ 4 h के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
  5. वैकल्पिक: नए माध्यम से संबंधित cytokine (एम-सीएसएफ या जीएम-सीएसएफ) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% CO2 के साथ संस्कृति युक्त संस्कृति मीडिया के 2 मिलीलीटर बदलें । दूसरे दिन, संस्कृति मीडिया के 2 मिलीलीटर निकालें और पूरे संक्रमण की प्रक्रिया को दोहराने (कदम 6.3 – 6.4) हौसले से एकत्र वायरस के 2 मिलीलीटर ("supernatant 2") के साथ ।
    नोट: इस चरण में संक्रमण प्रभावकारिता बढ़ सकता है । दूसरा संक्रमण के बाद सुधार सेल प्रकार और लक्ष्य प्रोटीन पर निर्भर है और हमारे अनुभव में दक्षता में 30% वृद्धि से भिन्न हो सकते हैं कोई सुधार करने के लिए बिल्कुल नहीं.
  6. गैर अनुयाई कोशिकाओं को इकट्ठा, एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण, और 5 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए ५०० x g पर स्पिन । supernatant को त्यागें ।
  7. एम सीएसएफ या जीएम-सीएसएफ के साथ संस्कृति मीडिया के 10 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend, एक 10 सेमी गैर ऊतक संस्कृति में पेट्री पकवान और संस्कृति का इलाज ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2में कोशिकाओं जगह । एक 10 सेमी डिश के लिए कोशिकाओं की इष्टतम संख्या 5-10 x 106 बीएम के लिए व्युत्पंन मैक्रोफेज और 10-15 x 106 बी एम के लिए व्युत्पंन वृक्ष सेल है ।
    नोट: छोटे बर्तन या प्लेट इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन सेल नंबर तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए ।
  8. चरण 4 और 5 में वर्णित मैक्रोफेज और वृक्ष कोशिका खेती और विभेदक प्रोटोकॉल का पालन करें ।

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Representative Results

सिग्नलिंग एडेप्टर प्रोटीन किसी भी एंजाइमी गतिविधि के बिना आमतौर पर छोटे प्रोटीन होते हैं । वे विभिंन संपर्क डोमेन या रूपांकनों, जो अंय tyrosine kinases, phosphatases, ubiquitin ligases और21दूसरों सहित संकेत transduction, में शामिल प्रोटीन के लिए बाध्यकारी मध्यस्थता अधिकारी । इस प्रोटोकॉल माइलॉयड सेल एडेप्टर की कार्यक्षमता के प्रदर्शन के लिए PSTPIP2 और OPAL1 का चयन किया गया । PSTPIP2 एक अच्छी तरह से लक्षण भड़काऊ प्रतिक्रिया22के विनियमन में शामिल प्रोटीन है । यह एक cytoplasmic प्रोटीन है जो इसके F-bar डोमेन के जरिए सेलुलर झिल्ली तक भी भर्ती किया जा सकता है । दूसरा प्रोटीन एक transmembrane अनुकूलक OPAL1, सेलुलर झिल्ली के साथ जुड़े होने की उंमीद है । इसका शारीरिक समारोह अभी भी अज्ञात है । हालांकि, तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया में, OPAL1 की अभिव्यक्ति बेहतर पूर्वानुमान23के साथ जुड़ा हुआ है ।

सीडीएनए PSTPIP2 या OPAL1 के लिए कोडिंग का निर्माण एक छोटा लिंकर के माध्यम से जुड़े (GSGGGS या Myc-टैग, क्रमशः) सी में EGFP को टर्मिनस pMSCV क्लोनिंग retroviral के मानक तरीकों का उपयोग सीडीएनए में क्लोन किया गया । इस का निर्माण तो बेनी में transfected-ई कोशिकाओं पैकेजिंग वेक्टर pCL-पारिस्थितिकी के साथ था । परिणामस्वरूप supernatants युक्त retroviruses अस्थि मज्जा कोशिकाओं के transduction के लिए इस्तेमाल किया गया, BMDMs और BMDCs में भेदभाव के बाद । बेनी-E अभिकर्मक की प्रभावकारिता का मूल्यांकन दूसरे वायरस युक्त supernatant के संग्रह के बाद फ्लो cytometry द्वारा किया गया था. मतलब अभिकर्मक दक्षता PSTPIP2-EGFP के लिए ६२% थी और OPAL1 के लिए ५३% थी और परिणाम अत्यधिक reproducible (आंकड़ा 1a, बी) थे । OPAL1 निर्माण बेनी-E कोशिकाओं के लिए और अधिक विषाक्त हो लग रहा था (की उपस्थिति के द्वारा मूल्यांकन) फ़्लोटिंग कोशिकाओं में, जिसके परिणामस्वरूप transfected कोशिकाओं के प्रतिशत में कमी ।

अस्थि मज्जा व्युत्पंन मैक्रोफेज और वृक्ष कोशिकाओं (PSTPIP2 के साथ transduced-EGFP और OPAL1-EGFP retroviral constructs) की भिंनता स्थिति प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन किया गया था । परिपक्व मैक्रोफेज जनसंख्या CD11b और F4/80 अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित किया गया है, जबकि वृक्ष कोशिकाओं CD11c वंश मार्कर व्यक्त करते हैं । संस्कृति के दोनों प्रकार में कोशिकाओं के ९०% से अधिक उनके संबंधित मार्करों (चित्रा 2a, बी) के लिए सकारात्मक थे । अंत में, हम BMDMs BMDCs के एक सरल प्रवाह cytometry माप द्वारा EGFP और प्रतिदीप्ति में PSTPIP2-EGFP और OPAL1-EGFP के निर्माण की अभिव्यक्ति का स्तर निर्धारित किया है । EGFP-positive मैक्रोफेज का अर्थ प्रतिशत PSTPIP2-EGFP के लिए ७१% था और OPAL1-EGFP (चित्रा 3ए) के लिए ६२% । वृक्ष कोशिकाओं के मामले में, दक्षता कम था, PSTPIP2 के लिए ३२% और OPAL1 के लिए 9% (चित्र 3 बी). एकाधिक प्रयोगों के परिणाम इस विधि के reproducibility प्रदर्शित करता है (चित्रा 3सी).

हम आमतौर पर supernatants है कि हम संक्रमण में उपयोग में वायरस एकाग्रता का निर्धारण नहीं करते । हम वायरस supernatants ताजा उपयोग करना पसंद करते हैं, तुरंत संग्रह के बाद, जबकि वायरस titer निर्धारण तीन अतिरिक्त दिनों की आवश्यकता है । नतीजतन, वायरस titer पर जानकारी केवल पूर्व पोस्ट प्राप्त किया जा सकता है । हालांकि, यह अभी भी उपयोगी जब तकनीकी मुद्दों और समस्याओं को संबोधित कर सकते हैं । PSTPIP2-EGFP और OPAL1-EGFP के साथ transfected बेनी ई कोशिकाओं से supernatants में वायरस एकाग्रता का आकलन करने के लिए, हम इन NIH 3T3-E कोशिकाओं से एकत्र धारावाहिक पतला वायरस युक्त supernatants के साथ transfected-बेनी कोशिकाओं की मशीन और निर्धारित वायरस titer बिल्कुल के रूप में Zjablovskaja एट अल द्वारा पहले प्रकाशित जौव अनुच्छेद24में वर्णित है । तीन स्वतंत्र प्रयोगों में वायरस titer से १.१ x 106 से ४.४ x 106 मं. मि./ हम PSTPIP1-EGFP और OPAL1 के बीच किसी भी पर्याप्त अंतर का पालन नहीं किया-EGFP constructs और 1 दिन और 2 दिन से supernatants के बीच । जब इन supernatants प्रोटोकॉल हम इस लेख में वर्णन कर रहे है के अनुसार अस्थि मज्जा सेल संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया गया था, संक्रमण की बहुलता (MOI) १.१ से ४.४ तक की दूरी पर । दिलचस्प है, इस रेंज के भीतर, हम MOI और संक्रमण दक्षता के बीच किसी भी संबंध का पालन नहीं किया ।

चित्रा 4में, PSTPIP2-EGFP और OPAL1-EGFP में व्यक्त BMDMs और BMDCs फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized थे । पूरी तरह से विभेदित मैक्रोफेज और वृक्ष कोशिकाओं एक विशेषता आकार है । अनियमित आकृतियों की बड़ी कोशिकाओं के लिए छोटे गोल जनक कोशिकाओं से आकृति विज्ञान में परिवर्तन सफल विभेद की पुष्टि करता है । मैक्रोफेज में, PSTPIP2 प्लाज्मा झिल्ली में आंशिक स्थानीयकरण के साथ cytoplasmic था । OPAL1 को भी आंशिक रूप से प्लाज्मा झिल्ली को निशाना बनाया दिखाई दिया । बाकी संभावना intracellular झिल्ली, जैसे endoplasmic जालिका और Golgi परिसर के साथ जुड़ा हुआ था । हालांकि, इस स्थानीयकरण की पुष्टि करने के लिए, विशिष्ट organelle मार्करों का उपयोग करना होगा । वृक्ष कोशिकाओं में, झिल्ली स्थानीयकरण कम स्पष्ट था ।

Figure 1
चित्रा 1: बेनी की दक्षता-ई सेल अभिकर्मक । बेनी-E कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए, दो constructs एंकोडिंग एडेप्टर प्रोटीन PSTPIP2 और OPAL1 EGFP (PSTPIP2-EGFP और OPAL1-EGFP) के साथ जुड़े pMSCV वेक्टर में क्लोन किया गया । मानक बेई अभिकर्मक का प्रदर्शन किया गया । दूसरी वायरल supernatant के संग्रह के बाद बेनी-ए कोशिकाओं के प्रवाह cytometry द्वारा अभिकर्मक की प्रभावकारिता का मूल्यांकन किया गया. (क). प्रतिनिधि प्रवाह cytometry प्लाट. (ख). चार स्वतंत्र प्रयोगों के परिणाम दिखा ग्राफ. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: BMDMs (ए) और BMDCs (बी) के विभेदन स्थिति का आकलन । विशिष्ट मैक्रोफेज और वृक्ष कोशिका वंश मार्करों की सतह अभिव्यक्ति की खेती के दिन 8 पर प्रवाह cytometry द्वारा मापा गया था । मृत कोशिकाओं को उनके पक्ष और आगे तितर बितर गुणों और Hoechst ३३२५८ के साथ धुंधला के आधार पर बाहर gated थे । परिणामों के प्रतिनिधि है कम से कम 3 स्वतंत्र प्रयोगों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: PSTPIP2-EGFP और OPAL1-EGFP की अभिव्यक्ति का आकलन । EGFP प्रतिदीप्ति में BMDMs (क) और BMDCs (ख) retrovirally transduced के साथ PSTPIP2-EGFP और OPAL1-EGFP construction खेती के दिन 8 बजे प्रवाह cytometry से मापा जाता था. (ग) . एकाधिक स्वतंत्र प्रयोगों के परिणाम दिखा ग्राफ. BMDMs और BMDCs के रूप में चित्रा 2में gated थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: मैक्रोफेज और वृक्ष कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों PSTPIP2 या OPAL1 व्यक्त. BMDMs (क) और BMDCs (ख) व्यक्त PSTPIP2 और OPAL1 लाइव इमेजिंग फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized थे । हरे रंग में EGFP प्रतिदीप्ति प्रत्येक पैनल के बाईं ओर, सही पर उज्ज्वल क्षेत्र छवि दिखाया गया है । स्केल बार = 10 µm । नतीजे कम से तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

लक्ष्य कोशिकाओं में रुचि के प्रोटीन की अभिव्यक्ति जैविक अध्ययन के कई प्रकार में एक महत्वपूर्ण कदम है । विभेदित मैक्रोफेज और वृक्ष कोशिकाओं को मानक अभिकर्मक और retroviral transduction तकनीकों से transfect करना मुश्किल होता है. अस्थि मज्जा progenitors के retroviral transduction के साथ इन विभेदित कोशिकाओं के अभिकर्मक दरकिनार, भेदभाव के बाद जब वे पहले से ही वांछित निर्माण ले, एक महत्वपूर्ण इन में अस्थानिक cDNAs की अभिव्यक्ति की अनुमति कदम है कक्ष प्रकार । इस विधि के सफल उपयोग का एक उदाहरण हमारे हाल के प्रकाशन25में पाया जा सकता है । यहां, हम अस्थि मज्जा में पसंद के निर्माण की स्थिर अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए एक लागत प्रभावी प्रोटोकॉल प्रदान-वृक्ष कोशिकाओं और मैक्रोफेज इस दृष्टिकोण का उपयोग कर व्युत्पंन । प्रक्रिया हम वर्तमान अपेक्षाकृत सस्ती और सरल है, अभी तक बहुत अच्छा परिणाम देने । इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए रिएजेंट एक अपेक्षाकृत प्रतिबंधात्मक बजट के तहत भी इसकी दिनचर्या उपयोग के लिए अनुमति देते हैं । बेनी ई अभिकर्मक के लिए प्रोटोकॉल एक अभिकर्मक एजेंट के रूप में बेई को रोजगार । अन्य रासायनिक अभिकर्मक एजेंटों की तुलना में, पी एक बहुत ही कम लागत की है, जबकि इसकी क्षमता अन्य व्यापक रूप से इस्तेमाल यौगिकों के बहुमत के समान है । हालांकि, पी इस कदम में कई अलग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मक रिएजेंट के साथ दक्षता के किसी भी हानि के बिना प्रतिस्थापित किया जा सकता है । एक मार्गदर्शक सिद्धांत के रूप में, अभिकर्मक प्रोटोकॉल आमतौर पर इस्तेमाल किया HEK293 कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए जाना जाता है आमतौर पर बेनी-E कोशिकाओं के साथ भी अच्छा प्रदर्शन । एक अंय लागत प्रभावी उपाय cytokine-युक्त supernatants के बजाय शुद्ध रिकॉमबिनेंट साइटोकिंस के उपयोग है । इन supernatants के उपयोग के लिए कुछ अनुकूलन की आवश्यकता है । हालांकि, जब उनकी तैयारी के लिए मानक प्रोटोकॉल स्थापित है और उसके बाद, इन supernatants के व्यक्तिगत बैचों के बीच परिवर्तनशीलता बहुत कम हो जाता है, आमतौर पर व्यक्तिगत बहुत से के बीच काम कर रहे सांद्रता में कोई परिवर्तन की आवश्यकता होती है । इन supernatants के साथ BMDM और BMDC भेदभाव की क्षमता, हमारे अनुभव में, शुद्ध साइटोकिंस के समान हैं ।

retroviral transduction के अलावा, स्तनधारी सेल अभिकर्मक के अन्य अच्छी तरह से स्थापित तरीकों में मौजूद हैं, रासायनिक अभिकर्मक सहित (आमतौर पर cationic लिपिड या cationic पॉलिमर डीएनए के साथ परिसर बनाने का उपयोग), electroporation और का उपयोग वायरल वैक्टर के अंय प्रकार, मुख्य रूप से adenoviral और lentiviral प्रणालियों26,27,28,29,30। हालांकि बहुत उच्च titers और क्षमता एडीनोवायरस आधारित जीन वितरण के साथ प्राप्त किया जा सकता है, इसी plasmids और वायरल कणों की तैयारी और अधिक कठिन और समय लेने वाली है retroviral प्रणालियों29के मामले में की तुलना में । इसके अलावा, एडीनोवायरस वृक्ष कोशिकाओं और मैक्रोफेज29,31,३२ में भड़काऊ प्रतिक्रिया और murine टेम कोशिकाओं माउस दबाव ट्रांसजेनिक में इष्टतम प्रदर्शन के लिए ले जाता है एडीनोवायरस रिसेप्टर३३की आवश्यकता है । दूसरी ओर, lentiviral ब्याज की जीन ले जाने कणों की पीढ़ी के एक अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया है, वस्तुतः retroviruses के लिए उपयोग एक समान । इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया ecotropic retroviral वैक्टर के विपरीत, lentiviruses मानव३४सहित कई प्रजातियों में से गैर proliferating कोशिकाओं को संक्रमित करने में सक्षम हैं । यह विशिष्ट प्रयोगात्मक शर्तों के तहत एक महत्वपूर्ण लाभ हो सकता है । हालांकि, यह सुविधा भी काफी इन वैक्टर की सुरक्षा से समझौता । हमारी राय में, BMDMs और BMDCs के लिए जीन वितरण के लिए, retroviruses दक्षता, सुरक्षा और उपयोग में आसानी का सबसे अच्छा संतुलन प्रदान करते हैं । Retroviral डीएनए construction आसानी से सरल मानक आणविक क्लोनिंग तकनीक का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है । वायरस सेल लाइनों पैकेजिंग द्वारा उत्पादन किया है सीधे संस्कृति supernatant और आगे वायरस शुद्धि आमतौर पर आवश्यक नहीं है । Ecotropic retroviruses भी आसानी से मानव कोशिकाओं को संक्रमित नहीं है, जो उनके उपयोग अपेक्षाकृत सुरक्षित बनाता है । हालांकि, वहां भी कुछ सामांय retroviral वैक्टर के उपयोग के साथ जुड़े नुकसान कर रहे हैं । प्रमुख सीमित कारक यह है कि इन वायरस केवल proliferating कोशिकाओं३५संक्रमित । यह सुविधा काफी यहां वर्णित प्रोटोकॉल को प्रभावित नहीं करता है, लेकिन यह अनुप्रयोगों की सीमा रेंज जहां retroviral वैक्टर इस्तेमाल किया जा सकता है । ब्याज के जीन का आकार है कि इन वैक्टर में क्लोन किया जा सकता है भी सीमित है और वायरल कण titer डालने के आकार में वृद्धि के साथ कम हो जाती है । pMSCV वैक्टर के साथ, हम आम तौर पर लगभग 3 kbp पर डालने के आकार के प्रभाव को देखने लगते हैं । डालने के आकार में आगे बढ़ जाती है के साथ, संक्रमण दक्षता में गिरावट आती है ।

रासायनिक अभिकर्मक और electroporation उपयोग करने के लिए आसान कर रहे हैं, सुरक्षित और कम समय लेने वाली किसी भी वायरस आधारित प्रक्रियाओं की तुलना में26,27,28,30. हालांकि, BMDMs और BMDCs में, वे विदेशी न्यूक्लिक एसिड के लिए प्रतिक्रियाओं को उत्तेजित कर सकते है31 और वे अधिक सेलुलर तनाव उत्पंन करते हैं । इसके अलावा, कुछ रासायनिक अभिकर्मक एजेंट सेल ऑटो प्रतिदीप्ति कि प्रवाह cytometry या माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं वृद्धि हुई है । अभिव्यक्ति की क्षणिक प्रकृति के कारण, वे केवल परिपक्व विभेदित BMDMs या BMDCs के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके विपरीत, retroviral वैक्टर के साथ शुरू की अनुक्रम स्थाई रूप से लक्ष्य कोशिकाओं के जीनोम में एकीकृत कर रहे है और एक स्थिर लंबे समय से स्थाई अभिव्यक्ति के लिए अनुमति भिंनता प्रोटोकॉल३४के टाइम स्केल के साथ संगत, ३५. हालांकि, इस सुविधा से भी सम्मिलनी mutagenesis का खतरा बढ़ जाता है. वेक्टर एकीकरण के अपेक्षाकृत यादृच्छिक प्रकृति के कारण, कोशिकाओं की बड़ी आबादी पर इसके प्रभाव सीमित हैं । हालांकि, वे व्यक्तिगत कक्षों के स्तर पर दृश्यमान हो सकते हैं । अतिरिक्त समस्याएं उत्पंन हो सकती है जब एक निर्माण retroviral वेक्टर से व्यक्त वृक्ष कोशिका या मैक्रोफेज भेदभाव, संक्रमित BMDCs से विभेदित BMDMs या progenitors उत्पंन करने में विफलता के परिणामस्वरूप को प्रभावित करता है । कुछ हद तक, यह संक्रमण की स्थिति को समायोजित करने से दूर हो सकता है कम अभिव्यक्ति स्तर को प्राप्त करने के लिए (जैसे, वायरस titer को कम करने के द्वारा) या एक inducible अभिव्यक्ति प्रणाली के उपयोग के माध्यम से । EGFP का उपयोग ब्याज के प्रोटीन से जुड़े या एक रिपोर्टर के रूप में भी अभिव्यक्ति का प्रयोग लक्ष्यों और सीमाओं के अनुरूप स्तर के साथ कोशिकाओं की छंटाई के लिए अनुमति देता है । अंत में, हम भी सभी अभिकर्मक/transduction प्रक्रियाओं के लिए आम समस्याओं का उल्लेख करना चाहिए । इनमें मुख्य रूप से ऐसे प्रोटीन का खुलासा, स्थानीयकरण और विषाक्तता३६के रूप में व्यक्त कलाकृतियों, शामिल हैं । प्रोटीन विषाक्तता कारण OPAL1 अपेक्षाकृत व्यक्त करने के लिए मुश्किल था हो सकता है । इसका उदाहरण स्पष्ट रूप से दिखाता है कि व्यक्त प्रोटीन की प्रकृति काफी हद तक इस पद्धति की प्रभावशीलता को प्रभावित कर सकती है । हालांकि, इस के बावजूद, हम इस पद्धति के साथ सूक्ष्म विश्लेषण के लिए OPAL1-EGFP एक्सप्रेस कोशिकाओं के पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने में सक्षम थे, अपनी उपयोगिता का प्रदर्शन भी जब मुश्किल लक्ष्य से निपटने । इसके अतिरिक्त, यदि किसी विशेष अनुप्रयोग द्वारा आवश्यक हो तो FACS सॉर्टिंग द्वारा transduced कक्षों के प्रतिशत को बढ़ाना संभव होगा. कम संक्रमण दक्षता भी आंशिक रूप से बढ़ती वायरल कण एकाग्रता विभिन्न तरीकों या तैयार करने के लिए उपयोग किट का उपयोग करके दूर किया जा सकता है । हमारे हाथ में, एक आणविक वजन १०० के बंद काट के साथ केंद्रापसारक फिल्टर पर वायरल supernatant के ultrafiltration केडीए दक्षता और आवश्यक प्रयास के बीच सबसे अच्छा संतुलन प्रदान करने के लिए साबित कर दिया है ।

अस्थि मज्जा व्युत्पंन मैक्रोफेज और वृक्ष कोशिकाओं phagocyte इम्यूनोलॉजी में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया उपकरण हैं । वे उपलब्ध सेल लाइनों से अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक हैं । वे अपेक्षाकृत उच्च संख्या में उत्पंन किया जा सकता है और, एक ही समय में, आनुवंशिक विविधता और सेल लाइनों की अस्थिरता विशेषता की कमी है । एक और लाभ यह है कि वे आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से उत्पंन किया जा सकता है एक अपेक्षाकृत प्रचुर मात्रा में और समरूप सेल जनसंख्या पर आनुवंशिक संशोधन के प्रभाव का अध्ययन । यह जैव रासायनिक अध्ययन में विशेष रूप से उपयोगी है, जहाँ अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में कोशिकाएँ सामान्यतया आवश्यक होती हैं. सीडीएनए के निर्माण के साथ इन कोशिकाओं को transduce करने की क्षमता पुनर्गठन या इन कोशिकाओं और संरचना समारोह विश्लेषण में आनुवंशिक दोषों के पूरक के आधार पर अनुसंधान की अतिरिक्त संभावनाओं को खोलता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम चेक साइंस फाउंडेशन (GACR) (परियोजना संख्या 16-07425S) द्वारा समर्थित किया गया था, चार्ल्स विश्वविद्यालय अनुदान एजेंसी (गाउक) द्वारा (परियोजना संख्या ९२३११६) और आणविक आनुवंशिकी के संस्थान से संस्थागत धन द्वारा, चेक के विज्ञान अकादमी गणराज्य (RVO ६८३७८०५०) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15028
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270 For media suplementation
KHCO3 Lachema, Brno, Czech Republic N/A
NH4Cl Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) A9434
Penicillin BB Pharma AS, Prague, Czech Republic N/A PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA
Streptomycin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) S9137 Streptomycin sulfate salt powder
Gentamicin Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic N/A
Polyethylenimine, linear, MW 25,000 Polyscience, Warrington, PA, USA 23966
Polybrene Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) H9268
EDTA Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) E5134
PBS Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic N/A
APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 BioLegend (San Diego, CA, USA) 101212 flow cytometry analysis
PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 BioLegend (San Diego, CA, USA) 123110 flow cytometry analysis
APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 BioLegend (San Diego, CA, USA) 117310 flow cytometry analysis
M-CSF PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) 315-02
GM-CSF PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) 315-03
Hoechst 33258 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA H1398 flow cytometry analysis use at 1-2 µg/mL

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References

  1. Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
  2. Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).
  3. Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
  4. Kondo, M. Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors. Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).
  5. Andrews, T., Sullivan, K. E. Infections in patients with inherited defects in phagocytic function. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).
  6. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  7. Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
  8. Scheicher, C., et al. Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow. Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).
  9. Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).
  10. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot5080 (2008).
  11. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  12. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  13. Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).
  14. Remington, S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).
  15. Hoffman, R. M. Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).
  16. Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. Flow cytometry of fluorescent proteins. Methods. 57 (3), 318-330 (2012).
  17. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).
  18. Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen. Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).
  19. Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
  20. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  21. Janssen, E., Zhang, W. Adaptor proteins in lymphocyte activation. Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).
  22. Ferguson, P. J., Laxer, R. M. New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice. Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).
  23. Holleman, A., et al. Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols. Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).
  24. Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).
  25. Kralova, J., et al. The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).
  26. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).
  27. Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).
  28. Siegert, I., et al. Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells. Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).
  29. Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  30. Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).
  31. Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
  32. Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).
  33. Tallone, T., et al. A mouse model for adenovirus gene delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).
  34. Milone, M. C., O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. , (2018).
  35. McTaggart, S., Al-Rubeai, M. Retroviral vectors for human gene delivery. Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).
  36. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).

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जीव विज्ञान अंक १४० वृक्ष कोशिकाओं मैक्रोफेज माइलॉयड कोशिकाओं भेदभाव murine अस्थि मज्जा कोशिकाओं साइटोकिंस एम-सीएसएफ जीएम-सीएसएफ वायरल संक्रमण GFP टैग की गईं प्रोटीन
Murine अस्थि मज्जा में फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति-व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं और मैक्रोफेज
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Kralova, J., Glatzova, D., Borna,… More

Kralova, J., Glatzova, D., Borna, S., Brdicka, T. Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages. J. Vis. Exp. (140), e58081, doi:10.3791/58081 (2018).

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